ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ БИОПРЕПАРАТ Российский патент 2001 года по МПК A61K35/74 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/125 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый лечебно-профилактический препарат, подавляющий развитие ветеринарных штаммов болезнетворных микроорганизмов родов: Streptococcus, Esherichia coli, Pseudomonas, Sthaphilococcus, Proteus, Shigella, Hexaera и обладающий широкой устойчивостью к антибиотикам.

В настоящее время препараты-пробиотики из бактерий рода Bacillus, подавляющие развитие патогенных микроорганизмов, находят широкое применение в ветеринарии для лечения различных заболеваний птиц и сельскохозяйственных животных: БЦЛ (бактоцеллолактин), субалин, споролакт (1-3). Препараты пробиотики, на основе бактерий рода Bacillus, обладают широким антагонизмом в отношении патогенных бактерий и грибов, однако редко отмечается антагонизм в отношении штаммов Pseudomonas aeruginosa и Proteus vulgaris (5).

Основной недостаток этих препаратов - низкая биологическая эффективность в отношении штаммов Pseudomonas, Streptococcus и невозможность сочетанного использования с антибиотиками при тяжелых формах инфекции. Для лечения людей уже созданы препараты из бацилл, обладающие антибиотикоустойчивостью, что позволяет их совместное использование в целях предотвращения развития дисбактериоза (6).

Наиболее близким к изобретению является биопрепарат Субалин, содержащий биомассу рекомбинантного штамма В. subtilis ВКПМ В-4759 и наполнитель, который используется в ветеринарии для профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, дисбактериозов (4). Однако препарат обладает низкой активностью в отношении Pseudomonas aeruginosa (4-6 мм задержки роста тестовых штаммов) и не задерживает рост Escherihia coli и Streptococcus, которые часто являются причиной заболеваний сельскохозяйственных животных. Также неизвестна его чувствительность к антибиотикам, что ограничивает сферу его применения при тяжелых формах гнойно-воспалительных заболеваний, лечение которых требует совместного введения бактериального препарата и антибиотика.

Задача, решаемая изобретением - создание нового препарата-пробиотика, из бактерий рода Bacillus, обладающего широким спектром антагонистической активности, в том числе к штаммам родов Pseudomonas, Streptococcus, Escherihia coli, применение которого возможно совместно с антибиотиками.

Это достигается тем, что в качестве основы биопрепарата используют штамм Bacillus subtilis 12 В-ДЕП.

Штамм Bacillus subtilis 12 В-ДЕП выделен из компоста в Уфимском районе. Относится к спорообразующим аэробным бактериям рода Bacillus. Бактерии представляют собой грам-положительные спорообразующие палочки, полиморфные. Сбраживают лактозу, глюкозу, сахарозу, маннит, мальтозу, слабо ферментирует сорбит, галактозу, арабинозу, рафинозу, не ферментирует дульцит. Бактерии не патогенны, характеризуются высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и устойчивостью к целому ряду антибиотиков.

Штамм депонирован 7.10.1999 г во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве под номером Bacillus subtilis 12В-ДЕП. Местом хранения штамма определена коллекция микроорганизмов отдела пробиотиков и биологически активных препаратов (ВГНКИ ветпрепаратов).

Заявляемый лечебно-профилактический препарат содержит в качестве основы живые клетки штамма Bacillus subtilis 12 В-ДЕП и наполнитель, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Биомасса Bacillus subtilis 12 В-ДЕП - 1•10⁹ - 2•10⁹ живых микробных клеток в 1 мл растворителя - 92-95
Наполнитель - 5-8
В качестве растворителя можно использовать физиологический раствор, дистиллированную или кипяченную воду. В качестве наполнителя препарат может содержать 5% лактозы или 8% сахарозо-желатиновой смеси (7% сахарозы и 1% желатина). Необходимость наполнителя обусловлена его защитным действием для бактериальных клеток при дальнейшем лиофильном высушивании препарата.

Препарат характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Антагонистическую активность проверяли методом отсроченного антагонизма (таб. 1).

Препарат характеризуется безвредностью (таб. 2) и устойчивостью к ряду антибиотиков (таб. 3).

Пример 1. На основе штамма В.subtilis 12 В-ДЕП с типичными морфологическими, культуральными, биохимическими свойствами приготовлены 5 вариантов препарата с различным содержанием микробных клеток.

Вариант 1. Препарат, содержащий мас.%:
Биомасса В. subtilis 12 В-ДЕП - 1,0•10⁸ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 92
Наполнитель - сахарозо-желатиновая смесь - 8
Вариант 2. Препарат, содержащий мас.%:
Биомасса В. subtilis 12 В-ДЕП - 5,0 • 10⁸ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 92
Наполнитель - сахарозо-желатиновая смесь - 8
Вариант 3. Препарат, содержащий мас.%:
Биомасса В. subtilis 12 В-ДЕП - 1,0•10⁹ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 93
Наполнитель - сахарозо-желатиновая смесь - 7
Вариант 4. Препарат, содержащий мас.%:
Биомасса В. subtilis 12 В-ДЕП - 2,0•10⁹ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 94
Наполнитель - сахарозо-желатиновая смесь - 6
Вариант 5. Препарат, содержащий мас.%:
Биомасса В. subtilis 12 В-ДЕП - 5,0•10⁹ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 95
Наполнитель - лактоза - 5
Изготовленные варианты препарата разливали в стерильные ампулы и лиофильно высушивали. Проверяли безвредность полученных вариантов препарата на лабораторных животных, специфическую антагонистическую активность в отношении тест-культур представителей различных групп патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, чувствительность к антибиотикам.

Для определения безвредности содержимое ампулы разводили в 0,5 мл физиологического раствора и вводили эту дозу перорально мышам. Для каждого варианта опыта использовали не менее 10 мышей массой 15-16 г. Препарат считали безвредным, если все мыши оставались живыми в течение пяти суток наблюдения и ни у одной из них не выявлено заболевания.

Для определения специфической активности исследовали антагонистическую активность вариантов препарата в отношении тест-культур. Исследование осуществляли методом отсроченного антагонизма. Для этого содержимое ампулы растворяли в 1 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевали штрихом по диаметру чашки Петри с агаризованной средой Гаузе N 2. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37^oC в течение 72 ч. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18 часов инкубирования при температуре 37^oC по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе N 2 без исследуемой культуры.

Чувствительность препарата к антибиотикам определяли с помощью стандартных дисков, пропитанных антибиотиками. В чашку Петри с МПА наливали 1 мл суспензии суточной культуры штамма в 0,9%-ном растворе натрия хлорида, содержащей 1•10⁹ микробных клеток и равномерно распределяли по поверхности агара. Избыток удаляли пастеровской пипеткой. На поверхности засеянного агара пинцетом раскладывали диски с антибиотиками, по 5 дисков на каждую чашку. Чашки выдерживали в термостате при температуре (37±1)^oС в течение (18±2) ч, после чего измеряли зоны задержки роста вокруг дисков, включая диаметр самого диска.

Полученные результаты испытания препаратов представлены в таблицах 1 -3.

Антагонистическая активность 5 вариантов препарата представлена в табл. 1.

Из данных табл. 1 следует, что оптимальным количеством живых микробных клеток в 1 дозе препарата является 1•10⁹ -2•10⁹ кл/мл. Дальнейшее увеличение количества микробных клеток не изменяет существенным образом антагонистическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов.

Проведено изучение безвредности различных вариантов препарата на белых аутбредных мышах при введении per os 1 дозы. Наблюдение за изменением веса животных осуществляли в течение 5 суток. Полученные данные представлены в табл. 2.

Испытание показало, что все животные остались живыми, их первоначальная масса увеличилась, отсутствовали какие-либо признаки заболевания.

Проведено изучение антибиотикоустойчивости различных вариантов препарата. Данные представлены в табл. 3.

Полученные данные свидетельствуют, что новый препарат обладает выраженной антибиотикоустойчивостью.

Для изучения лечебной эффективности препарата проведены его испытания в животноводческом комплексе ОСК "Алимово" Актанышского района Татарстана. Препарат использован для профилактики и лечения телят и поросят от диспепсий, отечной болезни. Показаны его эффективность и хорошая переносимость.

Пример 2. С целью профилактики препарат применялся с водой и пищей в дозе 1 мл на 10 кг веса два раза в сутки в течение 7 дней, а затем в тех же дозах 2 раза в неделю в течение 2 месяцев (табл. 4).

Для лечения препарат назначался в дозе 2 мл на 10 кг веса 3 раза в сутки в течение 10 дней (табл. 5). Другие антибактериальные препараты при лечении препаратом не использовались. Контрольный антибиотик выбирали по назначению.

Отдельно наблюдаемые случаи отечной болезни и диспепсий при профилактическом применении препарата протекали, как правило, в легкой форме и без потери массы животного. Осложнений, при применении и увеличении дозы, не наблюдалось.

Таким образом, проведенные исследования заявляемого препарата показали, что он безвреден, характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении тестовых штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, обладает выраженной антибиотикоустойчивостью и обладает лечебным действием.

Применение: лечебно-профилактический препарат используют при диспепсиях, отечной болезни, дисбактериозах и гнойно-воспалительных заболеваниях, обусловленных патогенными и условно-патогенными микроорганизмами.

Использованные источники информации
1. Ивановский А. А., Вепрева Н.С., Зимирева В.В., Лагунова О.П. Способ получения пробиотика для ветеринарии / RU Патент N 2084233, опубл. 20.07.97. - Бюл. N 20.

2. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Профилактический биопрепарат субалин / RU Патент N 2035185, опубл. 31.01.92. - Бюл. N 14.

3. Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А. и др. Профилактический биопрепарат споролакт / Патент N 2035186. - RU. - A 61 K 35/66, публ. 20.05.95, бюл. N 14.

4. Шуст А.Н., Белявский В.А., Аликин Ю.С. Новый лечебно-профилактический препарат субалин: эффективность применения при болезнях телят / Актуальные вопросы ветеринарии: Тез. докл. 1 Научн-практ. конференции фак. вет. мед. НГАУ. Новсибирск, 1997. - Новосибирск, 1997. С. 15-16.

5. Блинкова Л. П. , Семенов С.А., Бутова Л.Г. и др. Антагонистическая активность свежевыделенных штаммов бактерий рода Bacillus // ЖМЭИ. - 1994. - N 5. - С. 71-72.

6. Жирков И. Н., Братухин И.И. Применение пробиотика РАС для коррекции дисбактериозов у телят // Ветеринария. 1999. - N 4. - С. 40-42.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и может быть использовано в ветеринарии для профилактики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний и диспепсий у животных. Биопрепарат включает биомассу Bacillus subtilis 12 В - ДЕП и наполнитель при следующем соотношении компонентов, мас.%: биомасса В. subtilis 12 В -ДЕП - живых микробных клеток - (1-2)•10⁹ в 1 мл растворителя 92-95, наполнитель 5-8. Биопрепарат подавляет развитие ветеринарных штаммов болезнетворных микроорганизмов родов: Streptococcus, Esherichia coli, Pseudomonas, Sthaphilococcus, Proteus, Shigella, Hexaera, обладает широкой устойчивостью к антибиотикам и эффективностью при лечении. 5 табл.

Лечебно-профилактический биопрепарат, включающий живую микробную массу Bacillus subtilis и наполнитель, отличающийся тем, что он содержит биомассу В. subtilis 12 В - ДЕП при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Биомасса В. subtilis 12 В - ДЕП - живых микробных клеток - (1-2)•10⁹ в 1 мл растворителя - 92-95
Наполнитель - 5-8