СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2001 года по МПК A61K35/78 A61P3/06 

Изобретение относится к фармации и касается способа получения средства из растительного сырья, обладающего гиполипидемической активностью.

Известны средства, применяющиеся для снижения в крови холестерина и липопротеидов: пармидин, клофибрейт, полиспонин и др. [Соколов С.Я., Замотаев И. П. Справочник по лекарственным растениям (Фитотерапия). 2-е изд. - М.: Медицина, 1988. - 464 с.]. Полиспонин - сухой экстракт из корней диоскореи ниппонской, содержащий стероидные гликозиды. При длительном применении полиспонина могут наблюдаться побочные явления: потеря аппетита, потливость, кожный зуд. Клофибрейт и пармидин - синтетические средства, при применении которых могут возникнуть расстройства пищеварения: тошнота, рвота, поносы, кожная сыпь [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1977, ч. 2].

Целью предлагаемого способа является повышение выхода экстрактивных веществ, удешевление за счет использования широко распространенного лекарственного растительного сырья.

Указанная цель достигается посредством того, что способ включает экстракцию 40-45%-ным раствором этанола высушенной измельченной смеси следующего растительного состава:
1) аир болотный (корневища) - 15 ч.;
2) ромашка аптечная (цветки) - 10 ч.;
3) шиповник (плоды) - 30 ч.;
4) одуванчик лекарственный (корни) - 15 ч.;
5) боярышник кроваво-красный (плоды) - 20 ч.;
6) бадан толстолистный (черные листья) - 5 ч.;
7) горец птичий (трава) - 5 ч.

При этом соотношение растительное сырье:экстрагент составляет 1:(10-12). Экстракцию проводят при температуре 60-90^oC в течение 4 ч, в том числе I экстракция - 2,5 ч; II - 1 ч; III - 0,5 ч. Конечный продукт получают высушиванием концентрированного экстракта в вакуум-сушильном шкафу. Предлагаемый способ получения суммы экстрактивных веществ достаточно прост, не требует трудоемких затрат, позволяет получить продукт постоянного состава.

Выявленные отличительные признаки позволяют сделать вывод о соответствии предлагаемого способа критерию "новизна"
Для доказательства существенности предложенных признаков способа, а именно концентрации экстрагента, соотношения сырье:экстрагент, длительности и кратности процесса экстракции были проведены серии экспериментов, данные которых представлены ниже.

Измельчение сырья проводили согласно требованиям ГФ XI издания. Выбор оптимальных параметров экстракции контролировали по выходу экстрактивных и действующих веществ - флавоноидов, аскорбиновой кислоты.

Для подбора типа экстрагента изучены процессы экстрагирования сырья водой, этиловым спиртом различной концентрации: 20, 40, 45, 50, 60, 70, 96%. Результаты анализа приведены в табл. 1. Установлено, что оптимальный экстрагент - 40-45%-ный этанол, который позволяет извлечь наибольшее количество действующих веществ.

На выход экстрагируемых веществ оказывает влияние соотношение сырье: экстрагент. Были проверены соотношения 1:5; 1:8; 1:12; 1:14; 1:15; 1:20. Результаты анализа представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, оптимальное соотношение 1:(10-12), дальнейшее увеличение объема нецелесообразно, поскольку содержание действующих веществ существенно не повышается.

Изучена зависимость выхода экстрактивных и действующих веществ от температуры экстракции. Настаивание смеси проводили при температуре 20; 40; 60; 90^oC. Результаты анализа приведены в табл. 3.

Наиболее оптимальный температурный режим - 60-90^oC, при котором достигается максимальный выход экстрактивных и действующих веществ.

Изучена зависимость выхода экстрактивных веществ, флавоноидов и аскорбиновой кислоты от степени измельчения сырья. Для проверки взяты образцы сырья, измельченные до размера частиц 0,5; 1; 2; 3; 5 мм. Данные анализа приведены в табл. 4.

Измельчение сырья до размера частиц более 2 мм нежелательно, поскольку получается сырье крупного помола и снижается выход экстрактивных и действующих веществ. Оптимальные степени измельчения сырья - 0,5-2 мм.

Продолжительность настаивания и кратность экстракции определены по следующей методике.

В круглодонную колбу вместимостью 150 мл загружали навеску сырья в количестве 5,0 г (точная навеска), заливали 10-кратным количеством 40%-ного этанола, присоединяли к обратному холодильнику и экстрагировали на водяной бане при температуре 60-90^oC. Через определенный промежуток времени извлечение сливали, анализировали на содержание действующих и экстрактивных веществ (I контакт фаз). Частично истощенный жом заливали 40%-ным этанолом в объеме, равном слитому, настаивали в течение того же времени, что и в первый раз. Извлечение сливали, определяли содержание действующих и экстрактивных веществ (II контакт фаз). Третью экстракцию проводили так же, как и предыдущие. Сливы проводили через 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 ч. Результаты анализов представлены в табл. 5.

Результаты анализов показывают, что равновесное состояние экстракционной смеси достигается при I контакте фаз - через 2,5 ч, при II - через 1 ч, при III - через 0,5 ч. Таким образом, трехкратная экстракция (общая продолжительность экстракции - 4 ч) обеспечивает наиболее полный выход экстрактивных и действующих веществ.

В результате проведенных анализов установлено, что оптимальными условиями экстрагирования растительной смеси являются: экстрагент - 40-45%-ный этиловый спирт, его соотношение к сырью 1:(10-12), степень измельчения сырья - 0,5-2 мм, температура экстракции - 60-90^oC, время первой экстракции - 2,5 ч, II - 1 ч, III - 0,5 ч.

Во всех вышеуказанных экспериментах выход суммы флавоноидов в пересчете на рутин определяли по методике ГФ XI изд., вып. 2, с. 323, выход экстрактивных веществ - по ГФ XI изд., вып. 1, с. 295; выход аскорбиновой кислоты - по фотоколориметрической методике [Приступа Е.А., Попов Д.М. Совершенствование технологии приготовления и контроля качества витаминных чаев // Актуальные проблемы фармацевтической технологии: Научн. труды ВНИИФ, т. XXXII, М., 1994.- C. 151-159].

Определение аскорбиновой кислоты.

Около 5 г (точная навеска) измельченного и просеянного через сито сырья (размер частиц 0,5-2 мм) помещали в колбу на 150 мл, прибавляли 50 мл экстрагента, колбу присоединяли к обратному холодильнику, экстрагировали на водяной бане при 60-90^oC. Через определенный промежуток времени извлечение фильтровали через бумажный фильтр в колбу вместимостью 100 мл. К 5 мл извлечения прибавляли 20 мл 96%-ного этанола, перемешивали и фильтровали через бумажный фильтр. 10 мл полученного фильтрата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки.

В пробирки с притертыми пробками отмеривают в 1-ю - 5 мл испытуемого раствора; во 2-ю - 5 мл раствора аскорбиновой кислоты; в 3-ю - 5 мл воды дистиллированной, прибавляют по 5 мл окрашивающего реактива и ставят в кипящую водяную баню на 10 мин. Затем охлаждают и измеряют оптическую плотность испытуемого и стандартного образцов с помощью фотоэлектроколориметра при длине волны 720 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Содержание кислоты аскорбиновой в % определяют по формуле

где Д - оптическая плотность испытуемого раствора;
Д_о - оптическая плотность раствора аскорбиновой кислоты;
m - навеска сырья;
0,00005 - содержание аскорбиновой кислоты в 1 мл раствора стандартного образца.

Приготовление раствора кислоты аскорбиновой стандартного образца.

0,1000 г (точная навеска) аскорбиновой кислоты растворяют в 90 мл 70%-ного этанола в мерной колбе вместимостью 100 мл и после растворения доводят объем раствора тем же этанолом до метки (раствор A). В день опыта 5 мл раствора A помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

Приготовление окрашивающего реактива.

0,05 г фосфата натрия двузамещенного растворяют в 100 мл воды в мерной колбе вместимостью 200 мл. После растворения прибавляют 10 мл концентрированной серной кислоты. Затем прибавляют 0,8 г аммония молибдата. После растворения доводят объем раствора водой до метки и тщательно перемешивают.

По данным литературы, в химическом составе используемых растений содержатся витамины, каротиноиды, дубильные вещества, флавоноиды (рутин, кверцетин, гиперозид, югланин, авикулярин и др.), тритерпеноиды, сесквитерпеновые лактоны, органические и жирные кислоты, кумарины, соединения кремниевой кислоты, полисахариды, фенолгликозиды и другие биологически активные вещества [Соколов С.Я., Замотаев И.П. Справочник по лекарственным растениям (Фитотерапия). 2-е изд. - М.: Медицина, 1988. - 464 с.; Гаммерман А.Ф., Гром И. И. Дикорастущие лекарственные растения СССР. - М.: Медицина, 1976. - 288 с. ; Евдокимова О. В. , Самылина И.А., Нестерова О.В. Изучение липофильной фракции плодов боярышника. Фармация. - 1992. - N 3. - C. 60-61; Высочина Г. И. Югланин и гиперозид - основные флавоноловые гликозиды горца птичьего // Труды I Всеросс. конф. по ботаническому ресурсоведению. - Санкт-Петербург, 1996. - C. 214. ; Растительные ресурсы СССР: цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Hydrangeaceae-Haloragaceae.- Л.: Наука, 1987. - C. 8-10; Горин А.Г., Яковлев А.И. Полисахариды Matricaria chamomilla // Химия природных соединений. - 1974, N 2, с. 137-141].

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Получение экстракта при температуре экстракции 80 ± 5^oC.

0,5 кг растительной смеси, состоящей из 75 г корневищ аира болотного, 50 г цветков ромашки, 150 г плодов шиповника, 75 г корней одуванчика, 100 г плодов боярышника, 25 г черных листьев бадана, 25 г травы горца птичьего, измельченной до размера частиц с диаметром 1 мм, загружали в экстрактор, заливали 5,2 л 40%-ного этанола (плотность 0,948 г/см³), настаивали при температуре 80±5^oC 2,5 ч при периодическом перемешивании. Затем извлечение сливали, фильтровали под вакуумом. Объем слива - 4,6 л (плотность - 0,9480 г/см³). Шрот заливали снова 4,6 л 40%-ного этанола, смесь нагревали в течение 1,5 ч при температуре 80±5^oC. Второе извлечение сливали, отфильтровывали под вакуумом, объем слива - 4,5 л (плотность - 0,9486 г/см³). Третью экстракцию и фильтрование проводили аналогично предыдущим. Объем третьего слива - 4,5 л (плотность - 0,948 г/см³). Объединенный спиртовой экстракт (13,6 л) упаривают на роторном испарителе для удаления спирта. Объем отгона - 11,9 л 43,6%-ного этанола, объем водного остатка - 1,5 л. Водный остаток сепарировали на бытовом сепараторе для очистки от балластных веществ, растительной пыли. Получили 0,076 кг осадка балластных веществ и 1,5 л водного экстракта, который упарили на водяной бане до сиропообразного состояния, затем высушили в вакуум-сушильном шкафу при температуре 60-70^oC в течение 8 ч. Получили 0,193 кг сухого экстракта, выход - 38,65 от массы исходного сырья. Содержание влаги - 3,46%; содержание флавоноидов - 1,887%.

Гиполипидемическое действие экстракта изучали в соответствии с нормативным документом МЗ РФ [Методические рекомендации. Экспериментальное изучение гиполипидемических и антисклеротических средств. - М., 1988. - С. 5-6] на модели гиперлипидемии, индуцированной однократно тритоном WR-1339 в дозе 225 мг/кг у белых беспородных крыс с исходной массой 220-230 г. Испытуемый экстракт и препарат сравнения - отвар антисклеротического сбора [Соколов С.Я., Замотаев И.П. Справочник по лекарственным растениям (Фитотерапия). 2-е изд. - М.: Медицина, 1988. - 464 с.] вводили внутрижелудочно в течение 7 дней до введения детергента в дозе 300 мг/кг массы животных. Препарат сравнения - отвар антисклеротического сбора, состоящего из цветков боярышника, травы хвоща полевого, омелы белой, листьев барвинка малого - по 15 ч., травы тысячелистника - 30 ч. Животные контрольной группы получали эквиобъемное количество дистиллированной воды по аналогичной схеме. Исследование проводили через 12 ч после введения тритона. Для оценки гиполипидемического действия экстракта определяли в сыворотке крови концентрацию общего холестерина (ОХС), холестерина липопротеидов высокой плотности (ХСЛПВП), триацилглицеридов (ТГ), содержание суммарной фракции липопротеидов низкой плотности и липопротеидов очень низкой плотности (ЛПНП + ЛПОНП) с использованием тест-наборов "Olvex Diagnosticum" и "Lachema Diagnostick". Результаты исследования представлены в табл. 6.

Как следует из табл. 6, под воздействием детергента происходит повышение концентрации ОХС на 34%, ТГ - на 38%, ЛПНП + ЛПОНП - на 27%, снижение ХСЛПВП - на 22%. Введение испытуемого экстракта при тритоновой гиперлипидемии нормализует показатели липидного обмена.

Пример 2. Получение экстракта при температуре экстракции 60 ± 5^oC.

0,5 кг растительной смеси, состоящей из 75 г корневищ аира болотного, 50 г цветков ромашки, 150 г плодов шиповника, 75 г корней одуванчика, 100 г плодов боярышника, 25 г черных листьев бадана, 25 г травы горца птичьего, измельченной до размера частиц с диаметром 0,5 мм, загружали в экстрактор, заливали 5,2 л 43%-ного этанола (плотность 0,943 г/см³), настаивали при температуре 60±5^oC 2,5 ч при периодическом перемешивании. Затем извлечение сливали, фильтровали под вакуумом. Объем слива - 4,6 л (плотность - 0,9440 г/см³). Шрот заливали снова 4,6 л 43%-ного этанола, смесь нагревали в течение 1,5 часов при температуре 60±5^oC. Второе извлечение сливали, отфильтровывали под вакуумом, объем слива - 4,6 л (плотность - 0,944 г/см³). Третью экстракцию и фильтрование проводили аналогично предыдущим. Объем третьего слива - 4,4 л (плотность - 0,944 г/см³). Объединенный спиртовой экстракт (13,6 л) упаривают на роторном испарителе для удаления спирта. Объем отгона - 11,7 л 43,05%-ного этанола, объем водного остатка - 1,56 л. Водный остаток сепарировали на бытовом сепараторе для очистки от балластных веществ, растительной пыли. Получили 0,073 кг осадка балластных веществ и 1,5 л водного экстракта, который упарили на водяной бане до сиропообразного состояния, затем высушили в вакуум-сушильном шкафу при температуре 60-70^oC в течение 8 ч. Получили 0,178 кг сухого экстракта, выход - 35,6% от массы исходного сырья. Содержание влаги - 2,9%; содержание флавоноидов - 1,78%.

Изучено влияние экстракта на липидный обмен при этаноловой гиперлипидемии на белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 200-250 г. Опытной группе животных вводили экстракт в дозе 500 мг/кг 1 раз в сутки до введения этанола в течение 7 дней. Животные контрольной группы по аналогичной схеме получали эквиобъемное количество дистиллированной воды. Препарат сравнения - отвар антисклеротического сбора [Соколов С.Я., Замотаев И.П. Справочник по лекарственным растениям (Фитотерапия). 2-е изд. - М.: Медицина, 1988. - 464 с. ] вводили по аналогичной схеме в дозе 600 мг/кг (в пересчете на сухой остаток). Этанол в дозе 6 г/кг массы животных вводили внутрижелудочно после 24-часового голодания. Исследования липидного состава крови животных проводили через 18 ч после введения этанола. Результаты проведенных экспериментов представлены в табл. 7.

Как видно из табл. 7, гиполипидемический экстракт снижает уровень ОХС на 5%; ТГ - на 24%; липопротеидов - на 27%.

Пример 3. Получение экстракта при температуре экстракции 60 ± 5^oC.

0,5 кг растительной смеси, состоящей из 75 г корневищ аира болотного, 50 г цветков ромашки, 150 г плодов шиповника, 75 г корней одуванчика, 100 г плодов боярышника, 25 г черных листьев бадана, 25 г травы горца птичьего, измельченной до размера частиц с диаметром 2 мм, загружали в экстрактор, заливали 5,2 л 45%-ного этанола (плотность 0,939 г/см³), настаивали при температуре 60±5^oC 2,5 ч при периодическом перемешивании. Затем извлечение сливали, фильтровали под вакуумом. Объем слива - 4,6 л (плотность - 0,940 г/см³). Шрот заливали снова 4,6 л 45%-ного этанола, смесь нагревали в течение 1,5 ч при температуре 60±5^oC. Второе извлечение сливали, отфильтровывали под вакуумом, объем слива - 4,6 л (плотность - 0,940 г/см³). Третью экстракцию и фильтрование проводили аналогично предыдущим. Объем третьего слива - 4,5 л (плотность - 0,940 г/см³). Объединенный спиртовой экстракт (13,7 л) упаривают на роторном испарителе для удаления спирта. Объем отгона - 11,8 л, объем водного остатка - 1,58 л. Водный остаток сепарировали на бытовом сепараторе для очистки от балластных веществ, растительной пыли. Получили 0,074 кг осадка балластных веществ и 1,5 л водного экстракта, который упарили на водяной бане до сиропообразного состояния, затем высушили в вакуум-сушильном шкафу при температуре 60-70^oC в течение 8 ч. Получили 0,20 кг сухого экстракта, выход - 40% от массы исходного сырья. Содержание влаги - 3,95%; содержание флавоноидов - 1,801%.

Изучали спазмолитическое действие экстракта гиполипидемического средства [Гацура В.В. Методы первичного фармакологического исследования биологически активных веществ. - М.: Медицина. - 1974. - 131 с.]. Эксперименты проведены на отрезке тонкой кишки белых беспородных крыс-самцов, помещенном в аэрируемый раствор Тироде (37^oC). Реакцию отрезка тонкой кишки регистрировали на кимографе. Сокращение отрезка вызывали введением в инкубационную среду карбохолина в концентрации 1•10^-6 М, серотонина - 1•10^-4 М. Полученные при этом значения принимали за контрольные данные. Затем после 10-минутного отмывания отрезка тонкой кишки, в инкубационную среду вводили экстракт в дозе 250 мг/кг массы животных и инкубировали 5 мин. После этого в инкубационную среду добавляли серотонин и карбохолин в указанных концентрациях и определяли величину сокращения отрезка тонкой кишки. Результаты исследования представлены в табл. 8.

Приведенные в табл. 8 данные свидетельствуют, что экстракт в дозе 250 мг/кг расслабляет гладкую мускулатуру кишечника при серотониновом спазме на 77%, а при карбохолиновом - на 53%. Это свидетельствует о выраженной спазмолитической активности изучаемого экстракта, что является желательным фактором при симптоматическом лечении сопутствующих заболеваний в пожилом возрасте, таких как спастические колиты, холециститы, дискинезии желчевыводящих путей и т.д.

Острую токсичность экстракта проводили на белых беспородных мышах и белых беспородных крысах с исходной массой 20-22 г и 160-180 г соответственно. Каждую дозу экстракта исследовали на 7 животных. Наблюдения за животными вели в течение 14 дней по требованиям ФК МЗ РФ [Методические рекомендации. Экспериментальное изучение гиполипидемических и антисклеротических средств.- М., 1988. - C. 5-6]. Водный раствор экстракта в разных сериях опытов вводили однократно, внутрижелудочно в интервале доз 1000-7000 мг/кг массы животных. При введении экстракта в максимально возможных объемах и дозах гибели животных и признаков интоксикации у них не наблюдалось в течение всего срока. Экспериментальные данные позволяют отнести изучаемый экстракт гиполипидемического средства к практически нетоксичным веществам согласно действующей классификации K. K. Сидорова [Сидоров К.К. Токсикология новых промышленных веществ. - М., 1973].

Таким образом, испытуемый экстракт обладает выраженным гиполипидемическим действием при экспериментальной тритоновой и этаноловой гиперлипидемии, спазмолитическим действием на гладкую мускулатуру кишечника и относится к классу нетоксичных веществ.

Изобретение относится к фармации. Готовят растительную смесь, содержащую, мас. ч.: аир болотный (корневища) 15, ромашка аптечная (цветки) 10, шиповник (плоды) 30, одуванчик лекарственный (корни) 15, боярышник кроваво-красный (плоды) 20, бадан толстолистый (черные листья) 5, горец птичий (трава) 5. Экстракцию измельченной до размера частиц 0,5-2,0 мм растительной смеси проводят 40-45%-ным этиловым спиртом в соотношении растительное сырье: экстрагент 1:(10-12) при 60-90^oC в течение 4 ч. При этом I экстракция - 2,5 ч, II - 1 ч, III - 0,5 ч. Отфильтрованные спиртовые извлечения упаривают, концентрируют, высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Изобретение позволяет повысить выход и удешевить продукт. 8 табл.

Способ получения средства, обладающего гиполипидемической активностью, путем экстрагирования растительного материала этиловым спиртом, отличающийся тем, что в качестве растительного сырья используют смесь, содержащую, мас. ч. : аир болотный (корневища) 15, ромашка аптечная (цветки) 10, шиповник (плоды) 30, одуванчик лекарственный (корни) 15, боярышник кроваво-красный (плоды) 20, бадан толстолистный (черные листья) 5, горец птичий (трава) 5, измельченных до размера частиц 0,5 - 2,0 мм, экстракцию проводят 40 - 45% этиловым спиртом в соотношении растительное сырье: экстрагент 1 : (10 - 12) при 60 - 90°С в течение 4 ч, в том числе, 1 экстракция - 2,5 ч, II - 1 ч, III - 0,5 ч, отфильтрованные спиртовые извлечения упаривают, концентрируют, высушивают в вакуум-сушильном шкафу.