СПОСОБ ИЗУЧЕНИЯ МАЛИГНИЗАЦИИ ТКАНЕЙ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 1997 года по МПК A61K31/40 G09B23/28 A61B10/00 

Изобретение относится к способу исследования малигнизации тканей у экспериментальных животных и основано на способности некоторых порфиринов избирательно накапливаться в злокачественных клетках и затем люминесцировать при освещении светом определенной длины волны.

Известен способ люминесцентной диагностики злокачественных опухолей с помощью гематопорфирина и других порфиринов, люминесцирующих в видимом диапазоне света 630 690 нм [1, 2]
Разрешающая способность метода (минимальный размер опухоли) определяется контрастом получаемого люминесцентного изображения опухоли на фоне окружающей ее здоровой ткани, γ отношением полезного и фонового сигналов) (1, 2).

Однако проведение раннего люминесцентного распознавания появляющихся опухолей этим методом ограничено из-за недостаточно высокого значения. Это связано с маскирующим эффектом красной фоновой люминесценции, вызванным присутствием в биотканях эндогенных порфиринов. Эта люминесценция особенно велика при использовании источников возбуждения в ультрафиолетовой области (УФ). По мере увеличения длины волны от УФ-области спектра до видимого диапазона она значительно уменьшается.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) [3] является метод излучения количественного накопления порфиринов в тканях, в котором в качестве зонда флюоресцентного в организм вводится производное гематопорфирина (ПГП), а затем регистрируют люминесценцию основной компоненты l620 нм). В этом случае полученный контраст находится в пределах от 1,5 до 4,3. Дальнейшее повышение контраста невозможно без использования сложной компьютерной техники и анализа форм спектральных линий [4] Общим недостатком ПГП и родственных соединений является также их фототоксичность, вынуждающая избегать воздействия прямого солнечного света и течение длительного периода времени [1]
Известен способ применения иттербиевых комплексов порфиринов для изучения злокачественных опухолей [6, 7]
Ранее получен платиновый комплекс копропорфирина III и показана возможность его использования в иммуноанализе с временным разрешением [10]
Целью изобретения является существенное увеличение контраста люминесцентного изображения злокачественных тканей, способных к избирательному накоплению производных гематопорфирина и аналогичных ему флюоресцентных меток, а также возможное снижение фототоксического действия используемых при диагностике препаратов на основе ПГП, применяемых как при люминесцентной диагностике опухолей, так и при фотодинамической терапии рака.

Поставленная цель достигается тем, что при изучении люминесценции биологических объектов рассматривают фосфоресценцию платинового комплекса копропорфирина III. Фосфоресценция металлопорфиринов наблюдается в красной и ближней ИК-областях [8] Платиновые комплексы порфиринов в десятки раз превосходят по уровню интенсивности люминесценции описанные в литературе металлокомплексы Zn, Sn, Pd [9] В нашем эксперименте максимум люминесценции (фосфоресценции) для платинового комплекса копропорфирина III отмечался при 645 нм.

Преимуществом предлагаемого способа является то, что в качестве люминесцентного зонда используется платиновый комплекс копропорфирина III, который обладает более высокой селективностью к злокачественной ткани. Кроме того, это вещество, что существенно важно, имеет более высокий квантовый выход люминесценции при воздействии лазерного облучения, широкую доступность самого копропорфирина III, получаемого микробиологическим путем, его низкую токсичность, стабильность, хорошую растворимость в водных растворах, устойчивость во всем диапазоне pH,в то время как иттербиевые комплексы всех известных порфиринов стабильны при pH только выше 6. Кроме того, значительно упрощается химический синтез предлагаемого платинового комплекса копропорфирина III по сравнению с лантаноидной группой, а также он обладает более высоким квантовым выходом люминесценции и необходима существенно меньшая плотность мощности света для возбуждения люминесценции.

В качестве люминесцентного зонда платиновый комплекс копропорфирина III накапливается в опухолевых тканях в больших концентрациях, чем в окружающих нормальных тканях. Используя уникальные свойства изучаемого комплекса копропорфирина III, можно проводить определение концентрации его с помощью флюоресценции, что может быть использовано для ранней диагностики опухолей в клинической практике. При этом вместо молекулярной люминесценции исходного порфирина в видимом диапазоне спектра имеет место характерная интенсивная для иона пластины фосфоресценция в диапазоне 600 750 нм, а фотодинамический эффект и обусловленная им фототоксичность резко подавляются. Коэффициент люминесцентного контраста злокачественных тканей в предлагаемом способе исследования ограничивается лишь различием в концентрациях накапливаемого комплекса платины в злокачественной и окружающей здоровой тканях и уровнем шумов приемника излучения, используемого при регистрации спектра.

Способ люминесцентного излучения клеток осуществлялся введением платинового комплекса копропорфирина III в 1%-ном растворе бикарбоната натрия в хвостовую вену мышей С57В1/6 с подкожно развивающейся метилхолантрениндуцированной опухолью. Затем через различные промежутки времени (от 2 до 96 ч. ) при прогрессировании роста опухоли осуществлялось либо удаление опухоли с окружающими тканями, а также ряда других органов и тканей (печени, почек, кожа мышца, сердце и т. д. ), или непосредственно на самом животном под гексеналовым наркозом изучали люминесценцию опухоли и тканей.

Люминесцентные характеристики опухоли и тканей получали методом волоконно-лазерной спектрофлюорометрии на базе двухволоконного лазерного интроскопа с помощью лазера АИГ:на 2-й гармонике (ген. 532 (нм) в качестве источника накачки [5).

Примеры реализации способа изучения малигнизации тканей у экспериментальных животных.

Пример 1. Платиновый комплекс копропорфирина III растворяют в 1%-ном растворе бикарбоната натрия и в дозе 50 мг/кг веса тела мыши вводят в хвостовую вену. Через 3, 6, 12, 24 ч животных забивают, вырезают опухоль, мышцы, кожу и т. д. и изучают люминесценцию органов и тканей.

Пример 2. Платиновый комплекс копропорфирина III растворяют и вводят, как в предыдущем случае, и также изучают люминесценцию через 2, 6, 14, 24, 96 ч после введения препарата.

Полученные результаты исследования показали, что люминесценция опухоли значительно была выше, чем по всех других органах и тканях, включая даже печень, почки. Наибольший коэффициент контрастности (22 27) между опухолью и окружающей тканью имел место через 12 24 ч после введения препарата.

Таким образом, полученные данные коэффициента контрастности и абсолютные показатели люминесценции подтверждают эффективность предлагаемого способа люминесцентной регистрации опухоли.

Использование: медицина, биология для изучения малигнизации тканей у экспериментальных животных. Сущность изобретения: способ предлагает использование в качестве люминесцентного зонда платинового комплекса копропорфирина 111. Регистрация спектра люминесценции проводится с помощью волоконно-лазерных методов. Использование платинового комплекса копропорфирина 111 имеет преимущественно в результате большей селективности накопления его в опухолевой ткани по сравнению с окружающими нормальными тканями, а также ввиду широкой доступности самого копропорфирина 111, приготавливаемого микробиологическим путем. Платиновый комплекс копропорфирина 111 стабилен во всем диапазоне pH, хорошо растворим в водных растворах обладает более высоким квантовым выходом люминесценции.

Способ изучения малигнизации тканей у экспериментальных животных, заключающийся в том, что животным с химически индуцированной опухолью вводят люминесцентное соединение порфиринового типа, а затем облучают злокачественные и нормальные ткани лазером, регистрируют люминесценцию и рассчитывают коэффициент контрастности по отношению индекса люминесценции злокачественных и нормальных тканей, отличающийся тем, что в качестве люминесцентного соединения используют платиновый комплекс копропорфирина III

а регистрацию люминесценции осуществляют в диапазоне 600 750 нм.