СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE Российский патент 2002 года по МПК C12Q1/10 G01N33/53 C12Q1/10 C12R1/01 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к ветеринарной микробиологии, и может быть использовано для индикации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae в пищевых продуктах, объектах окружающей среды и кормах.

Известен способ получения диагностикумов для определения микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae путем сенсибилизации полимерных носителей антителами в присутствии сшивающего агента - карбодиимида (Shuhan J.C. and Ledis S.L., Am. Chem. Soc., 95, 875 (1973); Thomas J.O., et al., J. Mol. Biol. , 129, 149, (1978)).

В частности:
К полимерному носителю добавляют порционно при постоянном перемешивании сшивающий реагент - карбодиимид (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropil)carbodiimide x HCl) в конечной концентрации 0,3-0,5% и инкубируют полученную смесь в течение 20 - 25 мин при 2-6^oС, а антитела к полимерному носителю добавляют при массовом соотношении 1:20-30 соответственно, при значении рH среды 1.3 pI (±0,1), где pI - значение изоэлектрической точки добавляемых антител.

Однако в результате использования известного способа получают диагностикум с низкой чувствительностью и недостаточно стабильный.

Целью предлагаемого изобретения является увеличение чувствительности и сроков хранения целевого продукта.

Поставленная цель достигается в способе получения диагностикума для определения микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae путем сенсибилизации полимерных носителей антителами в присутствии сшивающего реагента - карбодиимида с последующим отделением целевого продукта центрифугированием тем, что к полимерному носителю добавляют гидроксисукцинимид в конечной концентрации 0,8-1,0%, инкубируют 1-3 мин при 2-6^oС, далее в реакционную смесь вносят сшивающий реагент в конечной концентрации 0,3-0,4% и инкубируют полученную смесь при 2-6^oС в течение 20-25 мин, а антитела к полимерному носителю добавляют при массовом соотношении 1:20-30, соответственно, при значении рН среды 1,3 pI 1,2-1,4, где pI - значение изоэлектрической точки антител.

Известен полимерный носитель (ТУ 11249895-30-94), который используется для иммобилизации антител ("Sigma", 1998).

Карбодиимид (1-Еthyl-3-(3-dimethylaminopropil) carbodiimide x HCl) используется в качестве сшивающего реагента ("Sigma", 1998).

Гидроксисукцинимид (N-Hydroxy-2,5-pirrolidinedion) используется в качестве активирующего реагента (Прокопов П.И., Грицкова И.А., Черкасов В.Р., Чалых А.Е.) Синтез монодисперсных функциональных полимерных микросфер для иммунодиагностических исследований. // Успехи химии. - М., - 1996, т.51, - 2, с. 178-192).

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие признаки, аналогичные заявленным, то есть предложение соответствует критерию "новизны".

Заявленное предложение решает одну из важных задач - определение микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae в пищевых продуктах, объектах окружающей среды и кормах - то есть предложение "промышленно применимо".

Нами впервые установлено, что добавление гидроксисукцинимида в определенных режимах перед использованием сшивающего реагента существенно увеличивает чувствительность и срок хранения диагностикума за счет возможности проведения процесса иммобилизации антител на поверхность полимерного носителя в более мягких условиях, позволяющих избежать меж- и внуримолекулярного сшивания, протекание которого вызывает конформационные изменения молекул антител и снижает чувствительность и срок хранения диагностикума.

Таким образом, предложение соответствует критерию "изобретательский уровень".

Изобретение иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1. К 100 см³ 2%-ной взвеси полимерного носителя добавляют забуференный физиологический раствор (ЗФР) (рН 8.0) и смесь центрифугируют при режиме 3000 об/мин, 10 мин. Надосадочную жидкость сливают; осадок суспендируют в ЗФР до концентрации 2%. Далее к нему добавляют раствор гидроксисукцинимида в конечной концентрации 0,8%, инкубируют при постоянном перемешивании в течение 1 мин, затем добавляют раствор карбодиимида в конечной концентрации 0,3%. Полученную смесь инкубируют в течение 20 мин при простоянном перемешивании и температуре 2^oС, отделяют от непрореагировавших веществ в ЗФР (рН 8,0) центрифугированием при режиме 3000 об/мин, 10 мин, а затем добавляют, как в известном способе, по каплям при постоянном перемешивании раствор иммуноглобулинов диагностических к группе D поливалентных в массовом соотношении 20:1, соответственно. Реакционную смесь инкубируют в течение 2 ч при 20^oС и постоянном перемешивании. Затем смесь выдерживают в течение 20 ч при 2^oС. Далее проводят окончательную очистку диагностикума от посторонних примесей центрифугированием при режиме 3000 об/мин, 10 мин. Осадок суспендируют до концентрации 2% в ЗФР (рН 8,0). Получают диагностикум для определения микроорганизмов семейства Enterobactericeae, рода Salmonella (группа D) с чувствительностью 10⁶ м.к./см³ (превышающей на порядок чувствительность диагностикумов, полученных известным способом) и сроком хранения 8 месяцев (превышающий срок хранения диагностикумов, полученных известным способом, на 60%).

Пример 2. К 100 см³ 2%-ной взвеси полимерного носителя добавляют забуференный физиологический раствор (рН 8,1) и смесь центрифугируют при режиме 3100 об/мин, 12 мин. Надосадочную жидкость сливают; осадок суспендируют в ЗФР до концентрации 2,3%. Далее к нему добавляют раствор гидроксисукцинимида в конечной концентрации 0,9%, инкубируют при постоянном перемешивании в течение 2 мин, затем добавляют раствор карбодиимида в конечной концентрации 0,35%. Полученную смесь инкубируют в течение 23 мин при простоянном перемешивании и 4^oС, отделяют от непрореагировавших веществ в ЗФР (рН 8,1) центрифугированием при режиме 3100 об/мин, 12 мин, а затем добавляют, как в известном способе, по каплям при постоянном перемешивании раствор иммуноглобулинов диагностических к группе D поливалентных в массовом соотношении 25:1, соответственно. Реакционную смесь инкубируют в течение 2 ч 15 мин при 23^oС и постоянном перемешивании. Затем смесь выдерживают в течение 22 ч при 4^oС. Далее проводят окончательную очистку диагностикума от посторонних примесей центрифугированием при режиме 3100 об/мин, 12 мин. Осадок суспендируют до концентрации 2,3% в ЗФР (рН 8,1). Получают диагностикум для определения микроорганизмов семейства Enterobactericeae, рода Salmonella (группа D) с чувствительностью 10⁶ м.к./см³ (превышающей на порядок чувствительность диагностикумов, полученных известным способом) и сроком хранения 7,5 месяцев (превышающий срок хранения диагностикумов, полученных известным способом, на 55%).

Пример 3. К 100 см³ 2%-ной взвеси полимерного носителя добавляют забуференный физиологический раствор (рН 8,2) и смесь центрифугируют при режиме 3200 об/мин, 15 мин. Надосадочную жидкость сливают; осадок суспендируют в ЗФР до концентрации 2,5%. Далее к нему добавляют раствор гидроксисукцинимида в конечной концентрации 1,0%, инкубируют при постоянном перемешивании в течение 3 мин, затем добавляют раствор карбодиимида в конечной концентрации 0,4%. Полученную смесь инкубируют в течение 25 мин при простоянном перемешивании и температуре 6^oС, отделяют от непрореагировавших веществ в ЗФР (рН 8,2) центрифугированием при режиме 3200 об/мин, 15 мин, а затем добавляют, как в известном способе, по каплям при постоянном перемешивании раствор иммуноглобулинов диагностических к группе D поливалентных в массовом соотношении 30: 1, соответственно. Реакционную смесь инкубируют в течение 2 ч 30 мин при 25^oС и постоянном перемешивании. Затем смесь выдерживают в течение 24 ч при 6^oС. Далее проводят окончательную очистку диагностикума от посторонних примесей центрифугированием при режиме 3200 об/мин, 15 мин. Осадок суспендируют до концентрации 2,5% в ЗФР (рН 8,2). Получают диагностикум для определения микроорганизмов семейства Enterobactericeae, рода Salmonella (группа D) с чувствительностью 2х10⁶ м.к./см³ (превышающей на порядок чувствительность диагностикумов, полученных известным способом) и сроком хранения 8 месяцев (превышающий срок хранения диагностикумов, полученных известным способом, на 60%).

Таким образом, предлагаемый способ увеличивает чувствительность диагностикумов в 10 раз и увеличивает сроки хранения целевого продукта на 55-60% за счет исключения возможности протекания меж- и внутримолекулярного сшивания белковых молекул в процессе сенсибилизации (за счет перевода функциональных групп в активную (но стабильную) форму).

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано для определения микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae. Способ осуществляется путем сенсибилизации полимерных носителей антителами в присутствии сшивающего реагента - карбодиимида с последующим инкубированием полученной смеси и добавлением антител к полимерному носителю. Способ увеличивает чувствительность диагностикумов и увеличивает срок хранения целевого продукта.

Способ получения диагностикума для определения микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae путем сенсибилизации полимерных носителей антителами в присутствии сшивающего реагента - карбодиимида с последующим инкубированием полученной смеси и добавлением антител к полимерному носителю, отличающийся тем, что полимерный носитель предварительно обрабатывают гидроксисукцинимидом в конечной концентрации 0,8-1% и инкубируют 1-3 мин при 2-6^oС.