СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СТАФИЛОКОККОВОГО БАКТЕРИОФАГА Российский патент 2002 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству медико-биологических препаратов, и может быть использовано при получении стафилококкового бактериофага.

В связи с ростом производства препаратов бактериофагов, в частности стафилококкового бактериофага, возникает необходимость изыскания рациональных питательных сред для его получения с использованием доступных и стандартных субстратов, обеспечивающих высокую литическую активность получаемого препарата.

Наиболее близкой к заявляемой по технической сущности и достигаемому результату, выбранной в качестве прототипа, является питательная среда, защищенная патентом РФ 1526225, кл. С 12 N 7/00, опубл. 27.05.1995.

Среда содержит в качестве источника органического азота и физиологически активных веществ свиной пептон, однако сырьем для него служат дефицитные свиные желудки, не являющиеся стандартным продуктом, что исключает возможность получения стандартизированной (по аминному азоту) питательной среды.

Задача, решаемая предлагаемым изобретением, - создание среды для культивирования стафилококкового бактериофага, обладающего высокой литической активностью, из недефицитного сырья.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении стандартности (по аминному азоту) среды и ее удешевлении.

Указанный результат достигается тем, что среда для культивирования стафилококкового бактериофага, содержащая глюкозу и мясную воду, дополнительно содержит уксуснокислый натрий, панкреатический гидролизат казеина и очищенную воду при следующем соотношении компонентов, на 1 л:
Глюкоза, кг - 0,001-0,002
Мясная вода, л - 0,2-0,5
Уксуснокислый натрий, кг - 0,004-0,005
Панкреатический гидролизат казеина, л - 0,1-0,2
Вода очищенная - Остальное
Среду для культивирования стафилококкового бактериофага готовят следующим образом.

Мясную воду готовят по ФС 42-3235-95, очищенную воду - по ФС 42-2619-97, глюкозу используют по НД 42-8364-98 или ГОСТ 975-88, а уксуснокислый натрий - по ГОСТ 199-78.

Для приготовления панкреатического гидролизата казеина замороженную железу крупного рогатого скота оттаивают, измельчают в мясорубке и помещают в металлические бачки. Казеин, соответствующий ГОСТ 17626-81, взвешивают на весах и загружают в реактор, заливают питьевой водой при температуре (42±1)^oС. Смесь оставляют на 2 часа для набухания. Затем при включенной мешалке дробно вносят раствор натрия гидроокиси 20%-ный до рН 7,8-8,0.

В реактор с подготовленным казеином добавляют промолотую поджелудочную железу, включают мешалку, перемешивают, 20%-ным раствором натрия гидроокиси коррегируют рН до 7,8-8,0, добавляют хлороформ. Реактор закрывают и проводят гидролиз при температуре (42±1)^oС в течение 5-7 суток с периодическим перемешиванием автоматической мешалкой (каждые 2 ч по 3-5 мин), поддерживая в гидролизате первоначально установленное значение рН аминного азота. В готовом гидролизате содержание аминного азота - 0,48-0,60%, пептидов - 1,8-2,4%, триптофана - 110-120 мг%, хлоридов - 0,18-0,24%. Определение всех показателей проводят по "Методическим указаниям по физико-химическому контролю питательных сред" и ФС 42-3874-99 "Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов".

Для приготовления среды культивирования стафилококкового бактериофага расчетное количество мясной воды из емкости загружают в мерник с помощью вакуума 0,4-0,5 кгс/см. Затем мясную воду под давлением 0,3-0,4 кгс/см вытесняют в котел. Туда же добавляют расчетное количество профильтрованного гидролизата казеина и воды очищенной. Смесь барботируют и доводят до кипения подачей пара в рубашку котла. Через 5 мин от начала кипения раствором натрия гидроокиси 20%-ным устанавливают рН 7,7-7,8. Кипятят 45 мин, вносят расчетное количество натрия уксуснокислого и через 5 мин глюкозу. Затем коррегируют рН до первоначального раствором натрия гидроокиси 20%-ным. Через 5 мин прекращают подачу пара в рубашку котла и отбирают пробу для определения показателей готовой смеси Показатели среды: аминный азот - 0,090-0,100%, хлориды - 0,45-0,55%, рН 7,7-7,8.

Активность среды определяют по ФС 42-3235-95. Определение аминного азота, рН и пептидов осуществляют по ФС 42-3874-99 "Физико-химические, химические и иммунохимические методы контроля медицинских и иммунобиологических препаратов".

Культивирование стафилококкового бактериофага проводят следующим образом.

Смыв суточной агаровой культуры стафилококка засевают в емкость с предлагаемой средой. Плотность посева 50 млн микробных тел в 1 мл среды. Одновременно в среду вносят фильтрат фаголизата. Посев выдерживают в термостате при (37±1)^oС в течение 19±1 час.

Пример 1.

К 0,200 л мясной воды добавляют 0,2 л профильтрованного панкреатического гидролизата казеина и очищенной воды до 1 л. Смесь барботируют и доводят до кипения. Через 5 мин от начала кипения раствором натрия гидроокиси 20%-ным устанавливают рН 7,7-7,8. Кипятят 45 мин и вносят 0,005 кг уксуснокислого натрия и еще через 5 мин глюкозу в количестве 0,001 кг.

Затем коррегируют рН до первоначального раствором натрия гидроокиси 20%-ным. Через 5 мин прекращают подачу пара в рубашку котла и отбирают пробу для определения показателей готовой среды. Показатели среды следующие: аминный азот - 110 мг%, рН 7,7-7,8.

Пример 2 проведен аналогично примеру 1. Данные сведены в таблицу.

Увеличение количества глюкозы в среде более 0,002 кг/л, так же как и уменьшение менее 0,001 кг/л, приводят к снижению роста культуры.

Уменьшение количества мясной воды менее 0,2 кг/л и панкреатического гидролизата казеина менее 0,1 л/л приводит к уменьшению содержания аминного азота в среде, что снижает рост культуры, а увеличение их количеств больше верхних пределов технологически нецелесообразно.

Уменьшение количества уксуснокислого натрия менее 0,004 кг/л, так же как и увеличение более 0,005 кг/л, приводит к нарушению буферных свойств среды.

Предлагаемая среда для культивирования стафилококкового бактериофага имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом:
- повышается стандартность среды (по аминному азоту) за счет использования стандартного сырья - казеина;
- при сохранении достаточно высокой литической активности стафилококкового бактериофага снижается стоимость среды за счет применения менее дефицитных и более дешевых компонентов;
- снижается трудоемкость приготовления среды.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству медико-биологических препаратов, и может быть использовано при получении стафилококкового бактериофага. Среда для культивирования стафилококкового бактериофага содержит следующий состав из расчета на 1 л: глюкоза 0,001-0,002 кг, мясная вода 0,2-0,5 л, уксуснокислый натрий 0,004-0,005 кг, панкреатический гидролизат казеина 0,1-0,2 л, вода очищенная - остальное. Технический результат от использования изобретения заключается в повышении стандартности (по аминному азоту) среды и ее удешевлении при сохранении литической активности бактериофага. 1 табл.

Среда для культивирования стафилококкового бактериофага, содержащая глюкозу и мясную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит уксуснокислый натрий, панкреатический гидролизат казеина и очищенную воду при следующем соотношении компонентов, на 1 л:
Глюкоза, кг - 0,001-0,002
Мясная вода, л - 0,2-0,5
Уксуснокислый натрий, кг - 0,004-0,005
Панкреатический гидролизат казеина, л - 0,1-0,2
Вода очищенная - Остальное