ШТАММ БАКТЕРИЙ ERWINIA SPECIES ВКПМ В-7005 - ДЕСТРУКТОР НЕФТЕПРОДУКТОВ И ОРГАНИЧЕСКОГО СУБСТРАТА В РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ И ОТХОДАХ ЖИВОТНОВОДСТВА Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/18 

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в нефтедобывающей отрасли для увеличения нефтеотдачи нефтяных пластов микробиологическими методами, биотехнологии, сельском хозяйстве для разложения органических субстратов в растительном сырье и отходах животноводства, например, для аэробной и анаэробной переработки навоза, птичьего помета, в любых областях деятельности человека для очистки объектов от нефтепродуктов.

Известны штаммы микроорганизмов, применяемые для увеличения нефтеотдачи нефтяных пластов микробиологическими методами.

Например, известен способ [1] закачки в пласт суспензии культуры бактерий p.Clostridium. В пласт вводят смесь адаптированных микроорганизмов, затем 2,5% раствор мелассы с солями полифосфатов и содой, которые растворяют в смеси пресной и пластовых вод в соотношении 1:10. При этом на керновых моделях наблюдают увеличение нефтеотдачи на 16.5 - 47,5%, а увеличение добычи нефти на скважине в 3 раза (от 50 до 150 т/сут.) при снижении степени обводненности с 80 до 60%.

Недостатком этого способа является то, что показатели процесса нефтедобычи, приведенные в описании данного способа, взаимно не увязаны. Увеличение добычи нефти на скважине - в три раза, а увеличение нефтеотдачи в керновых моделях всего на 16,5-47,5%, что показывает на весьма незначительный эффект этого способа. Можно предположить, что увеличение добычи нефти на скважине было достигнуто лишь в кратковременный начальный период после применения способа.

Известны штаммы микроорганизмов - деструкторы нефтепродуктов, используемые для очистки каких-либо объектов от нефти и ее продуктов.

Например, в [2] для очистки воды и почвы используют штамм бактерий Pseudomonas putida - 36, который позволяет утилизировать до 75% нефти при содержании нефти к объему загрязненного субстрата (почвы, воды) до 10%. Недостатком этого способа является очистка только незначительно загрязненных объектов.

Известны штаммы микроорганизмов, используемые в биотехнологии, сельском хозяйстве для разложения органических субстратов в растительном сырье и отходы животноводства.

Например, в [3] используют термофильные, бактерии рода Lactouticterium или Streptouacterium мезофильные бактерии родов Streptococcus, Azotobacterium, Pseudomonas для разложения навоза на среде, содержащей также источники углерода, минеральные кислоты и белки, при температурах 5-35^oC в течение 7-14 дней. Недостатком данного способа является обработка сильно разбавленного навоза в течение длительного периода времени.

Техническая задача, решаемая посредством настоящего изобретения, состояла в выделении из природной среды (нефтеносной породы, керна, Хадыженского месторождения Грозненского нефтедобывающего предприятия (НДП)) и селекции в процессах переработки навоза, птичьего помета в анаэробных и аэробных условиях, разложения нефти и нефтепродуктов при очистке объектов от нефтепродуктов, в модельных опытах по увеличению нефтеотдачи нефтеносной породы штамма, способного с высокой скоростью разлагать органические субстраты в растительном сырье и отходах животноводства в аэробных и анаэробных условиях, нефть и нефтепродукты в процессе очистки различных объектов от этих веществ, углеводородный субстрат с выделением большого количества газообразных продуктов.

Технический результат, получаемый в результате реализации изобретения, заключается в возможности осуществлять с большой скоростью и высоким выходом процессы деструкции нефти и нефтепродуктов на объектах, подлежащих очистке от этих продуктов, процессы разложения органического субстрата в растительном сырье и отходах животноводства достигать устойчивого высокого результата при увеличений нефтедобычи нефтеносных пластов, причем не только методом зводнения пластов суспензией микроорганизмов, но и методом очистки нефтеносных скважин.

Предлагаемый новый штамм микроорганизмов Erwinia species 206-B 1 получен методом последовательного выделения его из ассоциации микроорганизмов, полученных в результате культивирования их в периодических аэробных и анаэробных условиях (В) в течение 2-х суток при температурах 32^oC на среде следующего состава (А), г/л:
нефтеносная порода (керн) - 10: глюкоза - 10: нефть 10; среда М 9 с м/з "П" института "ГосНИИсинтезбелок" Выделение нового штамма бактерий проводили путем многократного высева ассоциации микроорганизмом, полученной на выше приведенной жидкой среде в процессе культивирования, на твердые среды (сусло-агар и мясопептонный агар), разделения колоний микроорганизмов, дальнейшего культивирования колоний на вышеприведенной жидкой среде (А) в выше приведенных условиях (Б) и последующего высева на твердые среды и т.д.

Определение систематического положения отобранного штамма, проведенное в соответствии с "Определителем бактерий" Берги (Bergy'S Vfnual of Systematic Bacteriology-Baltimore: Hong Kong: London. Sidney - 1984, 1986, 1989. v. 1.2.3.4.) показало его принадлежность к Erwinia species.

Определение степени патогенности выделенного и селекционированного штамма Erwinia species 206-B1 подтвердило отсутствие патогенности. Характеристика штамма бактерий Erwinia species 206 B 1.

Состав среды N 9 с м/э "П", г/л: NH₄•H₂PO₄ - 10; K₂HPO₄•10; MgSO₄•7H₂O - 0,7; NaCl - 10; мг/л: F₂So₄ - 15; MnSO₄ - 15; ZnSO₄ -15; pH= 6,7-7.0
Культурально морфологические признаки.

Erwinia spesies 206 - B1 образует колонии на мясо-пептонном агаре с глюкозой и дрожжевым экстрактом 1-3 мм округлой формы с ровным или фестончатым краем, блестящие до матовых, выпуклые или плоские, от бесцветных в молодом возрасте до желто-коричневых. Клетки короткие, (0,7-1,0 x 1,0-2,5 мкм), подвижные в первые часы роста палочки.

Физиолого биохимические признаки.

Штамм Erwinia spesies 206 - B1 при периодическом способе культивирования в аэробных условиях при температуре 32-36^oC и pH=5-7 полностью утилизирует нефтепродукты в течение 36-48 ч.

Разлагает органический субстрат в растительном сырье, например, пригоден для аэробной и анаэробной обработки помета и навоза.

На углеродном субстрате синтезирует низкомолекулярные кислоты, альдегиды, спирты.

Хранится в пробирках при 4^oC под маслом на мясо-пептонном агаре с 2% глюкозы и 0,1% кукурузного экстракта, pH = 7,0.

Размножается в пробирках при 30^oC на мясо-пептонном агаре с 2% глюкозы и 0,1% кукурузного экстракта, pH=7.

Выделенный новый штамм микроорганизмов селекционировали в процессах переработки навоза, птичьего помета в анаэробных и аэробных условиях, разложения нефти и нефтепродуктов при очистке объектов от нефтепродуктов, в модельных опытах по увеличению нефтеотдачи нефтеносной породы.

Процесс переработки навоза и птичьего помета проводили на лабораторной установке при механическом перемешивании обрабатываемого материала и (в аэробных условиях) подаче воздуха в систему. Обрабатываемый материал (навоз или помет) загружали в аппарат, нейтрализовали раствором ортофосфорной кислоты до pH = 7,0, стерилизовали в течение 1 ч при температуре 130^oC и 1 атм и в стерильных условиях вносили в аппарат 1% масс. от массы обрабатываемого материала культуры нового штамма. Обработку материала проводили при температуре 32^oC в течение 48 ч, после чего обрабатываемый материал в количестве 1% масс. загружали в питательную среду вышеприведенного состава (А), культивировали штамм при вышеописанных условиях (Б), высевали на твердые среды, проверяли на монокультуру, и в следующем опыте аппарат засевали культурой штамма, выращенной на жидкой среде A. Опыты повторяли таким образом до тех пор, пока за 48 ч процесса не была достигнута полная необходимая переработка навоза или помета.

Процесс разложения нефти и нефтепродуктов проводили при очистке образцов почвы (суглинка), взятых около добывающих скважин с разной глубины почвы Актюбинского НДП, загрязненных в разной степени нефтью. Образцы загружали в аппарат, смачивали их растворами сернокислого аммония и однозамещенного фосфорнокислого калия таким образом, чтобы концентрация азота, фосфора и калия в образцах были, соответственно, равны: 1,0; 0,6; 0,2 г/г почвы. Стерилизовали в течение 1 ч при температуре 130^oC и 1 атм и в стерильных условиях вносили в аппарат 1% масс. от массы обрабатываемого материала культуры нового штамма. Обработку материала проводили при температуре 34-36^oC в течение 7 суток при постоянной влажности материала (75 %) и постоянной концентрации азота, фосфора и калия при механическом перемешивании материала, после чего обрабатываемый материал в количестве 1% масс. загружали в питательную среду вышеприведенного состава (А), культивировали штамм при вышеописанных условиях (Б), высевали на твердые среды, проверяли на монокультуру, и в следующем опыте аппарат засевали культурой штамма, выращенной на жидкой среде A. Опыты повторяли таким образом до тех пор, пока за 7 суток процесса не была достигнута очистка образцов на уровне 80-90 % от начального загрязнения.

Модельные опыты по увеличению нефтеотдачи нефтеносной породы проводили следующим образом. В специальном аппарате трубку, имитирующую добывающую скважину, обрабатывали тяжелыми фракциями нефти (парафинистыми и смолисто-асфальтеновыми) так, чтобы объем пор в породе, заполняющей трубку, снизился до 10% от общего объема. При начальных физических параметрах в аппарате, имитирующем нефтеносный пласт: температура - 45^oC и давление -10 МРа, отбор нефти из трубки равен был 9 мл/мин. Затем на смеси водопроводной и пластовой воды, взятых в соотношении 1:1 приготавливали 1% суспензию нового штамма, куда добавляли, г/л: гидролизат кукурузной кочерыжки с содержанием cахаров 40% - 120,0; азотнокислый аммоний - 2,0; однозамещенный фосфорнокислый калий - 1,0; сернокислый магний семиводный - 0,2. Приготовленную биологически-активную среду закачивают в породу трубки, имитирующей добывающую скважину и выдерживали ее там 360 час. (Все операции и весь процесс проводили в стерильных условиях) Затем трубку вскрывали и замеряли отбор нефти. После чего породу из трубки в количестве 1% масс. загружали в питательную среду вышеприведенного состава (А), культивировали штамм при вышеописанных условиях (Б), высевали на твердые среды, проверяли на монокультуру, и в следующем опыте аппарат засевали культурой штамма, выращенной на жидкой среде A. Опыты повторяли таким образом до тех пор, пока за 360 ч процесса не была достигнута необходимая очистка породы в трубке и необходимое увеличение порового объема и, следовательно, пока не было получено необходимое увеличение отбора нефти из трубки.

Данное изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами
Пример 1. В специальном аппарате, моделирующем добычу нефти из нефтеносного пласта, трубку, имитирующую добывающую скважину, обрабатывали тяжелыми фракциями нефти (парафинистыми и смолисто-асфальтеновыми) так, чтобы объем пор в породе, заполняющую трубку, уменьшился до 10% от начального объема. При начальных физических параметрах в пласте: температура -35^oC и давление -10 МРа, отбор нефти из трубки 1 при этих условиях был равен 9 мл/мин. Приготавливали рабочую суспензию бактерий p.Erwinia spesies ВКПМ B-7005. Для этого накапливали биомассу бактерий в ферментере при температуре 32^oC и pH среды - 7,0 в питательной среде следующего состава, г/л: нефть - 40,0; меласса - 10,0; хлористый натрий - 20,0;фосфорная кислота - 3.0; гидроокись аммония - 4.0; хлористый калий 0,8; сернокислый магний семиводный - 0,3;, микроэлементы. После накопления биомассы ее отделяли от жидкой фазы центрифугированием, консервировали и затем разводили в смеси водопроводной и пластовой воды, взятых в соотношении 1:1. В полученную рабочую суспензию добавляли, г/л: гидролизат кукурузной кочерыжки с содержанием cахаров 40% - 120,0; азотнокислый аммоний - 2,0; однозамещенный фосфорнокислый калий - 1,0; сернокислый магний семиводный - 0,2. Приготовленную биологически-активную среду закачивали в породу трубки и выдерживают там 360 час. Затем трубку вскрывали и замеряли отбор нефти, который был равный 24 мл/мин., т.е. эффект от применения способа в этом случае был равен 167%.

Пример 2. Участок, загрязненный нефтью на 20% почвы, например, суглинок обрабатывали суспензией бактерий Erwinia spesies ВКПМ В-7005. Суспензию микроорганизмов приготавливали также, как в примере 1, только микроорганизмы разводили речной водой в количестве 5 г/л, а также вносили туда аммонийную селитру из расчета 1,5 г/л, суперфосфат из расчета 1,0 г/л, хлористый калий из расчета 0,2 г/л и хлористый магний из расчета 0,05 г/л (источники азота, фосфора и калия можно заменить эквивалентным количеством комплексного удобрения - аммофоски). Почву поливали суспензией микроорганизмов в количестве на 1м почвы 1л суспензии, а затем взрыхляли. В течение 15 суток почву поливали либо водой, либо раствором выше перечисленных солей (в зависимости от текущей концентрации азота и фосфора в почве) и взрыхляли. Спустя 15 суток определяли степень загрязнения почвы, равную 2,7%.

Пример 3. Процесс переработки навоза КРС проводили на лабораторной установке при механическом перемешивании обрабатываемого материала и подаче воздуха в систему. Обрабатываемый материал загружали в аппарат, нейтрализовали раствором ортофосфорной кислоты до pH = 7,0 и вносили в аппарат I% масс. от массы обрабатываемого материала культуры Erwinia spesies. Обработку материала проводили при температуре 34-36^oC в течение 48 ч. и последующем высушиванием при температуре 80^oC в течение 5 ч. Получали материал со следующими характеристиками: pH - 6,5 - 7,5; содержание, %: влаги - 14; азота (общего) - 5,0; азота (аммонийного) -0,7; фосфора - 0,5; калия - 1,5; углерода (общего) - 28; в т.ч. гуминовых кислот - 6,0; БПК₅ - 550 ед; патогенные микроорганизмы - отсутствуют; яйца и личинки гельминтов (жизнеспособные) - отсутствуют; резкий специфический запах - отсутствует; хорошая сыпучесть, отсутствие крупных комков (не более 5 мм).

Литература:
1. Microbial enhancement of oil recovery from carbonate reser -
voirs with complex formation characteristics/ Wagner M.//Microbial Enhanc. Oil Recovery Recent Adv.: Proc. Int. Conf., Norman, Okla, 1990 - Amsterdam, 1991.

2. А. С. СССР N 1076446. Штамм Pseudomonas putida-36, используемый для очистки воды и почвы от нефтепродуктов.

3. Патент Великобритании N 2026087. Корм для животных, полученных микробиологическим способом.

Использование: изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в нефтедобывающей отрасли для увеличения нефтеотдачи нефтяных пластов микробиологическими методами, биотехнологии, сельском хозяйстве для разложения органических субстратов в растительном сырье и отходах животноводства, например, для аэробной и анаэробной переработки навоза, птичьего помета, в любых областях деятельности человека для очистки объектов от нефтепродуктов. Сущность изобретения: новый штамм бактерий Erwinia species ВКПМ В - 7005 выделен из природной среды (нефтеносной породы, керна, Хадыженского месторождения Грозненского нефтедобывающего предприятия (НДП) и селекционирован в процессах переработки навоза, птичьего помета в анаэробных и аэробных условиях. Данный штамм способен с высокой скоростью разлагать органические субстраты в растительном сырье и отходах животноводства в аэробных и анаэробных условиях, нефть и нефтепродукты в процессе очистки различных объектов от этих веществ, углеводородный субстрат с выделением большого количества газообразных продуктов.

Штамм бактерий Erwinia species ВКПМ В-7005 деструктор нефтепродуктов и органического субстрата в растительном сырье и отходах животноводства.