СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТАБЛЕТИРОВАННОЙ ФОРМЫ ПРЕПАРАТА-ПРОБИОТИКА Российский патент 2002 года по МПК A61K35/74 A61K9/20 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству биопрепаратов-пробиотиков.

В настоящее время существует целый ряд биопрепаратов из бактерий рода Bacillus, подавляющих рост патогенных и условно-патогенных бактерий: биоспорин, бактиспорин, бактисубтил и др. Их терапевтическая эффективность определяется комплексным действием широкого набора метаболитов, которые способны продуцировать живые микробные клетки штаммов бактерий, входящих в состав препаратов.

Изучение механизма лечебно-профилактического действия препаратов-пробиотиков на организм человека и животных показывает, что бациллы обладают способностью проникать из желудочно-кишечного тракта (жкт) в кровь, а оттуда в очаг поражения, сохранять жизнеспособность, продуцировать антибиотики, протеолитические ферменты и иммуномодуляторы. Установлено, что после перорального приема, уже в первые минуты через слизистые ротоглотки, пищевода и желудка примерно 0,1% от общего числа бактерий проникают в паренхиматозные органы - бессимптомная транслокация микроорганизмов, она длится 6-8 часов после однократного приема препарата до элиминации микробных клеток из органов, во время которой и осуществляется воздействие препарата на организм (1).

Антагонистическое действие бацилл осуществляется за счет продукции различных по природе биологически-активных веществ: полипептидных антибиотиков, лизоцима, литических ферментов (2). Высокая ферментативная активность бацилл имеет положительное значение с точки зрения обогащения желудочного секрета дополнительными, в том числе парадигестативными ферментами (3, 4). Бациллы не формируют биопленок, поскольку их адгезивные свойства слабо выражены. Их активность осуществляется в просвете жкт и связана прежде всего не с конкурентными взаимоотношениями за места прикрепления к слизистой, а с высокой антагонистической активностью в отношении патогенных микроорганизмов, без антагонистического действия на представителей нормальной микрофлоры, что создает условия для бесконкурентного восстановления аутофлоры (2).

Известен способ получения препарата "Бактиспорин" на основе штамма Bacillus subtilis 3 Н (ГИСК N 248), включающий культивирование штамма в жидкой питательной среде, отделение биомассы от питательной среды ультрафильтрацией, концентрирование и лиофильное высушивание (5).

Ближайшим аналогом изобретения является лечебно-профилактический биопрепарат "Бактиспорин" на основе антагонистически активного штамма В. subtilis 3H, предусматривающий получение биомассы штамма, смешивание ее с защитной средой (сахарозожелатиновой смесью или лактозой), ампулирование и лиофильное высушивание (6). Препарат применяют для лечения широкого круга заболеваний и перед употреблением ампулу вскрывают, сухую биомассу растворяют в небольшом количестве воды и используют перорально в виде раствора. Поскольку штамм, входящий в состав Бактиспорина, является строгим аэробом, то осуществлять свою жизнедеятельность он может только в верхних отделах жкт, где есть аэробные условия. Поэтому обосновано пероральное применение препарата без помещения его в капсулы или покрытия, устойчивые к растворению в верхних отделах жкт (ротовой полости, пищеводе и желудке).

Однако ампульная форма препарата "Бактиспорин" требует разведения водой перед применением, что снижает удобство употребления и ограничивает покупательский спрос. Кроме того, при вскрытии ампулы требуется осторожность для предотвращения попадания ампульного стекла в препарат.

Задачей изобретения является разработка способа получения таблетированной формы препарата-пробиотика, предназначенного для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека.

Технический результат заключается в получении более удобной формы препарата, способной растворяться в верхних отделах жкт, при сохранении его лечебно-профилактических и антагонистических свойств.

Для достижения указанного технического результата в способе получения таблетированной формы биопрепарата на основе Bacillus subtilis производственный штамм В. subtilis 3H культивируют на питательной среде, обеспечивающей образование спор, отделяют биомассу от питательной среды и концентрируют методом микрофильтрации, смешивают ее со стабилизаторами - сахарозо-желатиновой средой или лактозой, вносят глюконат кальция в количестве от 1,0-10,0 мас.% для придания биомассе необходимых физических свойств и высушивают лиофильно в кассетах. При необходимости можно смешивать готовую биомассу с сорбентом (например: активированным углем, карболонгом, лактулозой, ацетилфталилцеллюлозой, гелем фосфата алюминия) в соотношении 1:1 по сухому остатку, после чего жидкость отделяют фильтрацией и высушивают микрогранулы иммобилизованной биомассы вакуумной сушкой до остаточной влажности 8-10%.

После высушивания биомассу смешивают со вспомогательными веществами в соотношении 2:1-3:1 и таблетируют. В качестве вспомогательных веществ используют стеарат кальция, тальк, и(или) крахмал, и(или) аэросил, глюкозу, сухое молоко и(или) метилцеллюлозу.

В результате изобретения получают таблетированную форму препарата, удобную в употреблении, обеспечивающую проявление лечебно-профилактических свойств препарата в верхних отделах жкт. Используемые для получения таблетированной формы вспомогательные вещества добавляют в следующем количестве, мас. ч. : стеарат кальция - 0,5-1,0, тальк - 2,5-3,0, и(или) крахмал - 0,5-1,0, и(или) аэросил - 0,5-0,8, глюкозу - 5,0-20,0, сухое молоко - 10,0-30,0, и(или) метилцеллюлозу - 0,1-0,5.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамм В. subtilis 3H культивируют в жидкой питательной среде, обеспечивающей спорообразование в течение 16 часов. Полученную биомассу отделяют от питательной среды и концентрируют с помощью микрофильтрации до содержания микробных клеток 100•10⁹ кл/мл по ОСО на 10 ЕД. К биомассе добавляют стабилизатор на основе сахарозо-желатиновой среды или лактозы и вносят глюконат кальция в количестве 2,0 мас.%, перемешивают и высушивают в кассетах лиофильным способом. По окончании сушки биомассу измельчают до получения однородной массы, добавляют вспомогательные вещества и таблетируют при следующем соотношении, мас. ч.:
Сухая биомасса - 50,0
Стеарат кальция - 0,8
Тальк - 2,5
Глюкоза - 5,0
Сухое молоко - 10,0
Метилцеллюлоза - 0,1
Готовые таблетки имеют круглую форму диаметром 0,8-1 см с гладкой твердой поверхностью беловато-серого цвета, сладковатые на вкус. Средняя масса таблетки составляет 0,22±0,02 г с остаточной влажностью не более 5%. Таблетки растворяются в 0,1 н. НСl и нейтральных растворах в течение 45 мин с образованием рыхлого комковатого осадка. Готовые таблетки содержат биомассу штамма В. subtilis в количестве (1-5)(10⁹ КОЕ (колониеобразующих единиц).

Пример 2. Штамм В. subtilis 3H культивируют в жидкой питательной среде, обеспечивающей спорообразование в течение 20 часов. Полученную биомасу отделяют от питательной среды и концентрируют с помощью микрофильтрации до содержания микробных клеток (70-100)•10⁹ кл/мл по ОСО на 10 ЕД. Концентрат биомассы смешивают с 10% раствором ацетилфталилцеллюлозы (АФЦ) в органическом растворителе в соотношении биомасса:АФЦ - 1:1 или 2:1 при непрерывном перемешивании.

Полученные микрогранулы отфильтровывают и сушат в вакуумной установке под вакуумом 0,01 мм рт.ст. при температуре не выше 40^oС в течение 10-12 ч до остаточной влажности 8-10%. Количество жизнеспособных бактерий (КОЕ) в 0,1 г микрогранулированной биомассы (5-40)•10⁹ КОЕ.

Далее гранулы смешивают со вспомогательными веществами и таблетируют при следующем соотношении, мас.ч.:
Сухая биомасса - 100,0
Стеарат кальция - 1,0
Тальк - 2,0
Крахмал - 0,5
Аэросил - 0,5
Глюкоза - 20,0
Сухое молоко - 26,0
Литература
1. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А. Дискуссионные вопросы создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры теплокровных // Микробиол.ж. 1992. -T.54, N6. -С. 82-92.

2. Сорокулова И. Б. Перспективы применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых биопрепаратов // Антибиотики и химиотерапия. - 1996. -T.41, N10. -C. 13-15.

3. Слабоспицкая А.Т., Пирог Т.П., Гринберг Т.А. и др. Влияние некоторых компонентов среды бактерий рода Bacillus на процессы синтеза экзополисахаридов // Контроль и управление биотехнологическими процессами: Тез. докл. Всесоюзн. конф. - Горький, 1985. - С. 33.

4. Слабоспицкая А.Т., Крымовская С.С., Резник С.Р. Ферментативная активность бацилл, перспективных для включения в состав биопрепаратов // Микробиол. ж. -1990. - N2. - С. 9-14.

5. Михайлова Н.А., Кузнецова Т.Н., Кунягина О.В. / Штамм Bacillus subtilis 3Н, несущий свойство антибиотикорезистентности // Патент N 2067616 RU, C 12 N 1/20, опубл. 10.10.96.

6. Михайлова Н.А., Кузнецова Т.Н., Кунягина О.В. / Лечебно-профилактический препарат Бактиспорин // Патент N 2130316 RU, A 61 К 35/74, опубл. 20.05.99.0

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству биопрепаратов-пробиотиков. Производственный штамм В. subtilis 3H культивируют на питательной среде и концентрируют на питательной среде, обеспечивающей образование спор, отделяют биомассу от питательной среды и концентрируют методом микрофильтрации. Концентрат смешивают со стабилизаторами, вносят глюконат кальция в количестве от 1,0-10,0 мас.% для придания биомассе необходимых физических свойств и высушивают лиофильно в кассетах. При необходимости можно смешивать готовую биомассу с сорбентом в соотношении 1:1 по сухому остатку, после чего жидкость отделяют фильтрацией и высушивают микрогранулы иммобилизованной биомассы вакуумной сушкой до остаточной влажности 8-10%. После высушивания биомассу смешивают со вспомогательными веществами в соотношении 2:1-3:1 и таблетируют. В качестве вспомогательных веществ используют стеарат кальция, тальк, и(или) крахмал, и(или) аэросил, глюкозу, сухое молоко и(или) метилцеллюлозу. В результате изобретения получают таблетированную форму препарата, удобную в употреблении, обеспечивающую проявление лечебно-профилактических свойств препарата в верхних отделах жкт. 3 з.п. ф-лы.

1. Способ получения препарата-пробиотика на основе Bacillus subtilis, включающий культивирование в жидкой питательной среде, отделение биомассы с последующим концентрированием, добавление стабилизаторов на основе сахарожелатиновой среды или лактозы и высушивание, отличающийся тем, что перед высушиванием в биомассу дополнительно вносят глюконат кальция в количестве 1-10 мас. % или смешивают биомассу с сорбентом, подвергают высушиванию, вносят вспомогательные вещества и таблетируют. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют активированный уголь, карболонг, лактулозу, ацетилфталилцеллюлозу или гель фосфата алюминия и после смешивания биомассы с сорбентом, полученные микрогранулы сушат методом вакуумной сушки. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биомассу и вспомогательные вещества берут в соотношении 2: 1-3: 1. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве вспомогательных веществ используют стеарат кальция, тальк, и (или) крахмал, и (или) аэросил, глюкозу, сухое молоко и (или) метилцеллюлозу.