КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ УХОДА ЗА КОЖЕЙ, СПОСОБ УХОДА ЗА НЕЙ, СПОСОБ ИМИТАЦИИ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА КОЖУ РЕТИНОЕВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2001 года по МПК A61K7/48 A61P17/00 

Область, к которой относится изобретение
Настоящая заявка относится к композициям для ухода за кожей, содержащим амид и ретинол или ретиниловый сложным эфир, а также к косметическим способам, предусматривающим нанесение таких композиций на кожу.

Предпосылки создания изобретения
Ретинол (витамин А) представляет собой эндогенное соединение, которое а естественных условиях присутствует в организме человека, и имеет важное значение для нормальной дифференцировки эпителиальных клеток. Природные и синтетические производные витамина A широко применяются для лечения ряда кожных заболеваний, а также используются в качестве средств для восстановления биологических функций кожи или для обновления клеток кожи. Ретиноевая кислота используется для лечения ряда состояний кожи, например акне (угри), морщины, псориаз, старческие пятна и депигментация (обесцвечивание). См., например, Vahiquist, A. et al. , J. Invest. Dermatol., Vol. 94, Holland D.B. & Cunliffe, W. J. (1990), pp. 496-498; Ellis,C.N. et al., "Pharmacology of Retinols in Skin", Vasel, Karger, Vol. 3 (1939), pp. 249-252; Lowe, N.J. et al, "Pharmacology or Retinols in Skin", Vol. 3 (1989), pp. 240-248; Публикация PCT заявки N WO 93/19743.

Очевидно, что использование ретинола или ретиниловых сложных эфиров предпочтительней, чем использование ретиноевой кислоты. Ретинол является эндогенным соединением. Сложные эфиры ретинола гидролизуются in vivo с продуцированием ретинола. Ретинол и ретиниловые сложные эфиры считаются более безопасными, чем ретиноевая кислота. К сожалению, благоприятное действие на кожу ретинола и ретиниловых сложных эфиров менее эффективно, чем действие ретиноевой кислоты. Настоящее изобретение отчасти основано на обнаружении того факта, что комбинация ретинола или ретиниловых сложных эфиров с амидами жирных гидроксикислот приводит к синергическому ингибированию дифференцировки кератиноцитов. Действие амидов жирных гидроксикислот в комбинации с ретинолом или ретиниловым сложным эфиром аналогично действию ретиноевой кислоты. Таким образом, использование смеси амида жирной гидроксикислоты с ретинолом или с ретиниловыми сложными эфирами, которая имитирует действие ретиноевой кислоты, все же легче и безопаснее в использовании, чем ретиноевая кислота.

В патенте США N 5057501 (Thornfeldt) описывается способ лечения папулезно-чешуйчатых и экземных заболеваний кожи с использованием композиции, содержащей сесквитерпеновое соединение, и от около 0,025% до около 35% монокарбоновой жирной кислоты, сложного эфира или амида. Эти композиции могут также содержать ретиноид; причем Thornfeldt сообщает, что некоторые ретиноиды, а именно изотретиноин, третиноин, этретин (все они представляют собой стереоформы ретиноевой кислоты) и этретинат (сложный эфир триметоксифенилретиноевой кислоты) обладают эффективным действием против папулезно-чешуйчатых заболеваний. В публикации PCT заявки WO/9325177 (Proctor & Gamble) описаны композиции для местного нанесения на кожу, которые содержат конкретный тип ациклического карбоксамидного хладагента и могут содержать ретиноиды, такие как ретиноевая кислота и ее производные (например, цис- и транс-). В публикации PCT заявки WO/9403156 (Rhone Poulenc) описаны композиции для местного применения, содержащие линолевую кислоту или ее производное в качестве активного ингредиента, для лечения и профилактики нечистой кожи (например, кожи, подверженной образованию прыщей, пустул или угрей); причем, эта композиция может также содержать 0,025-0,1 мас.% третиноина. В заявке на Европейский; патент N 0388275 (Pierre Fabre Cosmetique) описаны композиции для лечения себореи, содержащие алкилкарбоксамид и цинковую соль, которой может быть ретиноат цинка.

Klaus et al. (патент США N 5216148) описывают использование специфических комплексных карбоксамидов для лечения и предупреждения образования опухолей, дерматоза и старения кожи. Van Scott et al. (патент США N 4380549) и Yu et al. (патент США N 4363815) описывают лечение угрей, сухой, шершавой, чешуйчатой кожи с использованием гидроксикислоты или ее амида. В EP 0582458 описано использование N, N-(1,4C-алкил)лаурамида. В EP 0559304 описано использование в качестве смягчающего кожу агента амида, содержащего гидрокарбильную цепь, состоящую по крайней мере из 25 атомов углерода. Beauquey et al. (патент США N 5308551) описывают моющую и кондиционирующую композицию для кожи, содержащую, среди прочих ингредиентов, 1-4C-алканоламид 8-16C-жирной кислоты. В описании патента Великобритании N 1126289 (Hoffman-La Roche) описывается концентрированный витаминный препарат, содержащий спиртовой витамин A или сложный эфир витамина A, эмульгатор и растворитель, который выбирают из спирта или диалкиламида монокарбоновой кислоты (например, N, N-диэтилацетамида, N,N-диметилацетамида или N,N-диметилформамида). Этот витаминный препарат имеет очень высокое содержание витамина, то есть его минимальная концентрация составляет 250000 ME витамина А/мл. Кроме того, среди амидов, описанных в заявке '289, не содержится или не упоминается мелинамид.

В ранее поданной заявке на Европейский патент EP 0742005 (Unilever; дата приоритета 8 мая 1995), опубликованной 13 ноября 1996 (по дате приоритета настоящей заявки), описаны комбинации амидов жирных кислот с ретинолом или ретиниловыми сложными эфирами. Однако в EP '005 не указаны амиды жирных гидроксикислот.

В работах, цитированных выше, не описаны композиции для ухода за кожей, основанные на синергических комбинациях амидов жирных гидроксикислот с ретинолом или ретиниловым сложным эфиром. Ни в одной из цитированных выше работ не указано на необходимость использования эффективных соединений, которые могли бы служить в качестве альтернативы ретиноевой кислоте.

Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится отчасти к композиции для ухода за кожей, содержащей
(a) от 0,001% до 10% ретиноида, выбранного из группы, состоящей из ретинола и ретинилового сложного эфира;
b) от 0,0001% до 50% амида жирной гидроксикислоты; и
c) косметически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение также относится к косметическому способу ухода за кожей, предусматривающему местное нанесение данной композиции на кожу. Кроме того, настоящее изобретение относится к косметическому способу имитации действия ретиноевой кислоты на кожу, предусматривающему местное нанесение данной композиции на кожу.

Термин "уход за кожей (кондиционирование)", используемый в настоящем описании, означает предупреждение и лечение одного или нескольких из следующих состояний кожи: сухость кожи, повреждение кожи под действием солнечного излучения, морщины, старческие пятна, увядание кожи, акне, псориаз, атопический дерматоз. Эти композиции могут быть также использованы для отбеливания кожи, и/или регуляции экскреции кожного сала, и/или повышения эластичности рогового слоя, а в основном, для повышения качества кожи. Эта композиция может быть использована для улучшения десквамации кожи и клеточной пролиферации.

Присутствие амида жирных оксикислот в продукте настоящего изобретения значительно повышает эффективность ретинола или ретинилового сложного эфира, то есть амид жирных гидроксикислот, в основном, повышает способность ретинола или ретинилового сложного эфира к воздействию на пролиферацию клеток. Амид жирных гидроксикислот, используемый отдельно, не оказывает значительного улучшающего действия на кожу или оказывает незначительное улучшающее действие; и существенное благоприятное воздействие на кожу может быть достигнуто только, если амид жирных гидроксикислот объединить с ретинолом или ретиниловым сложным эфиром.

Короче говоря, настоящее изобретение, по крайней мере отчасти, основано на факте обнаружения синергического взаимодействия между ретинолом или ретиниловым сложным эфиром и амидом жирной гидроксикислоты.

В соответствии с настоящим изобретением, эффективность указанных композиций значительно повышается благодаря включению эффективного количества амида жирной гидроксикислоты в композиции, содержащие ретинол или ретиниловый сложный эфир. Альтернативно, в композицию, содержащую амид жирной гидроксикислоты, могут быть включены более низкие уровни ретинола или ретинилового сложного эфира для получения композиции с эффективностью, равной эффективности аналогичной композиции, не содержащей амида.

Описание предпочтительного варианта осуществления изобретения
Композиции настоящего изобретения содержат в качестве первого главного ингредиента соединение, выбранное из группы, состоящей из ретинола, ретиниловых сложных эфиров и их смесей.

Термин "ретинол" включает, среди прочих, следующие изомеры ретинола: полностью-транс-ретинол, 13-цис-ретинол, 11-цис-ретинол, 9-цис-ретинол, 3,4-дидегидро-ретинол. Из них предпочтительными изомерами являются полностью-транс-ретинол, 13- цис-ретинол, 3,4-дидегидро-ретинол, 9-цис-ретинол. Наиболее предпочтительным является полностью-транс-ретинол, благодаря его широкой коммерческой доступности.

Ретиниловый сложный эфир представляет собой сложный эфир ретинола. Термин "ретинол" был определен выше. Ретиниловыми сложными эфирами, подходящими для использования в настоящем изобретении, являются C₁-C₃₀-сложные эфиры ретинола, предпочтительно, C₂-C₂₀-сложные эфиры, а более предпочтительно C₂, C₃ и C₁₆-сложные эфиры, поскольку они являются наиболее коммерчески доступными. Примерами ретиниловых сложных эфиров являются, но не ограничиваются ими, ретинилпальмитат, ретинилформиат, ретинилацетат, ретинилпропионат, ретинилбутират, ретинилвалерат, ретинилизовалерат, ретинил-гексаноат, ретинилгептаноат, ретинилоктаноат, ретинилнонаноат, ретинилдеканоат, ретинилундекандат, ретиниллаурат, ретинилтридеканоат, ретинилмиристат, ретинилпентадеканоат, ретинилгептадеканоат, ретинилстеарат, ретинилизостеарат, ретинилнонадеканоат, ретиниларахидонат, ретинилбегенат, ретиниллинолеат, ретинилолеат, ретиниллактат, ретинилгликолят, ретинилгидроксикаприлат, ретинилгидроксилаурат, ретинилтартрат.

Предпочтительный сложный эфир для использования в настоящем изобретении выбирают из ретинилпальмитата, ретинилацетата и ретинилпропионата, поскольку эти сложные эфиры являются наиболее коммерчески доступными, а поэтому они являются наименее дорогостоящими. Ретиниллинолеат также является предпочтительным благодаря своей эффективности.

Ретиноид используется в композиции настоящего изобретения в количестве от 0,001% до 10%, предпочтительно в количестве от 0,01% до 1%, а более предпочтительно в количестве от 0,01% до 0,5%.

Вторым главным ингредиентом композиций настоящего изобретения является амид жирной гидроксикислоты. Амид жирной гидроксикислоты имеет следующую структуру:

где каждый из R₁, R₂ и R₄ независимо выбирают из водорода и алифатических насыщенных или ненасыщенных, прямых или разветвленных углеводородных цепей, которые могут быть гидроксилированы и которые содержат от 1 до 20 атомов углерода;
R₃ представляет собой -(CH₂)_n где n обозначает целое число от 0 до 18;
Предпочтительно, чтобы каждый из R₁, R₂, R₄ независимо содержал от 2 до 20 атомов углерода, более предпочтительно от 2 до 15 атомов углерода, а наиболее предпочтительно от 3 до 13 атомов углерода.

Амидом гидроксикислоты является предпочтительно амид α или β-гидроксикислоты, то есть n=0 или 1.

Наиболее предпочтительными амидами жирных гидроксикислот, которые могут быть включены в композиции настоящего изобретения, являются лактамид-моноэтаноламид, амид C₁₃-β-гидроксикислоты (2-гидрокси-C₁₃-амид), N-гидроксиэтил-2-гидрокси-C₁₆-амид, 12-гидрокси-N- (2-гидроксиэтил)октадеканамид и моноэтаноламид касторового масла.

Амид содержится в композициях настоящего изобретения в количестве, составляющем от 0,0001% до 50%, предпочтительно, от 0,01% до 10%, а наиболее предпочтительно от 0,1% до 5%.

Косметически приемлемый носитель
Композиция настоящего изобретения также включает косметически приемлемый носитель, который действует как разбавитель, диспергирующий агент, или носитель для ретинола или ретинилового сложного эфира и амида жирной гидроксикислоты в данной композиции, таким образом, что он облегчает их распределение при нанесении композиции на кожу.

Безводными носителями или носителями, используемыми в добавление к воде, могут быть жидкие или твердые смягчающие вещества, растворители, влагоудерживающие агенты, загустители и порошки. Особенно предпочтительным безводным носителем является полидиметилсилоксан и/или полидиметилфенилсилоксан. Силиконами настоящего изобретения могут быть силиконы с вязкостями, составляющими примерно от 10 до 10.000.000 мм²/с (сантистокс) при 25^oC. Особенно предпочтительными являются смеси силиконов низкой и высокой вязкости. Эти силиконы изготавливаются компанией Дженерал Электрик (General Electric Company) под товарными знаками Vicasil, SE и SF и компанией Dow Corning под серийными марками 200 и 550. Количество силикона, которое может быть использовано в композициях настоящего изобретения "варьируется примерно в пределах от 5% до 95%, а предпочтительно от 25% до 90% по массе композиции.

Косметически приемлемый носитель обычно составляет от 5% до 99,9%, предпочтительно от 25% до 80% по массе композиции, и может быть использован в отсутствии других косметических добавок, то есть может составлять всю остальную часть композиции (помимо активных ингредиентов). Предпочтительно, чтобы носитель содержал по крайней мере 50%, а более предпочтительно по крайней мере 80% воды по массе носителя. При этом предпочтительно чтобы вода составляла по крайней мере 50%, а наиболее предпочтительно по крайней мере от 60 до 80% по массе композиции настоящего изобретения.

Необязательные материалы для ухода за кожей и косметические добавки
Масло или маслообразный материал могут присутствовать в композиции вместе с эмульгатором для образования эмульсии типа "вода в масле" или "масло в воде", главным образом, в зависимости от гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) используемого эмульгатора.

Композиции настоящего изобретения содержат предпочтительно солнцезащитные вещества. Солнцезащитные вещества включают соединения, которые обычно используются для защиты от воздействия ультрафиолетового излучения. Характерными соединениями являются производные РАВА, циннамат и салицилат. Так, например, могут быть использованы октилметоксициннамат и 2-гидрокси-4-метоксибензофенон (известный также как оксибензон). Октилметоксициннамат и 2-гидрокси-4-метоксибензофенон являются коммерчески доступными соединениями, выпускаемыми под товарными знаками Parsol МСХ и Бензофенон-3, соответственно. Точное количество солнцезащитного вещества, используемого в эмульсиях, может варьироваться в зависимости от степени нужной защиты от солнечного УФ-излучения.

Другие предпочтительные, но необязательные ингредиенты выбирают из незаменимых жирных кислот (НЖК), то есть, тех жирных кислот, которые имеют важное значение для образования плазматической мембраны всех клеток; так, например, в кератиноцитах недостаток НЖК приводит к гиперпролиферации этих клеток. Добавление в эти клетки НЖК позволяет корректировать это явление. Кроме того, НЖК усиливают липидный биосинтез эпидермиса и обеспечивают наличие липидов для формирования структур, выполняющих барьерную роль эпидермиса. Незаменимые жирные кислоты выбирают, предпочтительно, из линолевои кислоты, γ-линоленовои кислоты, гомо-γ-линоленовой кислоты, колумбиновой кислоты, эйкоза-(н-6,9,13)-триеновой кислоты, арахидоновой кислоты, тимнодоновой кислоты, гексаеновой кислоты, и их смесей.

Другой предпочтительный необязательный ингредиент выбирают из азолов, например климбазола, бифоназола, клотримазола, кетоконазола, миконазола, эконазола, итраконазола, флукбназола, терконазола, бутоконазола, сульконазола, лионазола и их смесей. Азол может присутствовать в композициях настоящего изобретения в количестве от 0,001 до 50 мас.%, предпочтительно от 0,001 до 10 мас.%, а более предпочтительно от 0,1 до 5%.

В косметические композиции настоящего изобретения часто вводят смягчающие агенты. Уровни таких смягчающих агентов могут составлять в пределах от 0,5 до 50%, а предпочтительно от 5% до 30% по массе всей композиции. Смягчающие агенты могут быть классифицированы по таким общим химическим категориям, как сложные эфиры, жирные кислоты и спирты, полиолы и углеводороды.

Сложными эфирами могут быть сложные моно- или диэфиры. Подходящими примерами сложных диэфиров жирных кислот являются дибутиладипат, диэтилсебакат, диизопропилдимерат и диоктилсукцинат. Подходящими сложными эфирами жирных кислот с разветвленной цепью являются 2-этил-гексилмиристат, изопропилстеарат и изостеарилпальмитат. Подходящими сложными эфирами трехосновных кислот являются триизопропилтрилинолеат и трилаурилцитрат. Подходящими сложными эфирами жирных кислот с прямой цепью являются лаурилпальмитат, миристиллактат, олеилэуркат и стеарилолеат. Предпочтительными сложными эфирами являются коко-каприлат/капрат (смесь коко-каприлата и коко-капрата), ацетат миристилового эфира пропиленгликоля, диизопропиладипат и цетилоктаноат.

Подходящими жирными спиртами и кислотами являются соединения, имеющие от 10 до 20 атомов углерода. Особенно предпочтительными являются такие соединения, как цетиловые, миристиловые, пальмитиловые и стеариловые спирты и кислоты.

Полиолами, которые могут служить в качестве смягчающих агентов, являются линейные и разветвленные алкилполигидроксильные соединения. Так, например, предпочтительными являются пропиленгликоль, сорбит и глицерин. Могут быть также использованы полимерные полиолы, такие как полипропиленгликоль и полиэтиленгликоль. Бутилен- и пропиленгликоль являются также особенно предпочтительными в качестве интенсификаторов впитываемости.

Примерами углеводородов, которые могут служить в качестве смягчающих агентов, являются углеводородные цепи, имеющие примерно от 12 до 30 атомов углерода. Конкретными примерами таких соединений являются минеральное масло, вазелин, сквален и изопарафины.

Еще одной категорией функциональных ингредиентов косметических композиций настоящего изобретения являются загустители. Загуститель обычно присутствует в количествах примерно от 0,1 до 20%, а предпочтительно от 0,5 до 10% по массе композиции. Примерами таких загустителей являются структурированные полиакрилатные материалы, поставляемые компанией B.F. Goodrich Company под товарным знаком Carbopol. Используемыми смолами могут быть такие смолы, как ксантановая камедь, каррагеновая камедь, желатин, камедь карайи, пектиновая смола, и смола робинии. При определенных условиях функция загущения может быть осуществлена с использованием материала, который служит также в качестве силикона или смягчающего агента. Так, например, силиконовые смолы с вязкостью, превышающей 10 сантистоксов, и сложные эфиры, такие как стеарат глицерина, имеют двойную функцию.

В композицию настоящего изобретения могут быть введены порошки. Такими порошками являются мел, тальк, каолин, крахмал, смектитовые глины, химически модифицированный алюмосиликат магния, органически модифицированная монтмориллонитная глина, гидратированный силикат алюминия, тонкодисперсный диоксид кремния, алюмооктенилсукцинат крахмала и их смеси.

В косметические композиции настоящего изобретения могут быть также включены и другие вспомогательные компоненты-добавки. Такими вспомогательными ингредиентами могут быть красители, замутнители и отдушки. Количества этих вспомогательных компонентов-добавок могут составлять примерно в пределах от 0,001% и вплоть до 20% по массе композиции.

Использование композиции
Композиция настоящего изобретения используется, главным образом, в качестве продукта, предназначенного для местного нанесения на кожу человека, а особенно в качестве кондиционирующего и смягчающего кожу агента, а также для предупреждения или уменьшения образования морщин на коже, или улучшения внешнего вида увядшей кожи.

При использовании небольшого количества композиции, например от 1 до 100 мл, эту композицию наносят на обрабатываемые поверхности кожи из соответствующей емкости или аппликатора, а затем, если это необходимо, ее распределяют и/или втирают в кожу ладонью или пальцами, либо с использованием соответствующего приспособления.

Форма продукта и упаковка
Композиция настоящего изобретения, предназначенная для ухода за кожей путем местного применения, может быть изготовлена в виде лосьона, крема или геля. Эта композиция может быть упакована в подходящую емкость, которая соответствует вязкости этой композиции и пригодна для ее использования потребителем. Так, например, лосьон или крем могут быть упакованы во флаконы или в шариковый аппликатор, либо в распыляющее аэрозольное устройство или в баллон, снабженный дозатором насосного типа, пригодным для нажатия пальцем. Если данная композиция изготовлена в виде крема, то ее просто хранят в недеформируемом сосуде или в плотно закрытой емкости, такой как тюбик или закрывающаяся крышкой косметическая баночка. Эта композиция может быть также заключена в капсулы, такие как капсулы, описанные в патенте США N 5063057.

Настоящее изобретение также относится к плотно закрывающейся емкости, содержащей косметически приемлемую композицию, описанную в настоящей заявке.

Настоящее изобретение более подробно проиллюстрировано в нижеследующих конкретных примерах. Ретиноиды были получены от фирмы Sigma.

Материалы и методы
Клеточная культура:
Кератиноциты человека, выделенные из неонатальной крайней плоти путем обработки трипсином, культивировали на модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DME) и среде Хемса F12 (1:1)/10% фетальной телячьей сыворотки в присутствии облученных фибробластов мыши ЗТЗ для создания колоний делящихся кератиноцитов. Клетки культивировали в вышеуказанных условиях до их второго пассажа (включительно) и хранили в замороженном виде для дальнейшего использования. Замороженные кератиноциты второго пассажа оттаивали, засевали на вышеуказанную среду и культивировали в течение пяти дней, после чего их переносили на бессывороточную среду на основе MCDB 153 (KGM) для культивирования кератиноцитов, полученную от Clonetics Corporation, San Diego, CA и содержащую 0,15 мМ Ca, или бессывороточную среду (KSFM) для культивирования кератиноцитов, полученную от Gibco и содержащую 0,09 мМ Ca. На 7-ой день, когда клетки достигали 80-90%-ной конфлюэнтности, их обрабатывали трипсином и засевали в бессывороточную среду для проведения различных экспериментов.

Анализ на трансглутаминазу
Анализ на трансглутаминазу и дефференцировку кератиноцитов
В процессе терминальной дифференцировки в эпидермисе на внутренней поверхности периферического клеточного слоя образуется слой белка толщиной 15 нм, известный как ороговевший слой (СЕ). Этот ороговевший слой состоит из многочисленных различных белков, которые перекрестно сшиты друг с другом посредством образования N^ε-γ-глутамил)лизиновых изодипептидных связей, катализируемого действием по крайней мере двух различных трансглутаминаз, экспрессированных в эпидермисе. Трансглутаминаза I (TGasa 1) экспрессируется в избытке в дифференцированных слоях эпидермиса, особенно в зернистом слое, но отсутствует в недифференцированном базальном эпидермисе. Таким образом, трансглутаминаза I может быть использована в качестве маркера эпидермальной дифференцировки кератиноцитов с высокими уровнями трансглутаминазы I, что указывает на их более дифференцированное состояние. Оценку состояния дифференцировки культивированных кератиноцитов проводили с помощью анализа ELISA с использованием антитела против трансглутаминазы I, как описано в нижеприведенных Примерах.

Для примера 1 использовали следующую процедуру:
Кератиноциты (культивированные, как описано выше) засевали в 96-луночные планшеты при плотности 3000 клеток на лунку в 200 мкл среды. После инкубирования в течение четырех дней среду заменяли на среду, содержащую тестируемые соединения (6 дубликатов на тест). Клетки культивировали еще 72 часа, после чего среду отсасывали, и планшеты хранили при температуре -70^oC. Затем планшеты удаляли из холодильника, и клетки промывали PBS. После добавления 100 мкл стерильной воды клетки разрушали путем замораживания при -70^oC, а затем оттаивания. Клетки инкубировали в течение еще одного часа при комнатной температуре (К/Т) с PBS/3% BSA (буфер для промывки, альбумин бычьей сыворотки), а затем промывали свежей аликвотой буфера для промывки. Клетки инкубировали в течение 1 часа при 37^oC с 50 мкл мышиного моноклонального первичного антитела (IgG) против трансглутаминазы человека, полученного от Biomedical Industries и разведенного 1:2000 в буфере для промывки, а затем два раза промывали буфером для промывки. После этого клетки инкубировали в течение 1 часа при 37^oC с 50 мкл вторичного антитела (Fab-фрагмента; конъюгированного с пероксидазой антитела против мышиных иммуноглобулинов IgG, полученного от Amersham), разведенного в отношении 1:4000 в буфере для промывки, а затем два раза промывали буфером для промывки. Клетки инкубировали с раствором субстрата (4 мг о-фенилендиамина и 3,3 мкл 30% H₂O₂ в 10 мл 0,1М цитратного буфера, pH 5,0) в течение пяти минут, при комнатной температуре, в темноте (под алюминиевой фольгой). Реакцию прекращали путем добавления 50 мкл 4 н. H₂SO₄. Оптическую плотность образцов считывали при 492 нм на планшет-ридере. Из шести дубликатов четыре дубликата обрабатывали обоими антителами, а два дубликата обрабатывали только вторичным антителом (то есть, для определения фонового связывания антитела, конъюгированного с ферментом). Уровни трансглутаминазы I определяли путем вычитания фоновых значений из значений, полученных после каждой обработки, и определения средней квадратичной ошибки (± ср.кв.ош.) для дубликатов, обработанных обоими антителами.

Для примера 2 использовали следующую процедуру:
Кератиноциты (культивированные, как описано выше) засевали в 96-луночные планшеты при плотности 3000 клеток, на лунку в 200 мкл среды для культивирования клеток. После инкубирования в течение четырех дней среду заменяли на среду, содержащую тестируемые соединения (6 дубликатов на тест). Клетки культивировали еще 72 часа, после чего среду отсасывали, и планшеты хранили при температуре -70^oC. После удаления планшетов из холодильника, клетки разрушали путем замораживания при -70^oC и оттаивания, а затем три раза промывали PBS. Клетки инкубировали в течение еще одного часа ч при комнатной температуре (К/Т) с TBS/5% BSA. Затем клетки инкубировали в течение 2 часов при 37^oC с 100 мкл мышиного моноклонального антитела (IgG) против трансглутаминазы человека (первичного антитела), полученного от Biomedical Technologies Inc. и разведенного 1:2000 в буфере TBS/1% BSA, а затем шесть раз промывали буфером для промывки (TBS/1% BSA/0,05% Твин-20). После этого клетки инкубировали в течение 2 часов при 37^oC с 100 мкл Fab-фрагмента, конъюгированного с пероксидазой антитела против мышиных IgG, (вторичного антитела), полученного от Amersham и разведенного в отношении 1:4000 в буфере для промывки, а затем три раза промывали буфером для промывки и три раза PBS. Клетки инкубировали с раствором субстрата (4 мг о-фенилендиамина и 3,3 мкл 30% H₂O₂ в 10 мл 0,1М нитратного буфера, pH 5,0) в течение пяти минут, при комнатной температуре, в темноте (под алюминиевой фольгой). Реакцию прекращали путем добавления 50 мкл 4 н. H₂SO₄. Оптическую плотность образцов считывали при 492 нм на планшет-ридере. Из шести дубликатов четыре дубликата обрабатывали обоими антителами, а два дубликата обрабатывали только вторичным антителом (то есть, для определения фонового связывания антитела, конъюгированного с ферментом). Уровни трансглутаминазы I определяли путем вычитания фоновых значений из значений, полученных после каждой обработки, и определения средней квадратичной ошибки (± ср.кв.ош.) для дубликатов, обработанных обоими антителами.

Анализ ДНК
Уровень трансглутаминазы I, обнаруженной после обработки клеток, должен зависеть от числа клеток, то есть, чем больше число клеток, тем больше уровень обнаруживаемой трансглутаминазы I. Уровень трансглутаминазы 1 был нормализован на содержание ДНК в клетках в той же самой лунке, что позволило устранить расхождения, обусловленные различием в числе клеток. Количественная оценка ДНК может быть, в частности, использована как индикатор числа клеток, включая число кератиноцитов, поскольку каждая клетка имеет, в сущности, идентичный геном, а поэтому идентичное количество ДНК. Следовательно, полное содержание ДНК клеток в лунке прямо пропорционально числу клеток в этой лунке. Количественную оценку ДНК использовали для нормализации данных уровней трансглутаминазы 1 на количество клеток.

Кератиноциты засевали в 96-луночные планшеты при плотности 3000 клеток на лунку в 200 мкл среды. После инкубирования в течение четырех дней среду заменяли на среду, содержащую тестируемые соединения (6 дубликатов на тест). Клетки культивировали еще 72 часа, после чего среду отсасывали, и планшеты хранили в течение по крайней мере 1,5 часа при температуре -70^oC. Затем планшеты удаляли из холодильника и оттаивали в течение 30 минут. После этого добавляли 100 мкл/лунку красителя Hoechst (в конечной концентрации 1 мкг/мл) и инкубировали в течение 15 минут, после чего планшеты покрывали и считывали на флуориметре (возбуждение на 360 нм и излучение на 460 нм). Раствор красителя удаляли, и лунки промывали PBS при подготовке для анализа на трансглутаминазу.

Пример 1
Ретиноевая кислота является более эффективной, чем ретинол, в изменении состояния дифференцировки кератиноцитов
Было исследовано влияние ретиноевой кислоты (RA) и ретинола (ROH) на уровни трансглутаминазы, нормализованные на содержание клеточных ДНК, после добавления ретиноевой кислоты (RA) и ретинола (ROH), и результаты этого исследования представлены в таблице 1.

Все концентрации тестированной ретиноевой кислоты, то есть 2,5 • 10^-7М, 2,5 • 10^-8M и 2,5 • 10^-9M, способствовали снижению дифференцировки кератиноцитов по сравнению с контролем (этанол), и это снижение было в значительно большей степени, чем то, которое достигалось при обработке с использованием каждой из соответствующих концентраций 2,5 • 10^-7М, 2,5 • 10^-8М и 2,5 • 10^-9М ретинола. Снижение уровня трансглутаминазы является дозозависимым как для ретиноевой кислоты, так и для ретинола. Это свидетельствует о том, что ретиноевая кислота имеет более сильное ингибирующее действие на эпителиальную дифференцировку кератиноцитов, чем ретинол.

Пример 2
Амиды жирных гидроксикислот и ретинол отказывают синергическое ингибирующее действие на дифференцировку кератиноцитов
Влияние тестируемых соединений на уровни трансглутаминазы I, нормализованные на содержание ДНК в клетках, оценивали в ответ на 72-часовую обработку этими соединениями. Амид был получен от фирмы Quest International. Амид C₁₃-β-гидроксикислоты имел следующую структуру:

Концентрация 2,5 • 10^-8M ретиноевой кислоты очень эффективно подавляет уровни трансглутаминазы I кератиноцитов (до 6% от контрольного уровня). Концентрация 2,5 • 10^-8М ретинола является менее эффективной, чем ретиноевая кислота (79%), а концентрация 10^-9М амида C₁₃-β-гидроксикислоты, используемой отдельно, не оказывает ингибирующего действия на уровень трансглутаминазы I кератиноцитов. Однако концентрации 2,5 • 10^-8М ретинола +10^-8М амида C₁₃-β-гидpoкcикиcлoты ингибировали трансглутаминазу I кератиноцитов до уровня 62% от контрольных уровней. Следовательно, амид C₁₃-β-гидроксикислоты и ретинол синергически ингибируют дифференцировку кератиноцитов аналогично действию ретиноевой кислоты.

Влияние тестируемых соединений на уровни трансглутаминазы I, нормализованные на содержание ДНК в клетках, оценивали в ответ на 72-часовую обработку этими соединениями. Термин "лактамид МЕА" означает моноэтаноламид-лактамид. Это соединение было получено от фирмы Croda Chemicals. Лактамид МЕА имеет следующую структуру:

Концентрация 2,5 • 10^-7M ретиноевой кислоты эффективно подавляет уровни трансглутаминазы I кератиноцитов (до 73% от контрольного уровня). Концентрации 2,5 • 10^-7М ретинола и 10^-6M лактамида-DEA, используемые отдельно, менее эффективно ингибируют трансглутаминазу I кератиноцитов. Однако концентрации 2,5 • 10^-7М ретинола + 10^-6М лактамида-DEA ингибировали уровни трансглутаминазы I кератиноцитов до 72% от контрольных уровней. Следовательно, лактамид-МЕА и ретинол синергически ингибируют дифференцировку кератиноцитов аналогично действию ретиноевой кислоты.

В примерах 1 и 2 было продемонстрировано, что ретиноевая кислота ингибирует дифференцировку кератиноцитов дозозависимым способом. В примерах 1 и 2 осуществляли анализ, где ретиноевую кислоту использовали в качестве позитивного контроля, а эталонное соединение использовали для сравнения с другими соединениями. Ретинол является не эффективным в ингибировании дифференцировки кератиноцитов.

Однако неожиданные результаты, полученные в примерах 1 и 2, свидетельствуют о том, что воздействие ретинола на культивированные кератиноциты может быть усилено до уровней, приближающихся к уровню действия ретиноевой кислоты, путем объединения ретинола или ретинилового сложного эфира с амидом жирной гидроксикислоты, то есть с соединением, которое само по себе оказывает небольшое воздействие или вообще не оказывает какого-либо воздействия на кератиноциты. Результаты, полученные выше, указывают на то, что амид жирной гидроксикислоты, взятый в комбинации с ретинолом или сложным ретиниловым эфиром, действует синергически, снижая на дифференцировку кератиноцитов, имитируя действие ретиноевой кислоты.

В примерах 3-8 проиллюстрированы композиции для местного применения в соответствии с настоящим изобретением. Эти композиции могут быть получены стандартным способом. Они являются пригодными для применения в косметике. В частности, эти композиции могут быть использованы для нанесения на морщинистую, шероховатую, сухую, шелушащуюся, увядшую и/или УФ-поврежденную кожу в целях улучшения ее внешнего вида и чувствительности, а также для нанесения на здоровую кожу в целях предупреждения или замедления ее деградации.

Пример 3
В этом примере проиллюстрирована, тонкодисперсная эмульсия типа "вода в масле", включающая композицию настоящего изобретения, мас.%:
Ретинол - 0,5
Полностью гидрированное кокосовое масло - 3,9
Амид жирной C₁₃-β-гидроксикислоты - 5
Brij 92^* - 5
Бентон 38 - 0,5
MgSO₄ • 7 H₂O - 0,3
Бутилированный гидрокситолуол - 0,01
Отдушка - дост. кол.

Вода - до 100
^* Brij 92 - олеиловый эфир полиоксиэтилена (2).

Пример 4
В этом примере проиллюстрирован крем типа "масло в воде", включающий композицию настоящего изобретения, мас.%:
Ретинилпальмитат - 0,15
Минеральное масло - 4
Лактамид МЕА - 1
Brij 56^* - 4
Alfol 16RD^* - 4
Триэтаноламин - 0,75
Бутан-1,3-диол - 3
Ксантановая камедь - 0,3
Отдушка - дост. кол.

Бутилированный гидрокситолуол - 0,01
Вода - до 100
^*Brij 56 - цетиловый спирт РОЕ (10)
Alfol 16RD - цетиловый спирт.

Пример 5
В этом примере проиллюстрирован спиртовой лосьон включающий композицию настоящего изобретения, мас.%:
Ретинилпальмитат - 0,15
N-гидроксиэтил-2-гидрокси-C₁₃ амид - 0,1
Этанол - 40
Отдушка - дост. кол.

Бутилированный гидрокситолуол - 0,01
Вода - до 100
Пример 6
В этом примере проиллюстрирован другой спиртовой лосьон, содержащий композицию настоящего изобретения, мас.%:
Ретинол - 0,15
N-гидpoкcиэтил-2-гидpoкcи-C₁₃ амид - 0,1
Этанол - 40
Антиоксидант - 0,1
Отдушка - дост. кол.

Вода - до 100
Пример 7
В этом примере проиллюстрирован солнцезащитный крем, включающий композицию настоящего изобретения, мас.%:
Ретинол - 0,01
12-Гидрокси-N-(2-гидроксиэтил)октадеканамид - 0,1
Силиконовое масло 200 сСт - 7,5
Глицерилмоностеарат - 3
Цетостериловый спирт - 1,6
Полиоксиэтилен-(20)-цетиловый спирт - 1,4
Ксантановая камедь - 0,5
Parsol 1789 - 1,5
Октилметоксициннат (PARSOL МСХ) - 7
Отдушка - дост. кол.

Краситель - дост. кол.

Вода - до 100
Пример 8
В этом примере проиллюстрирована безводная композиция для ухода за кожей, включающая комбинацию соединений настоящего изобретения, мас.%:
Ретиноевая кислота - 0,15
Моноэтаноламид касторового масла - 1
Силиконовая камедь SE-30¹ - 10
Силиконовая жидкость 345² - 20
Силиконовая жидкость 344³ - 55,79
Сквален - 10
Линолевая кислота - 0,01
Холестерин - 0,03
2-гидрокси-н-октановая кислота - 0,7
Линолеат витамина Е - 0,5
Масло из травяного сырья - 0,5
Этанол - 2
¹Диметилсиликоновый полимер, имеющий молекулярную массу по крайней мере 50000 и вязкость по крайней мере 10000 сантистокс при 25^oC и поставляемый фирмой GEC
²Диметилсилоксановый циклический пентамер, поставляемый фирмой Dow Corning Corp.

³Диметилсилоксановый тетрамер, поставляемый фирмой Dow Corning Corp.

Изобретение относится к медицине и касается композиции для ухода за кожей, содержащей амид жирной гидроксикислоты в комбинации с ретинолом или ретиниловым сложным эфиром, что приводит к синергетическому ингибированию дифференцировки кератиноцитов. Это действие аналогично действию ретиноевой кислоты. Изобретение также относится к способу имитации воздействия на кожу ретиноевой кислоты и к способу ухода за кожей. 3 с. и 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Композиция для ухода за кожей, содержащая: (a) от 0,001% до 10% соединения, выбранного из группы, состоящей из ретинола, ретинилового сложного эфира и их смесей; (b) от 0,0001% до 50% амида жирной гидроксикислоты; и (c) косметически приемлемый носитель. 2. Композиция по п.1, где ретиниловый эфир выбирают из группы, состоящей из ретинилпальмитата, ретинилацетата, ретинилпропионата, ретиниллинолеата и их смесей. 3. Композиция по п.1, где ингредиентом (а) является ретинол. 4. Способ ухода за кожей, предусматривающий нанесение на кожу композиции по п.1. 5. Способ имитации воздействия на кожу ретиноевой кислоты, предусматривающий нанесение на кожу композиции по п.1.