СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОВИРУСНОГО СРЕДСТВА Российский патент 2001 года по МПК A61K35/78 A61K31/28 A61K41/00 A61P31/12 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в технологии получения противовирусных средств широкого спектра действия.

Известен способ получения противовирусного средства, предусматривающий обработку платинида калия этилендиамином (Синтез комплексных соединений металлов платиновой группы. - М.: Наука, 1964, стр. 44).

Известен также способ получения противовирусного средства, предусматривающий синтез цис-дихлордиаминплатины (II) - ДДП - обработкой платинида калия аммониевой солью карбоновой кислоты, в качестве которой используют ацетат аммония, с последующим фильтрованием и кристаллизацией целевого продукта при охлаждении. Синтез ведут в течение 1,5 часа при температуре 100^oC (там же, стр. 28). Синтез исходного материала ДДП длителен, используемый источник аммония дефицитен, при этом синтезируемый продукт токсичен (Биологические аспекты координационной химии, ред. Яцимирский К.Б., Киев: Наукова думка, 1978, стр. 152).

Наиболее близкий к заявляемому способу является способ получения противовирусного средства по заявке N 93037252/14, МКИ A 61 L 31/28, 33/24, который предусматривает обработку платинида калия аммониевой солью карбоновой кислоты, при этом в качестве аммониевой соли используют лигно-гуминовые соли карбоновой кислоты, которые предварительно синтезируют окислением лигнина в щелочной среде с последующим выделением лигно-гуминовых кислот их нейтрализацией аммиаком. Обработку платинида калия аммониевыми солями карбоновых кислот производят в режиме развитой акустической кавитации.

Окисление лигнина в щелочной среде приводит к увеличению молекулярной массы продукта - "лигнокислот" или же "гуминовых веществ", что приводит к увеличению мутности и агрегативной неустойчивости раствора "гуминовых веществ". Поэтому данный способ не обеспечивает получения качественных и стабильных лекарственных препаратов широкого спектра противовирусного действия.

Поставленная задача решается тем, что предложен способ получения противовирусного средства обработкой платинида калия аммониевыми солями лигно-гуминовых кислот под действием ультразвука в режиме развитой акустической кавитации, при этом окислению подвергают медицинский лигнин в щелочной среде при температуре 150-170^oC в течение 0,5-1,5 часа при 2,0-2,5 МПа.

Как известно, под воздействием ультразвука в процессе обработки платинида калия аммониевыми солями лигно-гуминовых кислот происходит агрегирование веществ в растворе. Одновременно происходит увеличение количества химически активных центров.

Благодаря увеличению количества активных центров образуются комплексные высокомолекулярные агрегатные структуры.

Режимы окисления определялись экспериментально и выбирались из соображений получения оптимальных размеров молекул высокомолекулярных соединений.

Окисление медицинского лигнина в щелочной среде целесообразно проводить при температуре 150-170^oC.

При снижении температуры ниже указанной для полного окисления приходится увеличивать время обработки, а при повышении температуры выше указанной происходит распад высокомолекулярных соединений на низкомолекулярные, что ведет к повышению мутности и снижению стабильности раствора.

Давление в реакторе определяет парциальное давление кислорода в обрабатываемом продукте, что влияет на скорость окисления.

Так, при давлении менее 2,0 МПа скорость окисления замедляется, что ведет к необходимости увеличения температуры или времени обработки.

При давлении больше 2,5 МПа интенсивность процесса увеличивается, что, как и при чрезмерном повышении температуры, приводит к разрушению высокомолекулярных соединений и снижению стабильности конечного продукта.

Таким образом, только при выбранных режимах окисления получаются молекулы оптимальных размеров, что обеспечивает получение качественных и стабильных препаратов.

Для подтверждения противовирусной активности полученного в результате использования заявленного способа препарата заявитель предлагает дополнить описание примерами использования указанного препарата для подавления вирусов гриппа и саркомы Рауса.

Таким образом, заявляемый способ отличается от прототипа тем, что в качестве лигно-гуминовых кислот, продуктов щелочного гидролиза лигнина, могут быть использованы окисленные энтеросорбенты на основе лигнина, такие как "Полифепан", "Лигносорб" и т.д.

Окисление медицинского лигнина в указанных условиях технологического процесса обеспечивает получение качественных и стабильных лекарственных препаратов широкого спектра противовирусного действия, что выгодно отличает его от средства по заявке РФ N 93037252.

"Полифепан" - неспецифический энтеросорбент (Рег. N 80/1211/3) представляет собой порошок коричневого цвета без запаха и вкуса, влажностью 65%. состоит в основном из лигнина и содержит не более 20% остаточных полисахаридов (гидроцеллюлозы).

"Лигносорб" (паста полифепана) ВФС 42-2203-93.

Все используемые в качестве исходного сырья вещества разрешены для приема внутрь организма.

Специальные исследования показали, что при окислении медицинского лигнина в условиях предлагаемого способа не происходит образования вредных для организма веществ, таких как полиароматические углеводороды, нитрозоамины и полихлорированные дицикло-п-диоксины.

Исследования противовирусной активности полученного согласно предлагаемому способу средства в отношении вирусов простого герпеса проводили с использованием перевиваемой культуры клеток почки эмбриона обезьяны (МА-104) и первичной культуры клеток куриных фибропластов.

Использовали вирусы простого герпеса 1-го и 2-го серотипов (штаммы "УС" N 571 и "ВН" N 572).

Испытания проводили после предварительной оценки токсичности препарата на указанных культурах клеток. В примерах использовали разведения препарата, составляющие 1/2 его минимальной токсической дозы, и принимали их за рабочую дозу препарата.

Нижеследующие примеры поясняют предлагаемое изобретение.

ПРИМЕР N 1
Исходную водно-щелочную суспензию медицинского лигнина (марки "Полифепан", рег. N 80/1211/3) - неспецифического энтерального copбента окисляли кислородом воздуха.

Состав суспензии
Содержание полифепана - 1 кг
Содержание щелочи (гидроксид натрия) - 100 г
Плотность суспензии - 1:9
Окисление проводили в реакторе с механическим перемешиванием при температуре 160 ± 5^oC при давлении 2,5 MПa в течение 1 часа. Расход воздуха составил 5 л/мин.

Реакционную массу охлаждают до комнатной температуры и от раствора фильтрованием отделяют осадок. Фильтрат подкисляют серной кислотой до pH 2-3. Выпавший осадок отделяют фильтрованием, промывают дистиллированной водой, а затем водно-спиртовой смесью до установления pH 6,0-6,5 и высушивают при 105^oC до постоянной массы. Полученные гуминовые кислоты нейтрализуют 5%-ным водным раствором аммиака из расчета 1 г гуминовых кислот на 80 мл указанного раствора, термостатируют в кипящей водяной бане до удаления избытка аммиака, фильтруют через бумажный фильтр и добавляют 30 об.% дистиллированной воды. В полученный раствор вносят по 0,17-0,27 мас.% платинида калия на 1 г гуминовых кислот и создают процесс развитой акустической кавитации под действием ультразвука с мощностью излучения 40 Вт/см и частотой 22 кГц в течение 1 мин. Далее раствор доводят меткой до 100 мл.

ПРИМЕР 2
Готовили растворы препарата в культуральной жидкости. Для оценки противовирусной активности использовали растворы препарата с рабочей дозой 0,03125 мг/мл. По 0,8 мл приготовленного раствора вносили в пробирки с монослойными культурами клеток и после контакта в течение 1 часа добавляли но 0,2 мл вирусов простого герпеса в десятичных разведениях. Полученную систему инкубировали в термостате при 37^oC при ежедневном визуальном контроле. Регистрацию проводили на 5-6 сутки, когда цитопатическое действие вируса на клетки (ЦПД) достигало максимума. Инфекционную активность вируса оценивали по методу Рида и Менча. Противовирусную активность предлагаемого препарата оценивали по разнице титров вируса, выраженных в lg ТЦД 50/мл, в контрольных и опытных пробирках.

Предлагаемый препарат, взятый, как указано выше в концентрации 0,03125 мг/мл (рабочая доза) подавлял инфекционную активность вируса простого герпеса 2-ю серотипа ("ВН") в условиях эксперимента на 2,5 lg ТЦД
Противовирусная активность предлагаемого средства в отношении вируса простого герпеса 1-го серотипа ("УС") установлена в 10 раз ниже в таких же условиях по сравнению с вирусом 2-го серотипа ("ВН") и составила 100 ТЦД 50 мл.

Противовирусная активность ремантадина в равных условиях в отношении к вирусам герпеса составила 1,0-1,5 lg ТЦД 50/мл при его концентрации в культуральной жидкости равной 0,125 мг/мл (рабочая доза).

Таким образом, противовирусная активность предлагаемого средства с концентрацией в рабочей дозе, равной 0,03125 мг/мл, составляет 500 ТЦД 50/мл в отношении к вирусу простого герпеса 2-го серотипа (штамм "ВН") и 100 ТЦД 50/мл в отношении к вирусу простого герпеса 1-го серотипа (штамм "УС"). Противовирусная активность предлагаемого средства в 10-100 раз выше по сравнению с активностью ремантадина, содержащего в рабочей дозе 0,125 мг/мл препарата.

ПРИМЕР 3
Для тестирования полученного в результате использования заявленного способа препарата последний в объеме 0,2 мл вводили внутримышечно белым мышам за 1-3 суток до заражения их вирусом гриппа типа A (PR-8). Контрольная группа препарата не получала. Результаты приведены в табл. 1
ПРИМЕР 4
14-дневным цыплятам породы "Белый леггорн" яйценосной линии "Хайсенс", высокочувствительных к вирусу саркомы Рауса BH-RSV(RAV-1) серологической подгруппы A, вводили суспензию данного вируса в крыловые перепонки в дозах 100 ОД-50 (левое крыло) и 100 ОД-50 (правое крыло). На 4-6 сутки у цыплят наступают некротические явления.

Для тестирования полученного в результате использования заявленного способа препарата последний в объеме 0,2 мл вводили за 24 и за 48 часов до заражения.

Контрольная группа препарат не получала.

Результаты приведены в табл. 2
Как видно из таблицы, использование препарата обеспечивает защиту от вируса в среднем на 76%.

Изобретение относится к медицине. Проводят обработку платинида калия под действием ультразвука в режиме развитой акустической кавитации аммониевой солью карбоновой кислоты. В качестве этой соли используют гуминовые вещества, выделенные из окисленного медицинского лигнина кислородом воздуха в водно-щелочной среде при температуре 150-170°С и давлении 2,0-2,5 МПа в течение 0,5-1,5 ч. Изобретение позволяет повысить стабильность продукта. 2 табл.

Способ получения противовирусного средства обработкой платинида калия под действием ультразвука в режиме развитой акустической кавитации аммониевой солью лигногуминовых карбоновых кислот, полученных окислением лигнина в щелочной среде, отличающийся тем, что окислению подвергают медицинский лигнин при 150-170°С в течение 0,5-1,5 ч при давлении 2,0-2,5 МПа.