РЕГУЛЯТОР РОСТА КЛЕТОК IN VITRO И СПОСОБ РЕГУЛЯЦИИ РОСТА КЛЕТОК IN VITRO Российский патент 2002 года по МПК C12N5/00 C12N5/06 A61N1/36 

Изобретение относится к медицине, а именно к патофизиологии, и касается регуляции пролиферации и дифференцировки клеток in vitro и может быть использовано в клинической онкогематологии.

Известен широкий спектр веществ природного и синтетического происхождения, способных оказывать влияние на клеточный рост in vivo и in vitro. При этом рост клеток костного мозга вследствие присутствия в нем элементов различных гистогенетических линий [1] может служить удобной моделью практически для любой клеточной системы организма, особенно для быстропролиферирующих тканей [2, 3].

Существующий арсенал фармакологических средств предполагает использование их стимулирующего либо ингибирующего эффекта на размножение тех или иных клеток. В настоящее время эффективными, стимулирующими рост средствами являются, например, рекомбинантные цитокины (интерлейкины, эритропоэтин, колониестимулирующие факторы), производные гликозаминогликанов (D-глюкуроновая кислота, N-ацетилнейраминовая кислота, глицирам) [4, 5, 6], эпидермальный фактор роста, гепаринсвязывающие факторы роста [7] и многие другие. В то же время преимущественное негативное влияние на рост родоначальных клеток различных тканей оказывают, как правило, фактор некроза опухоли, интерфероны, трансформирующий фактор роста - бета [8, 9].

Физические и химические факторы, в частности радиационное [10, 11] и ультрафиолетовое [12] излучения, термическое воздействие [13], цитостатические препараты [14] , обладают в основном негативным эффектом на интенсивность клеточного роста. С другой стороны, известно позитивное влияние некоторых режимов монохроматического электромагнитного излучения (лазерного или светодиодного) на иммунокомпетентные клетки in vivo [15], рост клеток in vitro [16] . Однако подобные регуляторы и способы регуляции роста клеток in vitro не являются физиологическими.

Известно влияние на рост клеток in vitro электрического поля, создаваемого во взвеси клеток при помощи источника внешнего магнитного поля [17], при помещении взвеси клеток между электродами генератора импульсов [18].

Наиболее близким (прототипом) как к регулятору, так и к способу регуляции роста клеток in vitro является регулятор в виде электродов и способ регуляции путем помещения электродов непосредственно во взвесь клеток и воздействия на клетки электрическим током [19, 20, 21, 22]. При этом авторы добиваются позитивного либо негативного влияния на рост клеток in vitro посредством вариации таких параметров, как амплитуда либо частота электрического сигнала. Однако данный регулятор и способ регуляции роста клеток in vitro имеет недостатки:
1. для достижения позитивного эффекта на рост клеток требуется один параметр, для достижения негативного эффекта - другой, часто не соответствующий физиологическому диапазону, что предполагает в каждом случае изменения режима работы внешнего источника напряжения, к которому подключены электроды;
2. трудность сохранения стерильности культуры клеток вследствие введения электродов в культуру клеток и необходимости их соединения с внешним источником напряжения;
3. неудобство применения, поскольку используется дополнительная громоздкая аппаратура, требующая точной настройки параметров перед работой;
4. необходимость обслуживающего персонала либо дополнительного обучения персонала работе с электродами и источником напряжения;
5. низкая экономическая эффективность вследствие увеличения времени подготовки и выполнения требуемой процедуры, необходимости наличия дорогостоящего оборудования.

Подобных недостатков лишен электростимулятор желудочно-кишечного тракта (ЭС ЖКТ), содержащий в одном корпусе генератор электрических импульсов, источник питания, размещенный внутри капсулы, и электроды, представляющие собой две электрически изолированные части лекарственной капсулы [23, 24], предлагаемый в качестве регулятора роста клеток in vitro.

Задачей, решаемой предлагаемым изобретением, является одновременное, равномерное, приближенное к физиологическому электрическое воздействие на клетки с упрощением условий достижения как позитивной, так и негативной регуляции роста клеток in vitro, повышение удобства пользования.

Поставленная задача достигается тем, что в качестве регулятора роста клеток in vitro применяют ЭС ЖКТ, выполненный в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, который помещают непосредственно в клеточную взвесь и проводят электрическое воздействие на клетки in vitro в течение не менее 5-180 мин: для позитивной регуляции роста клеток in vitro в течение не менее 5-60 мин, для негативной регуляции роста клеток in vitro в течение не менее 180 мин импульсным током с длительностью импульсов 5-7 мс, силой тока 9-16 мА и амплитудой напряжения между электродами не более 4,5 В.

Применение ЭС ЖКТ, выполненного в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, по новому назначению стало возможным благодаря выявлению нами его новых свойств. Впервые показано влияние ЭС ЖКТ, выполненного в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, на рост клеток in vitro, направленность которого определяется временем воздействия ЭС ЖКТ на клеточную взвесь.

Известно использование ЭС ЖКТ, выполненного в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы [24], разрешенное приказом министра здравоохранения N 58 от 16.01.85 и инструкцией Минздравмедпрома, для изолированной электрической стимуляции желудка, 12-перстной кишки, протоковой системы поджелудочной железы и внепеченочных путей, тонкого и толстого кишечников при различных состояниях организма. Импульсы АЭС ЖКТ нормализуют деятельность внутренних органов за время прохождения его в желудочно-кишечном тракте [25].

Свойство ЭС ЖКТ, выполненного в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, регулировать рост клеток in vitro в литературе не описано.

Экспериментально установлено, что присутствие ЭС ЖКТ, выполненного в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, в клеточной взвеси в зависимости от времени его нахождения оказывает как позитивное, так и негативное влияние на рост клеток различных гистогенетических линий.

В экспериментах нами был использован ЭС ЖКТ, выполненный в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы [24] , генерирующий оптимальные параметры: импульсный ток с длительностью импульсов 5-7 мс, силой тока 9-16 мА и амплитудой напряжения между электродами до 4,5 В.

Эксперименты проведены на 10 здоровых мышах-самцах линии CBA/CaLac массой 18-20 г, 1 мыши CBA/CaLac с асцитной опухолью Эрлиха и 1 мыши линии AKR/JY, полученных из коллекционного фонда лаборатории экспериментального биомоделирования НИИ фармакологиии ТНЦ СО РАМН.

Клетки костного мозга как источник гранулоцитов и фибробластов вымывали из бедренной кости средой RPMI-1640 с 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 280 мг/л L-глутамина, доводили до конечной концентрации 2•10⁶ нуклеаров в 1 мл в общем объеме среды 6 мл и помещали ЭС ЖКТ, выполненный в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, в пробирки с клеточной взвесью. Время воздействия ЭС ЖКТ, выполненного в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, на клетки варьировало от 5 до 180 мин. Затем в стерильных условиях вынимали ЭС ЖКТ, выполненный в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, из пробирок и в термостате при 37^oС инкубировали все пробы, включая контрольную клеточную взвесь (без воздействия ЭС ЖКТ), до 180 мин.

Для определения эффекта ЭС ЖКТ, выполненного в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, на рост клеток in vitro использовали метод колониеобразования в полувязкой культуральной среде [26] . С этой целью жизнеспособные костномозговые нуклеары, взятые после воздействия ЭС ЖКТ, выполненного в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, из клеточной взвеси в концентрации 2•10⁵/мл культивировали в 96-луночных плоскодонных планшетах в среде следующего состава: 1% метилцеллюлозы (Sigma), 10% ЭТС (ICN), 300 мг/л L-глутамина (Sigma), 2,5•10^-5 М 2-меркаптоэтанола (Sigma), 50 мг/л гентамицина, 1•10^-9 г/мл рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора мыши (ICN), 89% среды RPMI-1640 (ICN). Число способных к росту клеток (колониеобразующих единиц, КОЕ) фибробластов (КОЕ-Ф) и гранулоцитов (КОЕ-Г) определяли по числу колоний, выросших в культуре через 7 суток культивирования в CO₂ -инкубаторе при 37^oС и 100% влажности. Под колониями подразумевали клеточные агрегаты, состоящие не менее чем из 50 клеток.

Проведенные исследования показали, что ЭС ЖКТ, выполненный в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, способен оказывать как позитивное, так и негативное влияние на рост клеток in vitro. При этом направленность действия регулятора зависит от времени его нахождения во взвеси клеток костного мозга (табл. 1, 2). Так, достоверное увеличение числа гранулоцитарных колониеобразующих единиц (КОЕ-Г) наблюдалось после воздействия ЭС ЖКТ, выполненного в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, в течение 5, 10, 20, 60 мин (до 2116 % от контрольного уровня). После 60 мин инкубации ЭС ЖКТ с клетками в жидкой среде отмечалось последующее постепенное падение числа КОЕ-Г, достигающее при 180-минутной экспозиции 15% (р<0,05) от контрольного роста клеток (табл.1).

Однотипное влияние оказывал ЭС ЖКТ, выполненный в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, на рост колониеобразующих единиц фибробластов (табл.2): позитивное в интервале времени от 5 до 60 мин воздействия на клетки костного мозга и негативное (до полной ингибиции роста клеток in vitro) при 180-минутной экспозиции. Следует подчеркнуть, что при 60-минутном воздействии на клетки при помощи ЭС ЖКТ, выполненного в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, отмечалось практически 56-кратное увеличение выхода КОЕ-Ф в культуре.

В следующем эксперименте определяли влияние ЭС ЖКТ, выполненного в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, на рост опухолевых клеток in vitro. В качестве источника опухолевых клеток использовали тимому больной 12-месячной мыши линии AKR/JY (масса тимуса более 0,5 г, селезенки более 1 г) и перевиваемую асцитную опухоль Эрлиха мышей линии CBA/CaLac. Клетки тимомы забирали из тимуса в стерильных условиях, гомогенизировали до получения клеточной взвеси в среде RPMI-1640. Асцит с числом жизнеспособных клеток 60•10⁶ нуклеаров/мл забирали на 7-й день после перевивки опухоли Эрлиха.

Рабочую концентрацию опухолевых клеток в обоих случаях доводили до 2•10⁶ жизнеспособных нуклеаров в 1 мл в общем объеме среды RPMI-1640 (6 мл), содержащей 20% ЭТС и 280 мг/л L-глутамина, и помещали ЭС ЖКТ, выполненный в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, в пробирки с клеточной взвесью. Время воздействия ЭС ЖКТ на клетки составляло 0 мин (контроль), 60 и 180 мин в случае тимомы мышей AKR/JY и 0 мин (контроль), 10 и 180 мин в опыте с опухолью Эрлиха. Затем в стерильных условиях вынимали ЭС ЖКТ, выполненный в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, из пробирок и в термостате при 37^oС инкубировали все пробы, включая контрольную клеточную взвесь, до 180 мин. Затем переносили жизнеспособные нуклеары тимомы в пробирки со свежей культуральной средой вышеописанного состава объемом 4 мл в конечной концентрации 3•10⁶ клеток/мл и выращивали клетки в течение 24 ч при 37^oС. Взвесь живых клеток опухоли Эрлиха разливали в конечной концентрации 10⁶ клеток/мл в 0,2 мл свежей среды с ЭТС и L-глутамином в 96-луночные планшеты и выращивали при 37^oС, 4% CO₂ и 100% влажности в течение 24 ч. Данный интервал времени соответствует начальной фазе роста опухолевых клеток in vitro [27]. Подсчитывали общее количество кариоцитов, а также число живых опухолевых клеток в культуре по способности живых клеток исключать проникновение 0,5% трипанового синего в цитоплазму.

Эксперимент показал, что 60-минутное воздействие ЭС ЖКТ, выполненного в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, оказывает позитивное, а 180-минутное воздействие -негативное влияние на рост клеток тимомы мышей линии AKR/JY in vitro, зафиксированное по соответствующим изменениям клеточности взвеси (табл.3).

В свою очередь после 10-минутного воздействия ЭС ЖКТ, выполненного в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, число клеток опухоли Эрлиха более чем в 1,5 раза превышало таковое в контроле, а после 180-минутного воздействия число опухолевых клеток напротив достоверно снижалось (табл. 4). Это также свидетельствует в пользу способности ЭС ЖКТ, выполненного в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, как позитивно, так и негативно влиять на рост клеток in vitro.

Таким образом, представленные данные убедительно свидетельствуют о способности ЭС ЖКТ, выполненного в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, как позитивно, так и негативно регулировать рост клеток in vitro в зависимости от времени его воздействия на клеточную взвесь.

ЭС ЖКТ, выполненный в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, планируется использовать в онкогематологической практике.

ЛИТЕРАТУРА
1. Фриденштейн А. Я., Лурия Е.А. Клеточные основы кроветворного микроокружения. - М., 1980. - С. 15-18, 198.

2. Фриденштейн А. Я., Лурия Е.А. Клеточные основы кроветворного микроокружения. - М., 1980. - С. 19.

3. Гольдберг Е. Д. , Дыгай А.М., Удут В.В. и др. Закономерности структурной организации систем жизнеобеспечения в норме и при развитии патологического процесса. - Томск, 1996. С. 127-131.

4. Гольдберг Е. Д. , Дыгай А.М., Удут В.В. и др. Закономерности структурной организации систем жизнеобеспечения в норме и при развитии патологического процесса. - Томск, 1996. С. 19-55.

5. Gol'dberg E.D., Dygai А.М., Agafonov V.I. e.a. Principles of designing natural stimulators of hemopoiesis //Experimental and Clinical Pharmacology. - 1997. - Vol. 1. - N 1. -P. 1-6.

6. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., Хлусов И.А. Динамическая теория регуляции кроветворения // Бюллетень эксперим. биол. и мед. - 1999. - N 5. - С. 484-494.

7. Иващенко Ю.Д., Быкорез А. И. Полипептидные факторы роста и канцерогенез. - Киев, 1990. - С. 22-30, 59-64.

8. Иващенко Ю. Д., Быкорез А.И. Полипептидные факторы роста и канцерогенез. - Киев, 1990. - С. 65.

9. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М. Удут В.В. и др. Закономерности структурной организации систем жизнеобеспечения в норме и при развитии патологического процесса. - Томск, 1996, С. 34-36.

10. Коноплянников А.Г. Радиобиология стволовых клеток. -М., 1984. - С. 39-55.

11. Переверзев А.Е. Кроветворные колониеобразующие клетки и физические стресс-факторы. - Л., 1986. - С. 95-102.

12. Cotter T. G. , Lennon S.V., Glynn J.M., Green D.R. Microfilament-disrupting agents prevent the formation of apoptotic bodies in tumor cells undergoing apoptosis // Cancer Research. - 1992. - Vol. 52. - P. 997-1005.

13. Переверзев А.Е. Кроветворные колониеобразующие клетки и физические стресс-факторы. - Л., 1986. - С. 61-64.

14. Гершанович М. Л. Осложнения при химио- и гормонотерапии злокачественных опухолей. - М., 1982. - 224 с.

15. Модяев В.П., Карпов А.Б., Дикович М.Ф. и др. Возможности низкоэнергетического лазерного излучения в лечении предопухолевых заболеваний желудка// Вопросы онкологии. - 1991. -T. 37. - N 6. - С. 731-734.

16. Karu T. Photobiology of low-power laser effects//Health Physics. - 1989. - Vol. 56. - P. 691-704.

17. Kaune W.T., Frazier M.E., King A.J. e.a. System for the exposure of cell suspensions to power-frequency electric fields//Bioelectromagnetics. - 1984. - Vol. 5. - N 2. - P. 117-129.

18. De Mattei M., Caruso A., Traina G.C. e.a. Correlation between pulsed electromagnetic fields exposure time and cell proliferation increase in human osteosarcoma cell lines and human normal osteoblast cells in vitro//Bioelectromagnetics. - 1999. - Vol. 20. - N 3. - P. 177-182.

19. Giaever I., Keese C.R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1984. - Vol. 81. - N 12. - P. 3761-3764.

20. Noda M., Johnson D.E., Chiabrera A., Rodan G.A. Effect of electric currents on DNA synthesis in rat osteosarcoma cells:dependence on conditions that influence cell growth// J. Orthop. Res. - 1987. - Vol. 5. - N 2. - P. 253-260.

21. Kojima J., Shinohara H., Ikariyama Y. e.a. Electrically controlled proliferation of human carcinoma cells cultured on the surface of an electrode// J.Biotechnol. - 1991. -Vol. l8. - N 1-2. - P. 129-139.

22. Lyte M. , Gannon J.E., O'Clock G.D. Effects of in vitro electrical stimulation on enhancement and suppression of malignant lymphoma cell proliferation// J. Natl. Cancer. Inst. -1991. - Vol. 83. - N 2. - P. 116-119.

23. Пекарский В.В., Агафонников В.Ф., Дамбаев Г.Ц. и др. Автономные электростимуляторы организма человека и животных. -Томск, 1995. - С. 14.

24. Патент N 936931, Б.И. N 23, 1982 г.

25. Пекарский В.В., Агафонников В.Ф., Дамбаев Г.Ц. и др. Автономные электростимуляторы организма человека и животных. -Томск, 1995. - С. 28-68.

26. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск, 1992. - С. 130-151.

27. Тяготин Ю. В., Полоцкий А.Е., Вахитов Т.Я. и др. Экспериментальное изучение биопрепарата лимфотилин как антипролиферативного и противоопухолевого средства//Вопросы онкологии. - 1998. - T. 44. - N 1. - С. 92-96.

Изобретение относится к медицине, а именно к патофизиологии, и касается регуляции роста клеток in vitro и может быть использовано в клинической онкогематологии. Изобретение позволяет проводить одновременно, равномерно, приближенно к физиологическому электрическое воздействие на клетки с упрощением условий достижения как позитивной, так и негативной регуляции роста клеток in vitro, а также повысить удобства пользования. В качестве регулятора роста клеток in vitro применяют электростимулятор желудочно-кишечного тракта, выполненный в виде лекарственной капсулы. Электроды капсулы представляют собой изолированные части этой капсулы. Генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы. Капсулу помещают непосредственно в клеточную взвесь и проводят электрическое воздействие на клетки in vitro. Для позитивной регуляции роста клеток in vitro воздействие проводят в течение не менее 5-60 мин. Для негативной регуляции роста клеток in vitro - в течение не менее 180 мин. Воздействуют импульсным током с длительностью импульсов 5-7 мс, силой тока 9-16 мА и амплитудой напряжения между электродами не более 4,5 В. 2 с. и 1 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Применение электростимулятора желудочно-кишечного тракта, выполненного в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, в качестве регулятора роста клеток in vitro. 2. Способ регуляции роста клеток in vitro путем электрического воздействия, отличающийся тем, что электрическое воздействие проводят электростимулятором желудочно-кишечного тракта, выполненным в виде лекарственной капсулы, в которой электроды представляют собой изолированные части лекарственной капсулы, а генератор импульсов и источник питания размещены внутри капсулы, помещенным непосредственно в клеточную взвесь, причем для позитивной регуляции роста клеток in vitro воздействуют в течение не менее 5-60 мин, для негативной регуляции роста клеток in vitro воздействуют в течение не менее 180 мин. 3. Способ регуляции роста клеток in vitro по п. 2, отличающийся тем, что электрическое воздействие проводят импульсным током с длительностью импульсов 5-7 мс, силой тока 9-16 мА и амплитудой напряжения между электродами не более 4,5 В.