СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2003 года по МПК A61K35/78 A61P29/00 

Изобретение относится к фармации и касается способа получения средства из растительного сырья, обладающего противовоспалительной активностью.

В настоящее время проводятся многочисленные исследования по изучению, разработке и внедрению в практику лекарственных средств для лечения и профилактики воспалительных заболеваний. Общероссийский рынок медикаментов противовоспалительного действия характеризуется устойчивой тенденцией к количественному и качественному расширению. Но, несмотря на внушительный список противовоспалительных средств, проблема изыскания новых лекарственных препаратов, не оказывающих побочного действия, остается актуальной. Большой интерес в этом направлении представляют лекарственные растения Сибири, как источники получения новых противовоспалительных препаратов.

Листья какалии копьевидной (Cacalia hastata L.) - самое эффективное противовоспалительное средство тибетской медицины при лечении длительно незаживающих ран и язв {Базарон Э.Г., Асеева Т.А. Вайдурья-онбо - трактат индо-тибетской медицины. Новосибирск: Наука, 1984}.

Известны противовоспалительные средства, стимулирующие репаративные процессы: метилурацил, калефлон и др. Метилурацил оказывает противовоспалительное, ранозаживляющее действие, ускоряет процессы клеточной регенерации, стимулирует клеточный и гуморальный факторы иммунитета. Назначают метилурацил при вялозаживающих ранах, ожогах, переломах костей. Препарат противопоказан при острых и хронических формах лейкоза, лимфогранулематозе, злокачественных заболеваниях костного мозга {Машковский М.Д. Лекарственные средства. В 2 т. Т.2. -14-е изд. М., 2000, 608 с.}.

Целью предлагаемого способа является повышение выхода экстрактивных веществ, удешевление за счет использования широкораспространенного местного сырья.

Указанная цель достигается посредством того, что способ включает экстракцию высушенных измельченных листьев какалии копьевидной 50-60%-ным этиловым спиртом или водой (при 100^oС) в соотношении сырье:экстрагент 1:(14-15) в течение 2 ч при температуре 90^oС. При этом I экстракция длится 75 мин, II - 30 мин, III - 15 мин. Конечный продукт получают высушиванием концентрированного экстракта в вакуум-сушильном шкафу. Предлагаемый способ получения суммы экстрактивных веществ достаточно прост, не требует трудоемких затрат, позволяет получить продукт постоянного состава.

Выявленные отличительные признаки позволяют сделать вывод о соответствии предлагаемого способа критерию "новизна". Для доказательства существенности предложенных признаков способа, а именно концентрации экстрагента, степень измельчения сырья, соотношения сырье:экстрагент, длительности и кратности процесса экстракции, были проведены серии экспериментов, данные которых представлены ниже. Выбор оптимальных параметров контролировали по выходу экстрактивных веществ {Государственная фармакопея СССР. XI изд., вып.1, с. 295} . Для определения полноты извлечения гидрофильных и липофильных веществ из листьев какалии копьевидной проведена последовательная исчерпывающая экстракция листьев растворителями разной полярности в аппарате Сокслета. Для этого 80 г сырья поместили в пакетик из фильтровальной бумаги, пакетик поместили в аппарат Сокслета, экстрагировали последовательно хлороформом, этилацетатом, 70%-ным этиловым спиртом, кипящей водой до полного истощения сырья. Получено 5,2 г хлороформной фракции, 0,7 г этилацетатной, 17,8 г спиртовой и 5,25 г водной фракции. Общий выход экстрактивных веществ составил 41,35% в пересчете на абс. сухое сырье.

Для подбора типа экстрагента изучены процессы экстрагирования сырья водой, этиловым спиртом различной концентрации.

Результаты анализа (среднее из трех определений) приведены в табл.1.

Установлено, что оптимальными экстрагентами являются 50-60%-ный этанол и вода (при 100^oС), позволяющие извлечь наибольшее количество экстрактивных веществ.

На выход экстрагируемых веществ оказывает влияние соотношение сырье:экстрагент. Проведены эксперименты по определению оптимального соотношения сырья к экстрагенту. Данные анализа приведены в табл.2.

Результаты анализа показывают (табл.2), что оптимальным является соотношение - 1: (14-15), дальнейшее увеличение нецелесообразно, поскольку при значительном увеличении объема экстрагента содержание экстрактивных веществ существенно не повышается. Изучена зависимость выхода экстрактивных веществ от степени измельчения сырья. Для проверки взяты образцы сырья, измельченные до размера частиц 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 мм. Данные анализа приведены в табл.3.

Измельчение сырья до размера частиц более 2 мм нежелательно из-за снижения выхода экстрактивных веществ. Оптимальные размеры измельченных листьев какалии копьевидной - 0,5-2,0 мм.

Изучена зависимость выхода экстрактивных веществ листьев какалии копьевидной от температуры экстракции. Настаивание смеси проводили при температуре 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100^oС.

Результаты анализа представлены в табл.4. Наиболее оптимальный температурный режим - 90-100^oС, при котором достигается максимальный выход экстрактивных веществ.

Продолжительность настаивания и кратности экстракции определены по следующей методике. В круглодонную колбу вместимостью 150 мл загружали навеску сырья в количестве 5,0 г (точная навеска), заливали 10-кратным количеством 50%-ного этанола, присоединяли к обратному холодильнику и экстрагировали на водяной бане при температуре 90^oС. Через определенный промежуток времени извлечение сливали, анализировали на содержание экстрактивных веществ (I контакт фаз). Частично истощенный жом заливали 50%-ным этанолом в объеме, равном слитому, настаивали в течение того же времени, что и в первый раз. Извлечение сливали, определяли содержание экстрактивных веществ (II контакт фаз). Третью экстракцию проводили так же, как и предыдущие. Сливы проводили через 15, 30, 45, 60, 75, 90 мин.

Результаты анализа приведены в таблице 5.

Результаты анализов показывают, что равновесное состояние экстракционной смеси достигается при I контакте фаз - через 75 мин, при II-м - через 30 мин, при III-м контакте фаз - через 15 мин. Таким образом, трехкратная экстракция (общая продолжительность экстракции - 2 ч) обеспечивает наиболее полный выход экстрактивных веществ.

В результате проведенных анализов установлено, что оптимальными условиями экстрагирования листьев какалии копьевидной являются: экстрагент - 50-60%-ный этанол и вода кипящая, его соотношение к сырью 1:(14-15), степень измельчения сырья - 0,5-2,0 мм, температура экстракции - 90-100^oС, время первой экстракции - 75 мин, второй - 30 мин, третьей - 15 мин.

Способ иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. 0,5 кг листьев какалии копьевидной, измельченных до размера частиц 1,0 мм загружали в экстрактор, заливали 7,0 л 50%-ного этанола в соотношении сырье: экстрагент - 1:14, настаивали при температуре 90^oС при периодическом перемешивании в течение 75 мин. Затем извлечение сливали, фильтровали под вакуумом. Шрот заливали снова 50%-ным этанолом в количестве, равном слитому, смесь нагревали в течение 30 мин при температуре 90^oС. Второе извлечение сливали, отфильтровывали под вакуумом. Третью экстракцию и фильтрование проводили аналогично предыдущим. Объем I извлечения 5,70 л; II извлечения - 5,77 л; III извлечения - 5,30 л. Объединенный спиртовый экстракт (16,77 л) упаривали на роторном испарителе для удаления спирта. Водный остаток (1,8 л) сепарировали на бытовом сепараторе для очистки от балластных веществ, растительной пыли. Получили 0,080 кг осадка балластных веществ и 1,8 л водного экстракта, который упаривали на водяной бане до сиропообразного состояния, затем высушили в вакуум-сушильном шкафу при температуре 60-70^oС в течение 8 ч. Получили 0,228 кг сухого экстракта. Выход 45,6% от массы исходного сырья. Содержание влаги в экстракте - 3,76%.

Изучено влияние экстракта какалии копьевидной (ЭКК) на основные фазы воспалительного процесса: на стадию альтерации, экссудации, пролиферации.

Влияние полученного экстракта какалии на стадию альтерации изучали на белых беспородных крысах обоего пола массой 150-200 г. Модель острого воспаления воспроизводили по методу Менкина {Ойвин И.А., Шетель С.Л. Методика изучения местных нарушений капиллярной проницаемости. // Материалы по патогенезу и патологии белков крови. -Душанбе, 1961, 5, -с.167-173}. ЭКК в дозе 100 мг/кг в одной группе и метилурацил в другой группе животных вводили 1 раз перорально за час до инъекции 9%-ного раствора уксусной кислоты, а затем ежедневно на протяжении 21 дня. Контрольная группа животных получала дистиллированную воду в соответствующем объеме по аналогичной схеме. Влияние на альтеративную фазу исследуемого фитоэкстракта определяли по степени развития некроза и скорости регенерации тканей планиметрическим методом на 7, 14, 21 сутки эксперимента.

Результаты представлены в табл.6.

Данные, приведенные в таблице, показывают, что ЭКК в исследуемой дозе снижает степень повреждения ткани при воздействии флогогенного агента. Так, на 6 сутки площадь некроза на 42,1% меньше, чем в контроле, на 34,7% меньше, чем в случае применения препарата сравнения - метилурацила. На 14-е сутки площадь некроза на 21,2% была меньше по сравнению с контролем, на 32,5 меньше по сравнению с данными при использовании метилурацила. На 21 сутки площадь некроза была меньше на 38%, чем в контроле, на 24,2% меньше, чем в случае использования метилурацила. Кроме этого, исследуемый ЭКК эффективно стимулировал регенерацию, при этом скорость заживления тканей была выше, чем в контроле у крыс в группе сравнения.

Пример 2. 0,5 кг листьев какалии копьевидной, измельченных до размера частиц 0,5 мм загружали в экстрактор, заливали 7,5 л 60%-ного этанола в соотношении сырье:экстрагент - 1:15, настаивали при температуре 90^oС при периодическом перемешивании в течение 75 мин. Затем извлечение сливали, фильтровали под вакуумом. Шрот заливали снова 60%-ным этанолом в количестве, равном слитому, смесь нагревали в течение 30 мин при температуре 90^oС. Второе извлечение сливали, отфильтровывали под вакуумом, третью экстракцию и фильтрование проводили аналогично предыдущим. Объем I извлечения 6,40 л; II извлечения - 6,5 л; III извлечения - 6,20 л. Объединенный спиртовый экстракт (19,1 л) упаривали на роторном испарителе для удаления спирта. Водный остаток (1,5 л) сепарировали на бытовом сепараторе для очистки от балластных веществ, растительной пыли. Получили 0,072 кг осадка балластных веществ и 1,5 л водного экстракта, который упаривали на водяной бане до сиропообразного состояния, затем высушили в вакуум-сушильном шкафу при температуре 60-70^oС в течение 8 ч. Получили 0,240 кг сухого экстракта, выход 48% от массы исходного сырья. Содержание влаги в экстракте - 3,87%.

Влияние полученного ЭКК на стадию экссудации изучали на белых беспородных крысах обоего пола массой 160-180 г. Асептическое воспаление воспроизводили по методу Ю.Е. Стрельникова {Стрельников Ю.Е. Сравнительная характеристика противовоспалительного действия некоторых пиримидиновых производных. // Фармакол. и токсикол. -1960, 6, с.526-531}. За 3 ч до субплантарного введения белым крысам в заднюю лапку вводили 0,1 мл 3%-ного раствора формалина, а затем через 5 и 18 ч после этого животным внутрижеледочно вводили водный раствор фитоэкстракта в дозе 100 мг/кг в объеме 1 мл/100 г. Животным контрольной группы в равном объеме вводили дистиллированную воду. В качестве препарата сравнения использовали метилурацил в дозе 100 мг/кг. Через 24 ч после введения формалина определяли степень развития отека онкометрическим методом и проводили оценку антиэкссудативной активности. Полученные данные приведены в табл.7.

Из приведенных данных следует, что исследуемый экстракт в указанной дозе оказывает выраженное антиэкссудативное действие как по сравнению с контролем, так и по сравнению с метилурацилом.

Пример 3. 0,5 кг листьев какалии копьевидной, измельченных до размера частиц 2,0 мм загружали в экстрактор, заливали 7,0 л воды, нагретой до 100^oС в соотношении сырье:экстрагент - 1:14, настаивали при температуре 100^oС при периодическом перемешивании в течение 75 мин. Затем извлечение сливали, фильтровали под вакуумом. Шрот заливали снова водой, доведенной до кипения, в количестве, равном слитому, смесь нагревали в течение 30 мин при температуре 100^oС. Второе извлечение сливали, отфильтровывали под вакуумом, третью экстракцию и фильтрование проводили аналогично предыдущим. Объем I извлечения - 5,90 л; II извлечения - 5,80 л; III извлечения - 5,80 л. Объединенный спиртовый экстракт (17,5 л) упаривали на роторном испарителе для удаления воды. Сгущенный водный остаток (1,8 л) сепарировали на бытовом сепараторе для очистки от балластных веществ, растительной пыли. Получили 0,085 кг осадка балластных веществ и 1,8 л водного экстракта, который упаривали на водяной бане до сиропообразного состояния, затем высушили в вакуум-сушильном шкафу при температуре 60-70^oС в течение 8 ч. Получили 0,230 кг сухого экстракта, выход 46% от массы исходного сырья. Содержание влаги в экстракте - 3,85%.

Влияние ЭКК на стадию пролиферации изучали по методу Тринус Ф.П. {Тринус Ф. П. , Мохорт Н. А. , Клебанов Б. М. Нестероидные противовоспалительные средства. -Киев: Здоровье, 1975, -239 с.}. Опыты проведены на белых беспородных крысах обоего пола массой 160-180 г, которым подкожно имплантировали в асептических условиях стерильные ватные шарики массой 15 мг. Водный экстракт ЭКК в дозе 100 мг/кг вводили внутрижелудочно крысам 1 раз в сутки в течение 7 дней. Контрольным животным в соответствующем объеме вводили дистиллированную воду. На 8-е сутки с начала эксперимента животных умерщвляли декапитацией. Извлеченные гранулемы взвешивали до сушки и после высушивания при температуре 70^oС в течение 24 ч (до постоянной массы), вычисляли разность в массе гранулем у крыс, получавших ЭКК, дистиллированную воду (контроль). На основании полученных данных оценивали влияние испытуемых средств на пролиферативную стадию воспаления. Данные занесены в табл.8.

Из данных, приведенных в таблице, следует, что экстракт какалии оказывает выраженное пролиферативное действие, стимулируя образование фиброзно-грануляционной ткани.

Острую токсичность ЭКК оценивали по методу Кербера {Требования по доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ. -М., 1984, -49 с.}. Опыты проведены на белых беспородных крысах с исходной массой 140-150 г. Каждую дозу ЭКК испытывали на 6 животных. Наблюдения за животными вели в течение 14 суток. Водный раствор ЭКК в разных сериях опытов вводили однократно, внутрижелудочно в интервале доз 1000-7000 мг/кг массы животных. При введении ЭКК в максимально возможных дозах гибели животных и признаков интоксикации у них не наблюдалось в течение всего срока. Экспериментальные данные позволяют отнести ЭКК к группе относительно безвредных веществ, согласно действующей классификации К.К. Сидорова {Сидоров К.К. Токсикология новых промышленных веществ. -М., 1973. Вып.13, с.47-51}.

Таким образом, испытуемый ЭКК нетоксичен, обладает выраженной противовоспалительной активностью, обусловленной наличием в нем биологически активных веществ.

Изучен качественный и количественный состав биологически активных веществ (БАВ) в листьях и полученном экстракте. С помощью хроматографии на бумаге (БХ), на тонком слое силикагеля (ТСХ) в разных системах растворителей и в присутствии достоверных образцов обнаружено наличие отдельных соединений в листьях:
- олеаноловая кислота, R_f=0,5 (ТСХ, бензол-ацетон, 8:2);
- феруловая кислота, R_f=0,85 (БХ, 20%-ный раствор КСl);
- кофейная кислота, R_f=0,36 (БХ, 20%-ный раствор КСl);
- кверцетин, R_f=0,05/0,7 (БХ, 15%-ная уксусная кислота/бутанол-уксусная кислота - вода, 4:1:2);
- умбеллиферон, R_f=0,45 (БХ, хлороформ);
органические кислоты:
- яблочная кислота R_f=0,60 (БХ, бутанол-муравьиная кислота - вода, 18:2: 9-I);
- янтарная кислота, R_f=0,80 (БХ, I);
- лимонная кислота, R_f=0,58 (БХ, I);
- аскорбиновая кислота, R_f=0,39 (БХ, I).

Количественное определение БАВ в листьях и полученном экстракте какалии копьевидной проведено по описанным в литературе методикам. Содержание флавоноидов, дубильных веществ и органических кислот определено по методике ГФ XI изд. {Государственная фармакопея СССР XI изд. Вып. 1, 2. ст.57, ст.36}, содержание аскорбиновой кислоты - фотоколориметрическим методом {Приступа Е. А. , Попов Д. М. Совершенствование технологии приготовления и контроля качества витаминных чаев. //Актуальные проблемы фармацевтической технологии: Науч. труды ВНИИФ, т. XXXII. М., 1994, -с.151-159}, содержание каротиноидов - спектрофотометрическим методом {Евдокимова О.И., Самылина И.А., Нестерова О. В. Определение содержания суммы фосфолипидов и каротиноидов в плодах некоторых видов боярышника (Crataegus L.). // Фармация, 1992, 6, с.70}. Данные количественного анализа БАВ в листьях и полученном экстракте приведены в табл.9.

Таким образом, получен экстракт из листьев какалии копьевидной, относящийся к классу нетоксичных веществ, содержащий биологически активные вещества, которые обусловливают его выраженную противовоспалительную активность.

Изобретение относится к фармации. Листья какалии копьевидной измельчают до размера частиц 0,5-2,0 мм. Экстрагируют 50-60%-ным этанолом при 90^oС или водой горячей при 100^oС, при соотношении сырье:экстрагент 1:(14-15) в течение 2 ч. При этом I экстракция - 75 мин, II - 30 мин, III - 15 мин. Отфильтрованные спиртовые извлечения упаривают, сепарируют, высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Изобретение позволяет повысить выход продукта. 9 табл.

Способ получения средства, обладающего противовоспалительной активностью, путем экстрагирования растительного материала, отличающийся тем, что в качестве растительного сырья используют листья какалии копьевидной, измельченные до размера частиц 0,5-2,0 мм, экстракцию проводят 50-60%-ным этанолом при 90^oС, или горячей водой при 100^oС при соотношении сырье:экстрагент 1: (14-15) в течение 2 ч, в том числе, I экстракция - 75 мин, II - 30 мин, III - 15 мин, отфильтрованные спиртовые извлечения упаривают, концентрируют. высушивают в вакуум-сушильном шкафу.