ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS, ОБЛАДАЮЩИЙ ШИРОКИМ СПЕКТРОМ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И УСТОЙЧИВОСТЬЮ К АНТИБИОТИКАМ Российский патент 2001 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/125 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой новый штамм бактерии из рода Bacillus, являющийся антагонистом по отношению к ветеринарным штаммам болезнетворных микроорганизмов родов: Streptococcus, Esherichia coil, Pseudomonas, Sthaphilococcus, Proteus, Shigella, Hexaera и широкой устойчивостью к антибиотикам.

В настоящее время препараты-пробиотики из бактерий рода Bacillus находят широкое применение в ветеринарии для лечения различных заболеваний птиц и сельскохозяйственных животных, поскольку подавляют развитие патогенных бактерий: БЦЛ (бактоцеллолактин), субалин, споролакт [1-3]. Препараты пробиотики на основе бактерий рода Bacillus обладают широким антагонизмом в отношении патогенных бактерий и грибов, однако редко отмечается антагонизм в отношении Pseudomonas aeruginosa и Proteus vulgaris [4].

Основной недостаток этих препаратов - низкая биологическая эффективность в отношении штаммов Pseudomonas, Streptococcus, невозможность сочетанного использования с антибиотиками при тяжелых формах, инфекции. Для лечения людей и животных: уже созданы препараты из бацилл, обладающие антибиотикоустойчивостью, что позволяет их использовать на фоне антибиотикотерапии в целях предотвращения развития дисбактериоза [5, 6].

Наиболее близким к изобретению является рекомбинантный штамм В. subtilis ВКПМ-4759, обладающий широким спектром антагонистической активности в отношении условно-патогенных микроорганизмов, но низкой активностью в отношении Pseudomonas aeruginosa (4-6 мм задержки роста тестовых штаммов) и не задерживающий рост Escherihia coli и Streptococcus, которые часто являются причиной заболеваний сельскохозяйственных животных [2].

Целью изобретения является новый штамм бактерий рода Bacillus, обладающий более широким спектром антагонистической активности, в том числе к штаммам родов Pseudomonas, Streptococcus, Escherihia coli и устойчивый к антибиотикам. Это позволяет конструировать на его основе препарат-пробиотик для лечения тяжелых форм инфекции при одновременной антибиотикотерапии.

Штамм выделен из зоокомпоста в Уфимском районе республики Башкортостан. Штамм В. subtilis 12 В-ДЕП депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ. Идентификацию штамма проводили по "Определителю бактерий Берджи" М. Мир, 1997.

В. subtilis - грамположительные аэробные палочки, продуцирующие каталазу, плохо спорулирующие. На сусло-агаре, агаризованной среде Гаузе N 2 образуют выпуклые, матовые, круглые, мелкие колонии, от 0,2-0,7 мм в диаметре с волнистым прозрачным краем, плотно прилегающие к питательной среде. На МПА рост плохой.

В мазках из колоний, выросших на Гаузе N 2 через 24 часа обнаруживаются прямые палочковидные клетки мелкие и тонкие, одиночные и в цепочках, встречаются единичные споры после 48 часов роста. На МПБ культура образует гомогенную муть и придонный осадок, пленки не образует.

Не растет в анаэробных условиях, гидролизует мочевину и крахмал, разжижает желатину. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра. Ферментирует глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннит, лактозу. Редуцирует нитраты. Продуцирует каталазу, протеазу, липазу. Не обладает лецитиназной активностью. Образует аммиак и сероводород, не образует индол. Обладает подвижностью.

Культура штамма B. subtilis 12 B была проверена на безвредность (вирулентность, токсичность и токсигенность).

Для исследования вирулентности штамм выращивали на мясопептонном arape в течение 24 часов при температуре 37^oC. Выросшую биомассу смывали 0,9%-ным раствором натрия хлорида и готовили бактериальные суспензии с концентрацией клеток от 0,5 до 5,0 млрд в мл. Полученные суспензии вводили белым беспородным мышам массой (16±1) г двумя способами: однократно внутрибрюшинно и перорально в течение 5 дней. Результаты испытаний представлены в таблице 1.

С целью более полного изучения безопасности штамма при пероральном введении, были испытаны высокие дозы штамма при разовом пероральном введении мышам (таблица 2). Установлено, что разовое введение peros высоких доз штамма - (10-20)•10⁹ кл/мл приводит к некоторому снижению веса животных на первые сутки после введения, но в последующие дни вес животных восстанавливается.

Для исследования токсичности (табл. 3) штамм выращивали на мясопептонном агаре в течение 24 часов при 37^oC, смывали 0,9%-ным раствором хлорида натрия, готовили суспензию, содержащие от 1,0 до 5,0 млрд клеток в 1 мл, которые затем инактивировали прогреванием при 100^oC в течение 1 часа. Суспензии вводили способами, описанными при изучении вирулентности.

Для изучения токсигенности (табл. 4) штамм выращивали в течение 10 суток на мясопептонном бульоне при температуре 37^oC. По истечении срока культуральную жидкость центрифугировали при 8000 об/мин в течение 30 мин. Для введения мышам использовали надосадочную жидкость. Контролем служила группа мышей, получавших стерильный мясопептонный бульон.

Наблюдения за животными проводили на протяжении 5 суток после окончания курса инъекций или перорального введения. В этот период все животные оставались активными, хорошо поедали пищевые рационы, прибавляли в весе, физиологические отправления и поведенческие реакции у них не изменялись. Полученные данные свидетельствуют о безопасности штамма.

Для определения специфической активности исследовали антагонистическую активность штамма в отношении тест культур. Исследование осуществляли методом отороченного антагонизма. Для этого культуру штамма высевали петлей в центре чашки Петри с агаризованной средой Гаузе N 2. Посевы инкубировали в термостате при 37^oC в течение 72 часов. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18 ч инкубирования при 37^oC по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе N2 без культуры исследуемого штамма. Полученные данные результатов испытания представлены в таблице 5.

Культура штамма характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Определение чувствительности штамма к антибиотикам изучали диско-диффузионным методом, используя стандартные диски, пропитанные антибиотиками. Штамм высевали на агаризованную питательную среду и раскладывали диски с антибиотиками, по 5 на чашку Петри. Посевы инкубировали при 37^oC в течение 24 ч. Чувствительность культур к антибиотикам выражали в мм диаметра зон задержки роста. Резистентными считали штаммы, зоны задержки роста которых составили - (0-5) мм; малочувствительными (6-10) мм чувствительными - (11-20) мм; высокочувствительными - более 22 мм [7]. Результаты исследования представлены в таблице 6.

Из данных таблицы следует, что штамм В. subtilis 12B обладает широкой устойчивостью к антибиотикам, в том числе: линкомицину, тетрациклину, мономицину, полимиксину, оксациллину, стрептомицину, ампицилину, бензилпенициллину.

Таким образом, выделен новый штамм В. subtilis 12В, являющийся антагонистом по отношению к ветеринарным штаммам болезнетворных микроорганизмов родов: Streptococcus, Esherichia coli, Pseudomonas, Sthaphilococcus, Proteus, Shigella, Hexaera, обладающий широкой устойчивостью к антибиотикам, что создает возможность конструирования на его основе препаратов-пробиотиков для сочетанного использования с антибиотиками.

Источники информации
1. Ивановский А. А., Вепрева Н.С., Зимирева В.В., Лагунова О.П. Способ получения пробиотика для ветеринарии / RU Патент N 2084233, опубл. 20.07.97. Бюл N 20, A 61 K 35/66.

2. Смирнов В.В., Резник С.P., Сорокулова И.Б. и др. Профилактический биопрепарат субалин /RU Патент N 2035185, опубл. 31.01.92. Бюл. N 14, A 61 K 35/66.

3. Резник С.Р.. Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А. и др. Профилактический биопрепарат споролакт //Патент N 2035186. RU. A 61 K 35/56, опубл. 20.05.95. Бюл. N 14.

4. Блинкова Л. П., Семенова С.А., Бутова Л.Г., и др. Антагонистическая активность свежевыделенных штаммов бактерий рода Bacillus //ЖМЭИ. -1994. -N 5. - С. 71-75.

5. Буланцев А.Л., Тихонов Н.Г., Липницкий А.В. Штамм Bacillus subtilis PAC, резистентный к рифампицину, ампициллину и стрептомицину, обладающий антибактериальной активностью по отношению к патогенным видам микроорганизмов //Пат. РФ N 2115725, C 12 N 1/20. - Опубл. 20.07.98. Бюл. N 20.

6. Жирков И. Н., Братухин И.И. Применение пробиотика РАС для коррекции дисбактериоза у телят //Ветеринария. -1999. -N 4. -С. 40-42.

7. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам обследования. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. -М.: Медицина, 1982. -С. 180.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при получении препаратов-пробиотиков для лечения гнойно-воспалительных заболеваний и диспепсий. Штамм Bacillus subtilis 12В выделен из зоокомпоста, характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении ветеринарных штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и устойчивостью к антибиотикам. Депонирован в коллекции чистых культур микроорганизмов ВГНКИ. 6 табл.

Штамм бактерий Bacillus subtilis 12В-ДЕП в коллекции микроорганизмов ВГНКИ, обладающий широким спектром антагонистической активности и устойчивостью к антибиотикам.