СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ТКАНЕЙ СЕРДЦА Российский патент 2002 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине и предназначено для диагностики состояния биологических тканей.

В настоящее время в ряде операций при замещении клапанов сердца используются трупные клапаны. Существует Протокол забора тканей сердца" который ограничен временной границей (до 48 часов от момента смерти), особенностями танатогенеза (исключаются отравления), прижизненной инфицированностью (исключаются ряд инфекций, в т.ч. СПИД, туберкулез и др.), вводятся возрастные пределы, не более 65 лет. Считается, что учет вышеназванных факторов и макроскопическая (визуальная) оценка предполагает возможность получения жизнеспособного клапанного аллографта, который после обработки в растворах антибиотиков может имплантироваться пациенту при ряде пороков сердца или после обработки растворами антибиотиков до 6 недель и последующего ступенчатого замораживания и сохранения в жидком азоте (1). Однако не всегда полное выполнение Протокола забора с макроскопической характеристикой материала позволяет расчитывать на жизнеспособность клапанного материала сердца. Более того, гораздо более "строгий" Протокол трансплантации сердца, ориентированный на имплантацию сердца не менее чем через 4 часа после его забора, у донора, не всегда гарантирует сохранность сердечных структур (2).

Известно, что для определения характера патологических процессов может использоваться лазерноиндуцированная флюоресценция (3).

Целью изобретения является повышение точности определения сохранности биологических тканей (клапанов сердца) на этапах биотехнологии и предупреждения осложнений, связанных с имплантацией нежизнеспособных клапанов аллографтов.

Указанная цель достигается путем определения спектров вторичной флюоресценции тканей под воздействием ультрафиолетового импульсного лазерного облучения.

Способ осуществляется следующим образом.

Выполняют забор клапанов сердца и инкубируют в среде Хенкса с антибиотиками при температуре 4^oС. Перед использованием образцы клапанов облучают импульсным ультрафиолетовым лазером и анализируют спектральные характеристики для определения степени жизнеспособности тканей.

В проведенном исследовании использовали 8 клапанов сердца (4 аортальных и 4 легочных) с условиями забора, соответствовавшими требованиям Протокола (2).

Шесть клапанов после забора инкубировались в среде Хенкса с антибиотиками при температуре 4^oС до 15 суток. Два инкубировались в среде Хенкса с антибиотиками при температуре 24^oС до 15 суток. Перед началом инкубации и на 15 сутки из каждого клапана под иммерсией инкубационной среды бритвой иссекался образец, который облучался лазером (плотность энергии 0,5 мДЖ/см², 248 нм, диаметр пятна 0,3 см), далее регистрировалась вторичная лазерноиндуцированная флюоресценция. Одновременно другой образец забирался для морфологического контроля с использованием стандартного флюоресцентного метода прижизненного окрашивания и последующей микроскопической оценки препаратов, полученных на криостате. Для оценки включения метки проводился подсчет 300 фибробластов и эндотелиальных клеток. За нежизнеспособные клетки принимались клетки с включением красителя в цитоплазму и окрашиванием ядер. Контурно окрашиваемые клетки принимались за жизнеспособные.

Результаты.

Оценивая микроскопически жизнеспособность клеток клапанов перед началом инкубации, установлено, что в 4-х из 6 клапанов количество жизнеспособных фибробластов и эндотелиальных клеток определялось от 75% до 92%, в двух менее 15%. Одновременное определение спектров, снятых с клапанов, показало (фиг. 1,1), что в клапанах с преобладанием жизнеспособных клеток первая характеристическая полоса спектра в области 320-330 нм приближалась к единице относительной интенсивности, вторая, в области 440-450 нм была 0,4 относительных единиц. В 2-х клапанах, где количество жизнеспособных клеток при морфологическом контроле было менее 10%, первая характеристическая полоса - 320-330 нм приближалась 0,9 единиц относительной интенсивности, вторая - 440-450 нм, так же приближалась к 0,9 единиц относительной интенсивности, кроме того, появлялась третья характеристическая полоса спектра в области 380-390 нм (фиг. 1,2). На основании сопоставления морфологического анализа и спектрального исследования мы констатировали, что 2 из 6 клапанов были нежизнеспособными. После 15 дней инкубации при 4^oС в проведенном повторном исследовании этих 6 клапанных образцов при морфологическом анализе отмечалось незначительное уменьшение жизнеспособных клеток без изменения спектральных характеристик.

В исследовании, где два клапана перед инкубацией при комнатной температуре были определены как жизнеспособные - в морфологическом контроле определялось от 80 до 90% жизнеспособных клеток, спектры соответствовали 4-м жизнеспособным клапанам первой группы. Далее эти два жизнеспособных клапана сердца были инкубированы в среде Хенкса с соответствующими антибиотиками на протяжении 15 суток при комнатной температуре (прогнозируемая гибель), после чего снимались спектральные характеристики и проводился морфологический контроль. После 15 суток инкубации при морфологическом контроле жизнеспособных клеток было менее 5%, спектральные характеристики соответствовали характеристикам, подученным от 2-х нежизнеспособных клапанов, установленных до начала инкубации.

Предлагаемый способ позволяет оценить жизнеспособность тканей и может использоваться в кардиохирургии для оценки состояния биологических трансплантируемых тканей в биотехнологии, трансплантологии, вирусологии. К другим положительным сторонам предлагаемого метода следует отметить, что его применение не связано с разрушением целостности органов или ткани.

Литература
1. Manual of procedures /Cambridge, East Anglian regional tissue bank.

2. Hyde J.A.J., S.J. Booney, M. P.J. Pitt, I.C. Wilson, Howie A.J., Bonser R. S. Immunohistochemical identification of complement membrane attach complex and subclinical iscemia in donor hearts. 12th Annual Meetting of the EACTS (1998).

3. Ларионов П.М. Лазерно-индуцированная флюоросценция сердечных тканей при поражении кальцинозом. //Журнал Прикладной спектроскопии, 1997, т. 64, 4, июль-август, стр. 539-541.

Изобретение относится к медицине и предназначено для диагностики состояния биологической ткани. В предлагаемом способе для повышения точности определения сохранности клапанов сердца на образцы клапанных структур воздействуют ультрафиолетовым импульсным лазерным излучением, снимают спектры вторичной флюоресценции, определяют характер патологических процессов и жизнеспособность тканей. Способ обеспечивает эффективность операции по имплантации клапанов кардиохирургическим больным, снижает вероятность повторной операции. 3 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ определения жизнеспособности тканей сердца, включающий визуальную оценку, отличающийся тем, что оценку осуществляют по изменениям спектральных характеристик вторичной флюоресценции тканей, вызванной воздействием на ткани лазерным импульсным излучением ультрафиолетового диапазона, при этом жизнеспособность тканей характеризует спектр не менее чем из двух спектральных полос с длиной волны 320-330 нм и 440-450 нм и относительной интенсивностью 1 и 0,4 соответственно. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что длина волны лазерного излучения равна 248 нм. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что плотность энергии лазерного излучения составляет от 0,5 мДж/см. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нежизнеспособность тканей характеризует спектр не менее чем из 3-х спектральных полос с длиной волны 320-330 нм, 440-450 нм и 380-390 нм и относительной интенсивностью 0,9-1.