СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ ИЗ ФОЛЛИКУЛЯРНОЙ ЖИДКОСТИ Российский патент 2002 года по МПК A61K35/54 

Изобретение относится к области биологической химии и может быть использовано для получения из органического материала белков семейства трансформирующих ростовых факторов (TGF-β).
Имеются многочисленные материалы, свидетельствующие о важной роли белков семейства трансформирующих ростовых факторов в контроле роста и дифференцировки клеток.

Белки семейства TGF-β являются ростовыми факторами для остеобластов, восстанавливая дефекты в пораженной кости, возникшие в результате травм или в процессе метастазирования. Рост ранних эмбриональных фибробластов стимулируется этими факторами, тогда как на поздних стадиях их развития - ингибируется. Эти белки ингибируют рост большинства эпителиальных клеток, так же как и предшественников гематопоэтических и лимфоидных клеток. Белки этого семейства в раннем эмбриогенезе включают программы дифференцировки всех мезодермальных производных в зависимости от своей концентрации. Под влиянием белков этого семейства происходит принудительная дифференцировка злокачественных клеток.

Существующие данные показывают пластичность репертуара клеточных ответов на действие белков данного семейства, но во всех случаях они действуют как включатели клеточных программ, инициирующие новые направления экспрессии генов, что зависит не только от статуса дифференцировки клеток (мишеней), но и от их микроокружения. Следует особо подчеркнуть, что действие белков, составляющих данное семейство, существенно отличается от действия других ростовых факторов, основной точкой приложения которой является митоз.

Совокупность имеющихся данных позволяет считать, что белки этого семейства регулируют транскрипцию генов в клетках-мишенях. Представители этого семейства эволюционно высоко консервативны и между различными представителями этого семейства ростовых факторов определяется от 40 до 80% гомологии.

Изложенное выше убедительно показывает необходимость создания промышленной технологии получения белков данного семейства.

Известен способ получения фолликулярного регуляторного белка (ФРБ), в котором в качестве сырья используют фолликулярную жидкость из яичников свиньи, которую осаждают сульфатом аммония, и полученные фракции пропускают через гель Оранжевый А, уравновешенный буфером Трис-НСl рН 7,5. Связавшиеся фракции элюируют 0,5 М КСl в том же буфере. Фракции, содержащие ингибитор ароматозы, собирали (по Оно), диализовали против дистиллированной воды и лиофилизировали. Далее полученый материал очищают на анионообменной колонке с моно Q, затем элюируют фракции, имеющие ФРБ активность, и очищают их гель-фильтрацией на сферогеле TSK G 300000 W6 в воде жидкостной хроматографией высокого разрешения. Полученный ФРБ концентрируют ультрафильтрацией на Amicon Dia - flow cuctem с Р10 (см. пат. США 5102867, кл А 61 К 35/44, 1992 г.) - наиболее близкий аналог.

В результате анализа известного способа необходимо отметить, что он характеризуется сложностью осуществления, высокой трудоемкостью, невысоким выходом целевого продукта (белка), что осложняет освоение его промышленного производства. Кроме того, использование данного способа не позволяет получить белок с высокой степенью чистоты (согласно приведенной информации в патенте - выделенные ФРБ имеют чистоту примерно 5%).

Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения белков с высокой степенью чистоты, который может быть осуществлен в условиях промышленного производства с высоким процентом выхода белка.

Поставленная задача обеспечивается тем, что в способе получения белков семейства трансформирующих ростовых факторов из фолликулярной жидкости, согласно которому фолликулярную жидкость подвергают осаждению и лиофилизируют осадок, новым является то, что в качестве сырья используют фолликулярную жидкость крупного рогатого скота, которую перед осаждением охлаждают и подвергают центрифугированию в течение 18-25 минут, осаждение примесей проводят охлажденным ацетоном, который добавляют в фолликулярную жидкость в соотношении объемных частей компонентов: фолликулярная жидкость - 2, а ацетон - 3, отстаивают полученную взвесь и подвергают ее центрифугированию в течение 28-35 минут с последующим отбором осадка и его лиофилизацией, причем ацетон охлаждают до температуры -18^oС а центрифугирование осуществляют со скоростью 10000 об/мин.

Использование в качестве сырья для получения белкового препарата фолликулярной жидкости, выделенной из фолликулов яичников крупного рогатого скота, является весьма существенным, так как: во-первых, обеспечивает наличие доступного источника, а во-вторых, как показали исследования, использование в виде сырья фолликулярной жидкости других видов животных не позволяет получить белковый продукт с необходимым выходом белка заданной чистоты. Как показали эксперименты, использование для получения белкового препарата, например, фолликулярной жидкости свиней (патент США 5102867) не позволяет осуществить получение продукта высокой чистоты и достаточно высокого процента выхода.

Охлаждение жидкости перед первичным центрифугированием позволяет сохранить белки в нативном состоянии и увеличить их выход.

Центрифугирование (первичное и повторное) обеспечивает очистку растворимых белков от остатков клеток.

Проведение осаждения в охлажденном ацетоне позволяет очистить препарат от небелковых компонентов.

Лиофилизация остатка позволяет хранить материал достаточно длительное время.

Необходимо отметить, и это подтверждено экспериментально, что заявленный технический результат может быть достигнут только при безусловном выполнении всех действий, отраженных в материалах заявки при строгом соблюдении заявленной их последовательности. Таким образом, признаки, изложенные в формуле изобретения, и последовательность их выполнения являются существенными.

При проведении патентных исследований не обнаружены решения, идентичные заявленному, а следовательно, заявленное изобретение соответствует критерию "новизна".

Сущность изобретения не следует явным образом из известных решений, а следовательно, заявленное изобретение соответствует критерию "изобретательский уровень".

Считаем, что сведений, изложенных в материалах заявки, достаточно для осуществления изобретения.

Способ осуществляют следующим образом.

Для осуществления способа, в качестве органического сырья используют фолликулярную жидкость, выделенную из фолликулов яичников крупного рогатого скота.

Фолликулярную жидкость отбирают из фолликулов яичников и охлаждают. Охлажденную жидкость подвергают центрифугированию со скоростью 10000 об/мин в течение 18-25 минут, в результате чего осаждаются остатки клеток.

Скорость и время центрифугирования определены экспериментальным путем.

Далее осуществляют осаждение белков путем добавления в прошедшую центрифугирование жидкость охлажденного ацетона, в результате чего отделяются небелковые примеси.

Полученную в результате осаждения взвесь отстаивают и снова центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 28-35 минут, в результате чего осаждаются белки. Отделяют полученный в результате центрифугирования осадок и лиофилизируют его.

Детально процесс осуществления способа рассмотрен в приведенном примере.

Пример осуществления способа.

Фолликулярную жидкость извлекают (например, шприцем) из фолликулов яичников крупного рогатого скота и охлаждают до 0^oС. Охлажденную фолликулярную жидкость центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 20 минут. Прошедшую центрифугирование жидкость осаждают охлажденным до -18^oС ацетоном, который добавляют в жидкость в объемном соотношении фолликулярная жидкость/ацетон - (2/3). Данное соотношение объемов компонентов позволяет обеспечить наиболее полное осаждение. Полученную осажденную взвесь отстаивают в течение 15 минут при температуре 4^oС и повторно центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 30 минут. После окончания центрифугирования выделяют осадок, который лиофилизируют.

Полученный белок имеет массу 12-80 кДа, чистоту 90-93% и позволяет регулировать рост и дифференцировку клеток и тканей многоклеточного организма. Выход продукта составляет 0,1%. Полученные белки обладают способностью ингибировать рост разнообразных типов клеток. Как показали исследования, это распространяется на опухолевые клетки эпителиального происхождения (карциномы, меланомы), мезодермального происхождения (саркомы), нейронального происхождения (глиобластомы). Кроме того полученные белки могут быть использованы в качестве добавок в культуральные среды при выращивании зародышей и клеток теплокровных in vitro и биотехнологических исследованиях.

Необходимо отметить, что для осуществления способа используется известное, недорогое и доступное оборудование. Промышленная реализация способа возможна в условиях работы животноводческих комплексов, что весьма удобно. Неуказанные технические параметры реализации способа устанавливаются, исходя из инструкций и других материалов, регламентирующих работу оборудования, на котором осуществляется реализация способа.

Изобретение относится к биологической химии, может быть использовано для получения из фолликулярной жидкости белков семейства трансформирующих ростовых факторов. Согласно способу получения белков семейства трансформирующих ростовых факторов из фолликулярной жидкости, последнюю подвергают осаждению и лиофилизируют осадок, в качестве сырья используют фолликулярную жидкость крупного рогатого скота, которую перед осаждением охлаждают и подвергают центрифугированию при 10000 об/мин в течение 18-25 мин, осаждение примесей проводят охлажденным ацетоном, который добавляют в фолликулярную жидкость в соотношении объемных частей компонентов: фолликулярная жидкость - 2, а ацетон - 3, отстаивают полученную взвесь и подвергают ее центрифугированию при 10000 об/мин в течение 28-35 мин с последующим отбором осадка и его лиофилизацией. Технический результат: получение белков высокой степени чистоты в условиях промышленного производства. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ получения белков семейства трансформирующих ростовых факторов из фолликулярной жидкости, согласно которому фолликулярную жидкость подвергают осаждению и лиофилизируют осадок, отличающийся тем, что в качестве сырья используют фолликулярную жидкость крупного рогатого скота, которую перед осаждением охлаждают и подвергают центрифугированию в течении 18-25 мин, осаждение примесей проводят охлажденным ацетоном, который добавляют в фолликулярную жидкость в соотношении объемных частей компонентов: фолликулярная жидкость - 2, а ацетон - 3, отстаивают полученную взвесь и подвергают ее центрифугированию в течении 28-35 мин с последующим отбором осадка и его лиофилизацией, причем центрифугирование осуществляют со скоростью 10000 об. /мин. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ацетон охлаждают до температуры -18^oС.