КОНСОРЦИУМ БАКТЕРИЙ ERWINIA SPECIES И ARTHROBACTER SIMPLEX - ДЕСТРУКТОР НЕФТЕПРОДУКТОВ И ОРГАНИЧЕСКОГО СУБСТРАТА В РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ И ОТХОДАХ ЖИВОТНОВОДСТВА Российский патент 2002 года по МПК C12N1/20 C12N1/26 B09C1/10 C05F1/00 C12N1/20 C12R1/06 C12R1/18 

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в биотехнологии и сельском хозяйстве для разложения нефтепродуктов и органического субстрата в растительном сырье и отходах животноводства, в частности, при аэробной и анаэробной переработке навоза скота, птичьего помета, а также в любых областях деятельности человека для очистки объектов от нефтепродуктов.

Известны штаммы микроорганизмов - деструкторы нефтепродуктов, используемые для очистки природных и искусственных объектов от нефти и нефтепродуктов.

Например, известен штамм бактерий Pseudomonas putida-36 (SU, авторское свидетельство 1076446), применяемый для очистки воды и почвы и позволяющий утилизировать до 75% нефти при содержании нефти к объему загрязненного субстрата (почвы, воды) до 10%. Недостатком известного штамма является очистка только незначительно загрязненных объектов.

Известны штаммы микроорганизмов, используемые в биотехнологии, сельском хозяйстве для разложения органических субстратов в растительном сырье.

Например, известны штаммы термофильных бактерий рода Lactodicterium или Streptodacterium и мезофильных бактерий родов Streptococcus, Azotobacterium, Pseudomonas (GB, патент 2026087), применяемые для разложения навоза в среде, содержащей также источники углерода, минеральные кислоты и белки, при температурах 5-35^oС в течение 7-14 дней. Недостатком известных штаммов является применимость их только для сильно разбавленного навоза в течение длительного периода времени.

Известен штамм бактерий Erwinia species ВКПМ В-7005 (RU, патент 2103359), способный с высокой скоростью разлагать органические субстраты в растительном сырье в аэробных и анаэробных условиях, нефть и нефтепродукты в процессе очистки различных объектов от этих веществ, углеводородный субстрат с выделением большого количества газообразных продуктов.

Указанный штамм Erwinia species ВКПМ В-7005 при периодическом способе культивирования в аэробных условиях при температуре 32-36^oС и рН среды 5-7 способен полностью утилизировать загрязнения нефтепродуктами в течение 36-48 часов. Штамм также способен разлагать органический субстрат в растительном сырье, пригоден для аэробной и анаэробной обработки навоза скота и птичьего помета. На углеродном субстрате он способен синтезировать низкомолекулярные органические кислоты, альдегиды и спирты.

Недостатком указанного штамма следует признать его непригодность для очистки сильно загрязненных участков, поскольку, как указывалось выше, на углеродном субстрате штамм синтезирует низкомолекулярные органические кислоты, альдегиды и спирты, которые при накоплении в среде ингибируют процесс дальнейшей утилизации углеродного субстрата.

Техническая задача, решаемая посредством настоящего изобретения, состоит в разработке консорциума микроорганизмов, проявляющего высокую активность в процессах разложения нефти и нефтепродуктов и органического субстрата в растительном сырье и отходах животноводства при высокой концентрации органического субстрата.

Технический результат, получаемый в результате реализации изобретения, состоит в обеспечении возможности ускоренного и более полного осуществления деструкции нефти и нефтепродуктов на объектах очистки, а также осуществлении разложения органического субстрата в растительном сырье при высоком содержании указанного органического субстрата.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать консорциум бактерий Erwinia species ГСБ-ТБ 15/99 Б и Arthrobacter simplex ГСБ-ТБ 16/99 Б, взятых в соотношении от 0,1:1 до 100:1, используемый как деструктор нефтепродуктов и органического субстрата в растительном сырье и отходах животноводства и птицеводства.

Сущность настоящего изобретения состоит в выделении из природной среды (почвенной смеси) природного штамма бактерий Arthrobacter simplex и на его основе селекции нового штамма этой культуры, а также селекции нового штамма Erwinia species, ведущего родословную от штамма, выделенного из природной среды (нефтеносной породы (керна) Хадыженского месторождения), в условиях совместного культивирования с целью получения высокоактивного консорциума микроорганизмов в процессах разложения нефтепродуктов и органических субстратов в растительном сырье и отходах животноводства при высокой концентрации органического субстрата.

Селекцию нового штамма Arthrobacter simplex проводили из образца почвенной смеси, взятой вблизи нефтедобывающей скважины на границе загрязненной нефтью почвы и почвы, покрытой растительностью.

Проводили культурирование природной смеси почвенных микроорганизмов в течение 1-х суток при температуре 32^oС на среде (А), содержащей, г:
Культуральная жидкость процесса ферментации микроорганизмов Erwinia sp. - 100
Образец почвы - 1
Для получения используемой в среде (А) культуральной жидкости выращивали коллекционный штамм Erwinia species ВКПМ В-7005 в аэробных условиях в течение 2-х суток при температуре 32^oС и рН 7,0 на среде (В), содержащей, г:
Среда 9 с м/э "по Алиханяну" ГУП "ГосНИИсинтезбелок" - 100
Нефть - 1
Кукурузный экстракт - 0,1
После завершения процесса выращивания Erwinia species культуральную жидкость отделяли от основной биомассы методом центрифугирования и стерилизовали.

Из суспензии культуры Erwinia sp. делали высев на твердую питательную среду (Б) следующего состава, г:
Культуральная жидкость процесса ферментации микроорганизмов Erwinia sp. - 100
Мясопептидный бульон - 1
Агар - 1,5
Другую культуру, идентифицируемую как Arthrobacter simplex, выращивали на среде "А" и проводили высев на среду "Б". Цикл повторяли до тех пор, пока не была получена чистая культура бактерий.

Определение систематического положения отобранного штамма, проведенное в соответствии с "Определителем бактерий" (Bergey'S Manual of Systematic Bacteriology - Baltimore; Hong Kong; London; Sydney - 1984, 1986, 1989, v.1, 2, 3, 4) показало его принадлежность к Arthrobacter simplex.

Селекцию новых штаммов Erwinia species ГСБ-ТБ 15/99 Б и Arthrobacter simplex ГСБ-ТБ 16/99 Б осуществляли путем использования большого количества циклов совместного культивирования Erwinia sp. ВКПМ В-7005 и природного штамма Arthrobacter sim. на среде "В" и высева суспензии двух микроорганизмов на твердые среды, причем в каждом последующем цикле совместного культивирования относительно первоначального инокулята плавно снижали долю Arthrobacter sim. с первоначального соотношения Erwinia sp.: Arthrobacter sim.=1:1 до 100: 1, а количество субстрата (нефти) в среде "В" увеличивали с 1 до 10 мас.%.

Определение степени патогенности консорциума новых селекционированных штаммов бактерий Erwinia species ГСБ-ТБ 15/99 Б и Arthrobacter simplex ГСБ-ТБ 16/99 Б подтвердило отсутствие патогенности.

Культурально-морфологические признаки.

Культурально-морфологические признаки штамма Erwinia species ГСБ-ТБ 15/99 Б.

Erwinia species ГСБ-ТБ 15/99 Б образует на мясопептонном агаре с глюкозой и дрожжевым экстрактом 1-3 мм блестящие колонии от белого (молодая культура) до кремового цвета округлой формы с ровным краем. Клетки короткие, (0,7-1,0•1,0-2,5 мкм), подвижные палочки. При неблагоприятных условиях и при старении культура образует капсулы.

Культурально-морфологические признаки штамма Arthrobacter simplex ГСБ-ТБ 16/99 Б.

Arthrobacter simplex ГСБ-ТБ 16/99 Б образует на мясопептонном агаре с глюкозой и дрожжевым экстрактом 1-3 мм матовые морщинистые колонии кремового цвета округлой формы с ровным или фестончатым краем. Молодая культура - палочки (0,7-1,0•1,0-2,5 мкм) различной формы: прямые, изогнутые, могут образовывать v-образные фигуры. При неблагоприятных условиях и при старении культура образует капсулы.

Физиолого-биохимические признаки консорциума.

Консорциум бактерий Erwinia species ГСБ-ТБ 15/99 Б и Arthrobacter simplex ГСБ-ТБ 16/99 Б, взятых в соотношении 10-100:1, способен разлагать или трансформировать органические вещества, находящиеся в составе нефти и нефтепродуктов или растительного сырья и отходов животноводства и птицеводства. При этом консорциум способен утилизировать в периодическом процессе большее количество органического субстрата, чистая культура Erwinia species ГСБ-ТБ 15/99 Б, за счет развития на продуктах метаболизма Erwinia бактерий Arthrobacter simplex ГСБ-ТБ 16/99 Б. При образовании умеренного количества метаболитов соотношение культур в инокуляте выбирают Erw.:Arthr.=10:1. Соотношение культур в инокуляте подбирают конкретно под каждый процесс.

Предпочтительно каждую культуру консорциума хранить и накапливать отдельно.

Температурный диапазон (28-32^oС), а также показатель среды (рН 5-7) для обеих культур одинаковы.

Erwinia sp. - факультативный анаэроб, Arthrobacter sim. аэробная культура, способная работать при ограниченной концентрации кислорода.

В процессе разложения органического субстрата соотношение культур меняется в зависимости от рода углеродного субстрата и времени протекания процесса.

Обе культуры хранят в пробирках при 40^oС под маслом на мясопептонном агаре с 2% глюкозы и 0,1% кукурузного экстракта, рН 7,0.

Культуры размножают в пробирках при 30^oС на мясопептонном агаре с 2% глюкозы и 0,1% кукурузного экстракта, рН 7,0.

Для тренировки Arthrobacter simp. во все питательные среды при хранении и размножении добавляют не менее 25% культуральной жидкости процесса накопления Erwinia sp.

Консорциум может быть использован следующим образом.

Пример 1 (контрольный). Участок почвы со степенью загрязненности 45-63% (околоскважинный участок земли) обрабатывают суспензией Erwinia sp. ВКПМ В-7005. Биомассу бактерий выращивают в ферментере при температуре 32^oС и рН среды - 7,0 в питательной среде следующего состава, г/л: нефть - 40,0, меласса - 10,0, хлорид натрия - 20,0, ортофосфорная кислота - 3,0, гидроксид аммония - 4,0, хлорид калия - 0,8, сульфат магния семиводный - 0,3 и микроэлементы. После накопления биомассы ее сгущают центрифугированием и консервируют. Для приготовления рабочей суспензии микроорганизмов непосредственно перед обработкой сгущенную биомассу разводят в речной воде до концентрации клеток примерно 10⁸ кл/мл с добавлением в среду минерального удобрения (аммофоски) из расчета концентрации азота, фосфора и калия, г/л: 2,0, 1,5 и 0,7 соответственно. Над очищаемым участком растянули тент для предохранения смыва микроорганизмов дождем. Участок высушивают естественным путем до образования сверху корки, затем осторожно равномерно смачивают почву суспензией микроорганизмов из расчета 0,5 л/м². В течение 7 дней участок ежедневно поливают водой из расчета 1 л/м². Затем почву смачивают еще раз суспензией микроорганизмов в количестве 0,25 л/м² с продолжением полива водой. Через 7 дней еще раз смачивают почву суспензией микроорганизмов и продолжают поливать водой еще 7 дней. На протяжении всего процесса очистки почвы осторожно рыхлят только верхний влажный слой почвы. По мере проникновения влаги внутрь толщину взрыхляемого слоя увеличивают. Через 21 день обработки остаточная степень загрязнения составила 24%.

Пример 2. Аналогичный участок почвы обрабатывали суспензией консорциума бактерий Erwinia species ГСБ-ТБ 15/99 Б и Arthrobacter simplex ГСБ-ТБ 16/99 Б. Биомассу Erwinia species ГСБ-ТБ 15/99 Б выращивают в ферментере при температуре 32^oС и рН среды - 7,0 в питательной среде состава, г/л: нефть - 40,0, меласса - 10,0, хлорид натрия - 20,0, ортофосфорная кислота - 3,0, гидроксид аммония - 4,0, хлорид калия - 0,8, сульфат магния семиводный - 0,3 и микроэлементы. После накопления биомассы ее сгущают центрифугированием и консервируют. Биомассу Arthrobacter simplex ГСБ-ТБ 16/99 Б выращивают в ферментере при температуре 32^oС и рН среды - 7,0 в питательной среде состава, г/л: культуральная жидкость процесса ферментации микроорганизмов Erwinia sp. - 50, среда 9 с м/з "по Алиханяну" ГУП "ГосНИИсинтезбелок" - 50; меласса - 1,5. После накопления биомассы ее сгущают центрифугированием и консервируют. Для приготовления рабочей суспензии микроорганизмов непосредственно перед обработкой сгущенную биомассу Erwinia sp. и Arthrobacter simp., взятых в соотношении 100:1 соответственно, разводят в речной воде до общей концентрации клеток 10⁸ кл/мл с добавлением в среду минерального удобрения (аммофоски) из расчета концентрации азота, фосфора и калия, г/л: 2,0, 1,5 и 0,7 соответственно. Далее проводят обработку участка, как в примере 1. Конечная остаточная степень загрязнения составляет 6%. Этот показатель в 4 раза меньше, чем в примере 1, т.е. степень очистки в 4 раза выше.

Пример 3. Проводят процесс получения биоудобрения из отходов лесотехнического и сельского хозяйства. Смесь опилок, стружек, коры, листьев, стеблей и корней, а также бумаги. Подсушивают, измельчают, пропаривают, заливают стоками животноводческих и птицеводческих комплексов, подкисляют серной кислотой до рН 2-4, выдерживают сутки. Подщелачивают раствором аммиака до рН 5-7 и вносят суспензию консорциума микроорганизмов Erwinia species ГСБ-ТБ 15/99 Б и Arthrobacter simplex ГСБ-ТБ 16/99 Б, взятых в соотношении 10:1 соответственно, в количестве 5 об.% к объему обрабатываемого материала при концентрации клеток в суспензии 10⁸ кл/мл. Полученную массу обрабатывают в течение 3-х суток при температуре 28-30^oС в аппарате при механическом перемешивании и подаче воздуха 0,2-0,5 об/об•мин. После завершения обработки масса содержит, мас. % к сухим веществам: азот общий - не менее 4, фосфор общий - не менее 1,5, калий общий - не менее 1,0, углерод общий - не менее 40. Содержание влаги - 50-70%. Полученную массу используют как самостоятельное удобрение.

Приведенные примеры подтверждают получение указанного технического результата.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в биотехнологии и сельском хозяйстве для разложения нефтепродуктов и органического субстрата в растительном сырье и отходах животноводства. Консорциум содержит бактерии Erwinia species ГСБ-ТБ 15/99 Б и Arthrobacter simplex ГСБ-ТБ 16/99 Б, взятые в соотношении от 0,1:1 до 100:1. Данный консорциум эффективен при приготовлении удобрения аэробной и анаэробной переработкой навоза скота, птичьего помета, а также при очистке объектов от нефтепродуктов. Консорциум благоприятно воздействует на почву и экологически важные биоценозы.

Консорциум штаммов бактерий Erwinia species ГСБ-ТБ 15/99 Б и Arthrobacter simplex ГСБ-ТБ 16/99 Б, взятых в соотношении от 0,1: 1 до 100: 1, - деструктор нефтепродуктов и органического субстрата в растительном сырье и отходах животноводства и птицеводства.