ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ БИОПРЕПАРАТ ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ И ГРИБКОВЫХ ИНФЕКЦИЙ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТЬЮ Российский патент 2012 года по МПК A61K35/00 A61P31/00 

Изобретение относится к микробиологии, ветеринарии и биотехнологии и представляет собой новый препарат - пробиотик из двух штаммов бактерий рода Bacillus, обладающий широким спектром антагонизма по отношению к различным патогенным видам бактерий и грибов, а также устойчивостью к широкому кругу антибиотиков.

В настоящее время препараты - пробиотики из бактерий рода Bacillus - находят широкое применение в ветеринарии для лечения различных заболеваний птиц и сельскохозяйственных животных, поскольку подавляют развитие патогенных бактерий. Однако при тяжелых инфекционных заболеваниях иногда нельзя отказаться от назначения антибиотиков, поскольку они оказывают наиболее быстрый лечебный эффект. Применение антибиотиков приводит к негативным последствиям для организма животного: развитию дисбактериоза и снижению иммунитетета, а также к развитию антибиотикоустойчивости у патогенных штаммов. Для снятия негативных последствий антибиотикотерапии дополнительно применяют пробиотики, чем раньше используется пробиотик, тем меньше осложнений после антибиотикотерапии. Оптимально использование пробиотика одновременно с антибиотиком, но для этого штаммы, входящие в состав пробиотического препарата, должны обладать устойчивостью к антибиотикам.

Известен природный штамм Bacillus subtilis 11В, обладающий широким спектром антагонизма против бактериальных и грибных патогенов, вызывающих заболевания человека, животных и растений, что создает возможность создания на его основе препаратов-пробиотиков, способных лечить широкий круг заболеваний и использоваться в медицинской, ветеринарной и сельскохозяйственной практике (1).

Препарат на основе штамма Bacillus subtilis 11B (2) устойчив к действию антибиотиков пенициллинового ряда (b-лактамным антибиотикам: пенициллину, карбенициллину, ампициллину), полимиксину, а также малочувствителен к стрептомицину, гентамицину, тетрациклину. Поэтому назначать препарат для лечения людей и животных можно совместно с антибиотиками, к которым штамм Bacillus subtilis 11B имеет устойчивость, для предотвращения осложнений антибиотикотерапии (развития дисбиоза кишечника и снижения иммунитета).

Известен также природный Bacillus subtilis 12B (3) и препарат на его основе (4), используемый в качестве ветеринарного пробиотика. Штамм и препарат обладают антагонизмом в отношении патогенных ветеринарных штаммов патогенных бактерий и устойчивостью (или малой чувствительностью) к ряду антибиотиков, в том числе к тобрамицину, эритромицину, линкомицину, неомицину, рифампицину, т.е к тем антибиотикам, к которым чувствителен штамм Bacillus subtilis 11B.

Совмещение двух штаммов Bacillus subtilis 11B и Bacillus subtilis 12 в одном препарате позволяет расширить спектр антибиотикоустойчивости препарата и назначать препарат совместно с антибиотиками, без снижения его эффективности.

Для повышения эффективности действия препаратов - пробиотиков из бацилл - создаются комплексные препараты, включающие несколько штаммов бактерий. Наиболее близкими к изобретению являются штаммы Bacillus subtilis и Bacillus liheniformis, используемые в качестве компонентов препарата против вирусных и бактериальных инфекций, и препарат на основе этих штаммов (5).

Штаммы бактерий Bacillus Sabtilis ВКПМ В-7092, ВКПМ В-7048 и штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-7038 используются в качестве компонентов препарата Ветом против вирусных и бактериальных инфекций. Препарат содержит смесь биомассы указанных штаммов в споровой форме с титром не менее 3×10¹⁰ спор/г. В состав препарата входят также крахмал и сахар при определенном количественном соотношении компонентов. Комплексный бактериальный препарат обладает широким спектром антивирусной и антибактериальной активности.

Недостатком данного препарата является отсутствие у данного препарата антагонизма в отношении плесневых грибов родов Fusarium, Alternaria, Penicillium - источников опасных микотоксинов, споры которых попадают в корма для животных и могут являться причиной микотоксикозов. Нет указаний на возможность использования препарата совместно с антибиотиками, без которых нельзя обходиться при тяжелых формах инфекции.

Задачей предлагаемого изобретения является создание нового комплексного бактериального препарата - пробиотика на основе штаммов бактерий Bacillus subtilis 11B и Bacillus subtilis 12B, обладающего более широким спектром антагонистической активности, в том числе к штаммам родов Pseudomonas, Streptococcus, Escherihia coli, грибам родов Fusarium, Alternaria, Penicillium, и устойчивого к широкому кругу антибиотиков, что позволяет использовать его для лечения тяжелых форм инфекции при одновременной терапии с антибиотиком.

Для решения указанной задачи предлагаются:

- штамм бактерий Bacillus subtilis 11B, депонированый под номером ВКМ В-2218Д во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН 19.08.1999 г. Штамм выделен из здорового растения пшеницы в Уфимском районе. Идентификацию штамма проводили по «Определителю бактерий Берджи». - М.: Мир, 1997;

- штамм В. subtilis 12В, депонированный в коллекции микроорганизмов ВГНКИ под номером 12В-ДЕП. Штамм выделен из зоокомпоста в Уфимском районе республики Башкортостан. Идентификацию штамма проводили по «Определителю бактерий Берджи». - М.: Мир, 1997.

Технический результат заключается в том, что препарат содержит биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis 11B и бактерий Bacillus subtilis 12В в равных соотношениях.

Сухая форма препарата дополнительно содержит крахмал и сахар.

Препарат содержит в качестве основы живые клетки штамма Bacillus subtilis 12В и штамма Bacillus subtilis 11B в равных количествах и стабилизатор (или носитель) при следующем соотношении компонентов, мас %:

Биомасса штаммов Bacillus subtilis, 1×10⁸-10×10⁹ живых микробных клеток в 1 мл препарата 90-99 Стабилизатор, наполнитель (носитель) 1-10

В качестве стабилизатора для жидкой формы препарата можно использовать натрия хлорид в концентрации 0,9%. При получении сухих форм препарата (гранулирование, таблетирование или лиофильное высушивание) в биомассу вносят наполнитель (или носитель), что обусловлено его защитным действием для бактериальных клеток при высушивании.

При получении сухой биомассы штаммов (для получения порошка или гранул) в биомассу дополнительно вносят глюконат или стеарат кальция, крахмал, желатин и сахарозу и др. стабилизаторы в количестве от 1,0-10,0 мас.% с целью придания биомассе необходимых физических свойств. При необходимости можно смешивать готовую биомассу с сорбентом (например, активированным углем, карболонгом, лактулозой, ацетилфталилцеллюлозой, гелем фосфата алюминия) в соотношении 1:1 по сухому остатку, после чего жидкость отделяют фильтрацией и высушивают микрогранулы иммобилизованной биомассы вакуумной сушкой до остаточной влажности 5-10%.

После получения биомассы в сухом виде (порошок, гранулы) биомассу смешивают со вспомогательными веществами в соотношении 2:1 - 3:1 и таблетируют. В качестве вспомогательных веществ используют (мас.%.): стеарат кальция (0,5-1,0), тальк (2,5-3,0) и(или) крахмал (0,5-1,0) и(или) аэросил (0,5-0,8), глюкозу (5,0-20,0), сухое молоко (10,0-30,0) и(или) метилцеллюлозу (или поливинилпирролидон) (0,1-0,5). Получают таблетированную форму препарата, удобную в употреблении.

Пример 1. На основе штамма B.subtilis 11В с типичными морфологическими, культуральными, биохимическими свойствами приготовлены 5 вариантов жидкого препарата с различным содержанием микробных клеток в составе 1 дозы препарата.

Вариант 1. Препарат, содержащий, мас.%:

биомасса B.subtilis 11В, 0,5×10⁸ живых микробных клеток или колониеобразующих единиц (КОЕ);

биомасса B.subtilis 12В, 0,5×10⁸ живых микробных клеток или колониеобразующих единиц (КОЕ)   в 1 мл препарата 91; стабилизатор (натрия хлорид) 9.

Вариант 2.

Препарат, содержащий, мас.%:

биомасса B.subtilis 11В, 2×10⁸ живых микробных клеток (КОЕ);

биомасса B.subtilis 12В, 2×10⁸ живых микробных клеток (КОЕ)   в 1 мл препарата 91, стабилизатор (натрия хлорид) 9.

Вариант 3. Препарат, содержащий, мас.%:

биомасса B.subtilis 11В, 5×10⁸ живых микробных клеток (КОЕ);

биомасса B.subtilis 12В, 5×10⁸ живых микробных клеток (КОЕ)   в 1 мл препарата 91; стабилизатор (натрия жлорид) 9.

Вариант 4.

Препарат, содержащий, мас.%:

биомасса B.subtilis 11В, 1,0×10⁹ живых микробных клеток (КОЕ);

биомасса B.subtilis 12B, 1,0×10⁹ живых микробных клеток (КОЕ)   в 1 мл препарата 91; стабилизатор (натрия хлорид) 9.

Изготовленные варианты препарата разливали в стерильные флаконы, укупоривали резиновыми пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками.

Пример 2. Штамм В. subtilis 11В культивируют в жидкой питательной среде, обеспечивающей спорообразование в течение 16 часов.

Штамм В. subtilis 12В культивируют в жидкой питательной среде, обеспечивающей спорообразование в течение 16 часов.

Полученные биомассы смешивают в равных соотношениях (при необходимости концентрируют с помощью микрофильтрации до содержания микробных клеток 100×10⁹ кл/мл по ОСО на 10 ЕД). К биомассе добавляют стабилизатор на основе крахмала и лактозы или сахарозо-желатиновой среды, смешивают, гранулируют и подсушивают до остаточной влажности не более 5%. Далее порошок измельчают до получения однородной массы и дозировано расфасовывают во флаконы (или пакеты).

Вариант 5. Препарат, содержащий, мас.%.:

биомасса 25,0 крахмал 31,1 лактоза 42,6 метилцеллюлоза (или поливинилпирроллидон) 1,3

Готовый порошок белого или бежевого цвета, сладковатый на вкус. Остаточная влажность не более 5%. Порошок растворяется в воде, 0,1 н. HCl и нейтральных растворах в течение 15 мин с образованием рыхлого комковатого осадка. Готовый порошок содержат биомассу В. subtilis в количестве не менее (1,5±0,5)×10⁸ КОЕ/г.

Пример 3. Штамм В. subtilis 11В культивируют в жидкой питательной среде, обеспечивающей спорообразование в течение 16 часов.

Штамм В. subtilis 12В культивируют в жидкой питательной среде, обеспечивающей спорообразование в течение 16 часов.

Полученные биомассы смешивают в равных соотношениях (при необходимости концентрируют с помощью микрофильтрации до содержания микробных клеток 100×10⁹ кл/мл по ОСО на 10 ЕД). К биомассе добавляют стабилизатор на основе крахмала и лактозы или сахарозо-желатиновой среды и вносят глюконат кальция в количестве 2,0 мас.%, перемешивают и досушивают открытым способом (или лиофильно в кассетах). По окончании сушки порошок измельчают до получения однородной массы, добавляют вспомогательные вещества и таблетируют.

Вариант 6. Препарат, содержащий, мас.%:

биомасса 50,0 стеарат кальция 0,8 сахарозо-желатиновая среда 29,6 глюконат кальция 2,0 тальк 2,5 глюкоза 5,0 сухое молоко 10,0 метилцеллюлоза 0,1

Готовые таблетки имеют круглую форму диаметром 0,8-12 мм с гладкой твердой поверхностью беловато-серого или желтоватого цвета, сладковатые на вкус, со специфическим запахом. Средняя масса таблетки составляет от 0,75±0,05 г с остаточной влажностью не более 5%. Таблетки растворяются в 0,1 н. HCl и нейтральных растворах в течение 30-45 мин с образованием рыхлого комковатого осадка. Готовые таблетки содержат биомассу штамма В. subtilis в количестве (2,5±0,5)×10⁸ KOE.

Проверяли безвредность полученных вариантов препарата на лабораторных животных, специфическую антагонистическую активность в отношении тест-культур - представителей различных групп патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и устойчивость к антибиотикам.

Препарат характеризуется безвредностью (см. таблицу 1).

Для определения безвредности содержимое флакона с жидким препаратом использовали без разведения, порошок или таблетку разводили в 10 мл физиологического раствора и вводили 0,5 мл препарата перорально мышам. Для каждого варианта опыта использовали не менее 10 мышей массой 15-16 г. Препарат считали безвредным, если все мыши оставались живыми в течение пяти суток наблюдения и ни у одной из них не выявлено заболевания.

Таблица 1 Изучение безвредности препарата № Варианты препарата (кол-во клеток в 1 дозе) Количество животных (штук) Средняя масса животных, г Было Выжило До введения Через 1 сутки Через 5 суток 1 0,5×10⁸ 10 10 15,4±0,3 15,6±0,3 16,9±0,3 2 2,0×10⁸ 10 10 15,7±0,2 15,9±0,3 17,0±0,2 3 5,0×10⁸ 10 10 15,82±0,2 16,0±0,2 17,08±0,2 4 1,0×10⁹ 10 10 15,65±0,2 15,7±0,2 17,1±0,2 5 1,5×10⁸ 10 10 16,0±0,2 16,1±0,2 17,2±0,2 6 2,5×10⁸ 10 10 15,6±0,2 15,8±0,2 17,1±0,2

Испытание показало, что все животные остались живыми, их первоначальная масса увеличилась, отсутствовали какие-либо признаки заболевания.

Препарат характеризуется широким спектром антагонистической активности в отношении тест-штаммов культур патогенных микроорганизмов (таблица 2).

Для определения специфической активности исследовали антагонистическую активность вариантов препарата в отношении тест-культур. Исследование осуществляли методом отсроченного антагонизма. Для этого содержимое флакона с порошком (или таблетку) растворяли в 2-5 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевали штрихом по диаметру чашки Петри с агаризованной средой Гаузе N 2. Посевы инкубировали в термостате при 37°С в течение 72 ч. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18 часов инкубирования при 37°С по величине зон отсутствия роста тест-культур.

Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе N 2 без исследуемой культуры.

Таблица 2 Антагонистическая активность вариантов препарата № Тест-культуры Варианты препарата (кол-во клеток в 1 дозе) 1 2 3 4 5 6 0,5×10⁸ 2,0×10⁹ 5,0×10⁹ 1,0×10⁹ 1,5×10⁹ 2,5×10⁸ 1 2 3 4 5 6 7 8 2 Staphylococcus 10-15 15-20 15-20 15-20 18-20 18-20   aureus (Филиппов)             3 Staphylococcus 10-15 15-20 15-20 15-20 18-20 18-20   aureus (Никифоров)             4 St. aureus 66 10-12 15-16 15-16 15-16 15-16 15-16 5 St. aureus 67 8-10 10-12 10-12 10-12 10-12 10-12 7 St. aureus 80 10-12 12-15 12-15 12-15 12-15 12-15 8 Proteus vulgaris 177 10-15 15-20 15-20 15-20 15-20 15-20 9 Pr. vulgaris 12 8-10 10-12 12-15 12-15 12-15 12-15 10 P. vulgaris 48 8-10 12-15 12-15 12-15 12-15 12-15 11 Pr. vulgaris 41 8-10 10-12 12-15 12-15 12-15 12-15 12 Proteus mirabilis 237 15-18 18-20 18-20 18-20 18-20 18-20 13 Pr. mirabilis 40 12-15 15-20 15-20 15-20 15-20 15-20 14 Pr. mirabilis 36 12-15 15-18 15-18 15-18 15-18 15-18 15 Pr. mirabilis 35 15-18 18-20 18-20 18-20 18-20 18-20 16 Candida albicans 25-30 25-30 25-30 25-30 25-30 25-30 17 Escherihia coli 177 20-22 22-25 22-25 22-25 22-25 22-25 18 E.coli 154 10-12 12-15 12-15 12-15 12-15 12-15 19 E.coli 140 10-12 12-15 12-15 12-15 12-15 12-15 20 Shigella sonne 2586 10-12 12-15 12-15 12-15 12-15 12-15 21 Shigella HK 20-22 22-25 22-25 22-25 22-25 22-25 22 Pseudomonas 12-15 15-20 15-20 15-20 15-20 15-20   aeruginosa 8             23 P. aeruginosa 126 10-12 12-15 12-15 12-15 12-15 12-15 24 Streptococcus 321 10-12 12-15 12-15 12-15 12-15 12-15 25 Streptococcus 325 10-12 12-15 12-15 12-15 12-15 12-15 26 Streptococcus 191 10-12 12-15 12-15 12-15 12-15 12-15 27 Paratyhv 269 10-12 12-15 12-15 12-15 12-15 12-15 28 Paratyhv 15 12-15 15-20 15-20 15-20 15-20 15-20 29 Hexaere II 1230 12-15 15-20 15-20 15-20 15-20 15-20

Из данных таблицы 1 следует, что оптимальным количеством живых микробных клеток в одной дозе препарата является 2-5×10⁸. Снижение количества микробных клеток до 0,5×10⁸ снижает уровень антагонистической активности, а увеличение количества микробных клеток до 10×10⁸ и выше не изменяет существенным образом антагонистическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов. Использование препарата в таблетках (вариант 6) не снижает уровень антагонистической активности.

Препарат обладает устойчивостью к целому ряду антибиотиков (таблица 3).

Чувствительность препарата к антибиотикам определяли с помощью стандартных дисков, пропитанных антибиотиками. В чашку Петри с МПА наливали 1 мл клеточной суспензии препарата в 0,9%-ном растворе натрия хлорида и равномерно распределяли по поверхности агара. Избыток удаляли пастеровской пипеткой. На поверхности засеянного агара пинцетом раскладывали диски с антибиотиками, по 5 дисков на каждую чашку. Чашки выдерживали в термостате при температуре (37±1)°С в течение (18±2) ч, после чего измеряли зоны задержки роста вокруг дисков, включая диаметр самого диска.

Таблица 3 Антибиотикоустойчивость вариантов препарата № Антибиотики Зоны торможения роста, мм Варианты препарата 1 2 3 4 5 6 1 Ампициллин 0-6 0-6 0-6 0-6 0-6 0-6 2 Бензилпенициллин 0 0 6 8 6 6-8 3 Карбенициллин 0 0 0 0 0 0 4 Полимиксин 0 0 0 0 0 0 5 Стрептомицин 0-8 0-8 0-8 0-8 0-8 0-8 6 Рифампицин 0-6 0-6 6 6 6-8 6-8 7 Гентамицин 0-7 0-7 0-6 0-6 0-6 0-6 8 Клотримазол 8-10 8-10 8-10 10 10 10 9 Левомицитин 18-20 18-20 18-20 18-20 18-20 18-20 10 Тетрациклин 6-8 6-8 6-8 6-8 6-8 6-8 11 Мономицин 6-8 6 6 6-8 6-8 8 12 Гептомицин 10-15 10-15 10-15 10-15 10-15 10-15 13 Клотримазол 10-12 10-12 10-12 10-12 10-12 10-12 14 Неомицин 6 6 0 6-8 6-8 6-8 15 Цепарин 15-20 15-20 15-20 15-20 15-20 15-20 16 Канамицин 10-15 10-15 10-15 10-15 10-15 10-15 17 Новограмон 20-25 20-25 20-25 20-25 20-25 20-25 18 Бисенгиол 10-15 10-15 10-15 10-15 10-15 10-15 19 Тобрамицин 6-8 0-8 0 6 6-9 6 20 Эритромицин 6-8 0 6 6 6-9 6-8

Из полученных данных следует, что препарат устойчив к действию антибиотиков пенициллинового ряда (b-лактамным антибиотикам: пенициллину, карбенициллину, ампициллину), полимиксину, а также малочувствителен к стрептомицину, гентамицину, тетрациклину, тобрамицину, эритромицину, мономицину, рифампицину.

Эффективность заявляемого препарата в оптимальных концентрациях микробных клеток (2-10)×10⁸ для нормализации микробиоценоза кишечника оценена при лечении 10 больных телят с выраженной диспепсией. Препарат назначали по 1 дозе два раза в день в течение 10 суток. Результаты исследования микрофлоры кишечника у больных телят до начала лечения и через 7-10 дней после окончания лечения представлены в таблице 4.

После назначения препарата симптомы диспепсии и диареи были купированы в течение 3-7 дней, препарат давали в течение 10 дней.

Показатели состояния микробиоценоза кишечника показывают, что терапевтическое действие препарата заключается в эффективном устранении УПМ (98,0%) и восстановлении нормофлоры (90%). Показана его абсолютная безвредность и хорошая переносимость.

Таблица 4 Состояние микрофлоры кишечника у больных телят на фоне лечения комплексным препаратом Представители микрофлоры кишечника Количество больных
(n-30) До лечения После лечения Абс. % Абс. % Снижение бифидобактерий (10⁴-10⁵) 30 100 4 13,3 Снижение лактобактерий (10⁴-10⁵) 22 73,3 2 6,6 Снижение споровых анаэробов (10³-10⁴) 18 60 4 13,3 Повышение УПФ (10⁶), в том числе:         Протей 14 46,7 0 0

Клибсиелла 9 30,0 0 0 Гемолитические эшерихии 14 46,7 0 0 Стафилококки 18 60 3 1,0 Псевдомонады 6 20,0 0 0 Стрептококки 12 40,0 0 0 Лактозонегативные энтеробактерии 9 30,0 3 1,0 Грибки кандида 6 20,0 0 0 Сальмонеллы 4 13,3 0 0 Эффективность элиминации УПМ 98,0%       Эффективность восстановления нормофлоры 90%      

Источники информации

1. Патент №2182172 «Штамм бактерий Bacillus subtilis, обладающий широким спектром антагонистической активности», опубл. 13.10.2002, бюл. №13.

2. Патент №2181596 «Лекарственный препарат из бактерий рода Bacillus», опубл. 27.04.2002, бюл. №12.

3. Патент №2169767 «Штамм бактерий Bacillus subtilis, обладающий широким спектром антагонистической активности и устойчивостью к антибиотикам», опубл. 27.06.2001, бюл. №18.

4. Патент №2172175 «Лечебно-профилактический биопрепарат», опубл. 20.08.2001, бюл. №23.

5. Патент №2142287 «Штаммы бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, используемые в качестве компонентов препарата против вирусных и бактериальных инфекций, и препарат на основе этих штаммов», опубл. 10.12.1999.

Изобретение относится к области ветеринарии и биотехнологии. Биопрепарат включает смесь биомассы двух штаммов бактерий Bacillus subtilis, стабилизатор или наполнитель, или носитель. Биопрепарат выполнен в сухой или жидкой форме и содержит смесь биомассы штамма В.subtilis 11В и биомассы штамма Bacillus subtilis 12B в равных соотношениях с титром соответственно не менее 1×10⁸ КОЕ/г или 1×10⁸ КОЕ/мл в количестве 25-50 или 91 мас.%, стабилизатор или наполнитель, или носитель - остальное. Биопрепарат обладает широким спектром антагонизма по отношению к различным патогенным видам бактерий и грибов, а также устойчивостью к широкому кругу антибиотиков. 2 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Лечебно-профилактический биопрепарат против бактериальных и грибковых инфекций, обладающий антибиотикоустойчивостью, включающий смесь биомассы двух штаммов бактерий Bacillus subtilis, стабилизатор, или наполнитель, или носитель, отличающийся тем, что он выполнен в сухой или жидкой форме и содержит смесь биомассы штамма В.subtilis 11В и биомассы штамма Bacillus subtilis 12B в равных соотношениях с титром соответственно не менее 1×10⁸ КОЕ/г или 1×10⁸ КОЕ/мл в количестве 25-50 или 91 мас.%, стабилизатор, или наполнитель, или носитель - остальное.

2. Лечебно-профилактический биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что он выполнен в сухой форме, содержит смесь биомассы штамма В. subtilis 11В и Bacillus subtilis 12B в равных соотношениях с титром не менее 1×10⁸ КОЕ/г и стабилизатор? или наполнитель, или носитель при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Смесь биомассы бактерий штамма   В. subtilis 11В и Bacillus subtilis 12B   в равных соотношениях   с титром не менее 1×10⁸ КОЕ/г 25-50 Стабилизатор, или наполнитель, или носитель остальное

3. Лечебно-профилактический биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что он выполнен в жидкой форме, содержит смесь биомассы бактерий штамма В.subtilis 11В и Bacillus subtilis 12B в равных соотношениях с титром не менее 1×10⁸ КОЕ/мл, а в качестве стабилизатора содержит натрия хлорид при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Смесь биомассы бактерий штамма   B.subtilis 11В и Bacillus subtilis 12B   в равных соотношениях   с титром не менее 1×10⁸ КОЕ 91 Натрия хлорид 9