ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 2014 года по МПК A61K35/66 C12N7/00 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству медико-биологических препаратов, и может быть использовано при получении бактериофагов.

В настоящее время на территории Российской Федерации наблюдается рост спроса на лекарственные препараты, содержащие бактериофаги. Как следствие является актуальной проблема массового и безопасного промышленного получения больших количеств различных бактериофагов.

Вопросы безопасности используемых биологических препаратов стоят перед всеми производителями в данной области промышленности. Известные технологии производства бактериофагов используют различные продукты животного происхождения, что может привести как к аллергизации, так и возможному заражению посторонними вирусами животных, микоплазмами и прионами, содержащимися в продуктах животных.

Наиболее близкой к заявляемой по технической сущности и достигаемому результату, выбранной в качестве прототипа, является питательная среда, защищенная патентом РФ 1526225 от 27.05.1995 года. Среда содержит в качестве источника органического азота и физиологически активных веществ свиной пептон, однако сырьем для него служат свиные желудки.

Задача, решаемая предлагаемым изобретением, - создание безопасной среды для культивирования бактериофагов, обладающего высокой литической активностью, на основе сырья неживотного происхождения.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении безопасности среды и уменьшении ее себестоимости.

Указанный результат достигается тем, что среда для культивирования бактериофагов содержит глюкозу, натрий хлористый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, дрожжевой автолизат жидкий и очищенную воду при следующем соотношении компонентов, мас.% на 1 л:

Глюкоза 0,2-0,3

Натрий хлористый 0,25-0,35

Натрий двузамещенный фосфорнокислый 0,15-0,25.

В качестве гидролизат неживотного сырья используется дрожжевой автолизат жидкий, в количестве, соответствующем 0,12-0,15% аминного азота в готовой среде, или экстракт дрожжей сухой в количестве 0,2-0,5% от объема среды.

Вода - остальное.

Среду для культивирования бактериофагов готовят следующим образом.

Расчетное количество гидролизата неживотного сырья загружают в реактор, заливают водой очищенной и перемешивают. Добавляют натрий гидроксид до рН 7,7-7,8. Кипятят 40 мин, вносят расчетное количество натрия уксуснокислого и натрия двузамещенного фосфорнокислого и через 5 мин глюкозу. Затем коррегируют рН до первоначального раствором натрия гидроксида.

Культивирование бактериофагов проводят следующим образом.

Смыв суточной агаровой культуры бактерий засевают в емкость с предлагаемой средой. Плотность посева 4,5-5,5·10⁶ микробных тел в 1 мл среды. Одновременно в среду вносят фильтрат фаголизата. Посев выдерживают в термостате при 36-38°С в течение 18-22 часов.

Изобретение будет описано далее с помощью следующих не ограничивающих примеров.

Пример 1. Приготовление питательной среды

Питательную среду для культивирования бактериофагов готовят следующим образом. В реактор добавляют 5 г экстракта дрожжей сухого, очищенной воды до 1 л и перемешивают. Добавляют натрий гидроксид до рН 7,7-7,8. Кипятят 40 мин, вносят 0,3 г натрия уксуснокислого и 0,2 г натрия двузамещенного фосфорнокислого и через 5 мин 0,25 г глюкозы. Затем коррегируют рН до первоначального раствором натрия гидроксида.

Пример 2. Получение стафилококкового бактериофага

Питательную среду для культивирования стафилококкового бактериофага готовят аналогично Примеру 1. В качестве гидролизата неживотного происхождения используют дрожжевой автолизат жидкий. В реактор заливают 100 литров подготовленной культуральной среды и производят посев стафилококка из расчета 4,5·10⁶ микробных тел на 1 мл среды. В среду одновременно вносят фильтрат стафилококкового бактериофага. Культивирование бактериофагов проводят при температуре (37±1)°С в условиях постоянного перемешивания мешалкой со скоростью 100 об/мин и аэрирования путем подачи стерильного воздуха в объеме (1,5±0,5) л на 1 л среды. Культивирование бактериофагов заканчивают при просветлении культуральной жидкости, оцениваемом визуально как мутность менее 5 единиц по ОСО 42-28-86 П.

Очистку производят стерилизующей фильтрацией: фаголизаты из ферментеров путем подачи стерильного сжатого воздуха фильтруют под давлением 0,08 МПа.

Полученный препарат стафилококкового бактериофага характеризуется литической активностью по методу Аппельмана не ниже 10^-4. При этом препарат свободен от каких-либо продуктов животного происхождения.

Пример 3. Получение фармацевтической композиции на основе стафилококкового бактериофага в таблетках с желудочно-резистентным покрытием

Препарат, полученный в Примере 2, используют для получения фармацевтической композиции. 100 литров отфильтрованного фаголизата с титром по Аппельману не менее 10^-4 подают на ультрафильтрационную установку с помощью насоса под давлением (0,03±0,01) МПа. Концентрированные бактериофаги под давлением (0,015±0,005) МПа подают на каскад микропористых мембран. К 1,05 л стерильного концентрата фаголизатов с титром по Аппельману не менее 10^-7 добавляют 0,006 кг полимера (например, МаКМЦ).

После полного растворения полимера смесь соединяют с наполнителем из кальция карбоната и лактозы или маннита в соотношении 80:15 мас.ч. К 1 л фаголизата добавляют 0,15-0,25 кг наполнителя. Все компоненты наполнителя перед сушкой предварительно стерилизуют. После тщательного перемешивания влажную массу выкладывают тонким слоем на дно кассеты, накрывают стерильной тканью и сушат в сублимационной установке при вакууме от - (7,0-15) Па в течение 28-32 часов до влажности 3-4%. Массу протирают через сито с размером отверстий 1 мм, соединяют со стерильной смесью технологических добавок из микрокристаллической целлюлозы (МКЦ), карбоксиметилкрахмала (КМК), кальция или магния стеарата в соотношении 3:1:1 - 4:2:1 из расчета 15-20% от таблетируемой сухой массы, тщательно перемешивают, прессуют в таблетки и покрывают желудочно-резистентной оболочкой.

1 таблетка массой 0,09-0,11 г эквивалентна 20 мл жидких бактериофагов стафилококков с титром не ниже 10^-4 (по Аппельману). Активность фагов сохранялась без изменения в течение 2 лет при температуре 2-10°С. Литическую активность бактериофага определяют при растворении 5 таблеток в 100 мл питательной среды (1 таблетка в 20 мл). Приготовлено 20 экспериментально-производственных серий бактериофага стафилококка в таблетках с кислотоустойчивым покрытием.

Пример 4. Получение таблетированного дизентерийного бактериофага.

Таблетированный дизентерийный бактериофаг получали по технологии, описанной в примере 3, без предварительной концентрации фаголизатов, поскольку активность данных бактериофагов превышает лимитированный титр 10^-7. Приготовлено 6 экспериментальных серий таблетированного дизентерийного бактериофага. При растворении 1 таблетки массой 0,09-0,11 г в 20 мл питательной среды титр бактериофага был не ниже 10^-4.

Пример 5. Получение таблетированного секстафага (пиобактерифага).

Секстафаг представляет собой смесь шести фагов: фильтратов фаголизатов культур стафилококков, стрептококков, синегнойной палочки, кишечной палочки, клебсиелл и протея. После сведения в один объем в равных соотношениях фильтратов фаголизатов вышеперечисленных культур смесь концентрируют в 100 раз и используют для приготовления таблеток, как описано в примере 3. Приготовлено 16 экспериментальных серий секстафага в таблетках. При растворении 1 таблетки массой 0,09-0,11 г в 20 мл питательной среды титры всех фагов не ниже 10^-3 и сохраняются при температуре 2-10°С не менее одного года.

Пример 6. Получение таблетированного бактериофага сальмонеллезного.

Жидкий бактериофаг сальмонеллезный гр. А, В, С, D, Е представляет собой стерильный очищенный фильтрат фаголизатов сальмонелл: гр. А - Salmonella paratyphi A; гр. В - S. paratyphi В, S.typhimurium, S. heidelberg; гр. C-S. newport, S. choleraesuis, S. oranienburg, S. infantis; гр. D-S. dublin, S. enteritidis; гр. E-S. anatum, S. newlands.

Получение концентрированного бактериофага:

- Стерильные фильтраты фаголизатов с титром не менее 10^-5 концентрируют в 50-100 раз с помощью мембранной ультрафильтрации до титра по Аппельману 10^-7. Затем полученные концентраты подвергают стерилизующей фильтрации через каскад микропористые мембраны с размером пор от 0,45 до 0,22 мкм. После этого концентрированные бактериофаги сводят в один объем и в дальнейшем используют для приготовления таблеток.

- К 100 мл концентрированного бактериофага добавляют стабилизатор (полусинтетическое высокомолекулярное соединение - метилцеллюлозу 0,6 г и смесь сахаров - сорбит 20 г, лактозу 34 г). После растворения ингредиентов стабилизированную гелеобразную массу вымешивают наполнителями - кальция карбонатом 38 г и натрия альгинатом 7,4 г (обеспечивающим каркас избирательной распадаемости таблетированных фагов (потенциальную желудочную резистентность). Соотношение бактериофага и наполнителей составляет 1:1. Все наполнители перед сушкой предварительно стерилизуют в сушильно-стерилизационном шкафу дважды с суточным интервалом в течение 4-х часов при температуре 110°С. После тщательного перемешивания полученную гомогенную пастообразную массу выкладывают тонким слоем на дно кассеты, накрывают стерильной тканью и вакуумно или сублимационно высушивают в сублимационной установке до влажности 3-4%. Технологические потери при сушке и измельчении компенсируются за счет сухого остатка бактериофага, поэтому реальный выход полуфабриката соответствует регламентной суммарной загрузке компонентов. Сухую массу протирают через сито с размером отверстий 1 мм, соединяют со стерильной массой целевых добавок (вспомогательных антифрикционных веществ - 1,0 г магния стеарата), тщательно перемешивают и прессуют в таблетки массой 0,2 г, эквивалентные по объему 20 мл коммерческого препарата.

Пример 7. Получение таблетированного Секстафага (Пиобактериофага поливалентного).

Препарат получают аналогично примеру 6. К 130 мл концентрированного бактериофага добавляют стабилизатор (полусинтетическое высокомолекулярное соединение - метилцеллюлозу 1,0 г и смесь сахаров - сорбит 15 г, лактозу 20 г). После растворения ингредиентов стабилизированную гелеобразную массу вымешивают наполнителями - кальция карбонатом 80 г и натрия альгинатом 14 г (обеспечивающим каркас избирательной распадаемости таблетированных фагов (потенциальную желудочную резистентность). Соотношение бактериофага и наполнителей составляет 1,3:1. Последующий технологический процесс аналогичен примеру 6.

Прессуют в таблетки массой 0,153 г, эквивалентные по объему 20 мл коммерческого препарата.

Таким образом, получаемые препараты бактериофагов характеризуются повышенной чистотой за счет снижения примесей, имеющих животное происхождение, что положительно влияет на организм человека, во время их приема, за счет снижения риска возникновения аллергических реакций.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при производстве медико-биологических препаратов. Фармацевтическая композиция содержит бактериофаги, полученные путем культивирования на питательной среде, содержащей глюкозу, натрий хлористый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, дрожжевой автолизат жидкий и очищенную воду в заданном соотношении, и высушенные с наполнителем без лиофилизации, в виде таблеток с желудочно-резистентным покрытием. Изобретение позволяет повысить безопасность фармацевтической композиции. 7 пр.

Фармацевтическая композиция для лечения и профилактики бактериальной инфекции, содержащая бактериофаги, высушенные с наполнителями без лиофилизации, в виде таблеток с желудочно-резистентным покрытием, отличающаяся тем, что она содержит бактериофаги, полученные путем культивирования на питательной среде, содержащей глюкозу, натрий хлористый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, дрожжевой автолизат жидкий и очищенную воду при следующем соотношении компонентов, мас.% на 1 л:
Глюкоза 0,2-0,3 Натрий хлористый 0,25-0,35 Натрий двузамещенный фосфорнокислый 0,15-0,25 Дрожжевой автолизат жидкий 0,2-0,5 Вода остальное