СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ОНКООВАРИАЛЬНОГО АЛЬФА-1-ГЛОБУЛИНА Российский патент 1994 года по МПК A61K35/54 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской биохимии, и может быть использовано для выделения из тканей и биологических жидкостей онкоовариального альфа-1-глобулина (ОАГ-1). Предлагаемый способ является новым, ранее в научной и медицинской литературе не описан.

ОАГ-1 представляет собой новый опухолеассоциированный антиген аденокарциномы яичников человека. Он идентифицирован антисывороткой, полученной при иммунизации кроликов фракцией сливного экстракта опухолевой и метастатической ткани рака яичников. Более чем в 60% случаев ОАГ-1 выявлен реакцией преципитации в агаре с применением стандартной тест-системы в сыворотке крови больных раком яичников, в 12% случаев при доброкачественных опухолях, в экстрактах первичных аденокарцитом яичников и метастазах рака яичников в сальник, а также в лимфе больных раком яичников и в концентрированных образцах амниотической жидкости при сроке беременности 18-20 недель. Его не удалось выявить этим методом в сыворотке крови 100 доноров (50 мужчин и 50 женщин), в сыворотке крови беременных женщин (8 женщин), больных раком тела матки (16) и миомой матки (16).

ОАГ является термолабильным белком (80^оС х 10 мин), нерастворим при 50% насыщения сульфатом аммония. Молекулярная масса методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом Ж-100 составляет 35± 3 кД, ОАГ нерастворим в кислотах (0,6 М перхлорной, 0,6 М сульфосалицилловой и 5%-ной трихлоруксусной кислотах), не окрашивается на липо-, глико- и ферропротеиды). ОАГ неидентичен известным раковоэмбриональным, плацентарным и острофазовым белкам.

Целью изобретения является разработка способа получения нового опухолеассоциированного онкоовариального альфа-1-глобулина.

Поставленная цель достигается способом получения ОАГ из опухолевой и метастатической ткани путем ионообменной хроматографии экстрактов на ДЭАЭ-сефадексе, осаждении несвязавшейся фракции сульфатом аммония (210-300 г/л), гель-фильтрации растворенного осадка на сефадексе Ж-75, осаждении сульфатом аммония (210-300 г/л) ОАГ-1 из фракций, содержащих его, гель-фильтрации растворенного осадка на сефадексе Ж-150 в летучем аммоний-бикарбонатном буфере с последующей лиофилизацией целевого продукта.

При разработке способа получения ОАГ-1 избегали этапов длительного диализа, многочасовых инкубаций препарата, что может привести к денатурации части молекул выделяемого белка. Была отработана такая последовательность этапов, которая позволяет без диализа выделять препарат ОАГ-1 с выходом около 20% в течение 16-18 ч. Новым в предложенном способе является то, что в результате последовательного применения описанных этапов из экстрактов аденокарциномы яичников или ее метастазов в сальник можно получить новый опухолеассоциированный онкоовариальный альфа-1-глобулин с чистотой препарата 65-75% и выходом около 20% (17-22%). Новый онкоовариальный антиген необходим для разработки специфической иммунодиагностики рака яичников и займет место в ряду известных опухолевых маркеров.

Отрабатывая отдельные этапы способа, проверены и обоснованы параметрические значения концентраций, время, температуры и т.д., что отражено в приведенных примерах.

П р и м е р 1. К 100 мл ДЭАЭ-сефадекса, уравновешенного трис-HСl буфером (0,03 М, рН 7,5), приливают 100 мл экстракта аденокарциномы яичников, содержащей 8 мг ОАГ-1, инкубируют 30 мин и фильтруют через воронку Бюхнера в 100 мл свежего ДЭАЭ-сефадекса, уравновешенного тем же буфером. Через 30 мин отфильтровывают несвязавшуюся с ДЭАЭ фракцию и добавляют к ней 42 г сухого сульфата аммония, перемешивают до полного растворения и объем доводят до 200 мл. Через 30 мин преципитат осаждают центрифугированием, осадок растворяют в 10 мл дистиллированной воды и наносят на колонку с сефадексом Ж-75. К полученному элюату (50 мл с концентрацией ОАГ-1 20 мг/л) добавляют сульфат аммония (210 г/л), инкубируют 1 ч, центрифугируют, осадок растворяют в 5 мл дистиллированной воды и подвергают гель-фильтрации на сефадексе Ж-150, уравновешенном летучим аммоний-бикарбонатным буфером (0,05 М, рН 7,5). Объединяют фракции с мол.м. 33-37 кД и лиофилизируют их. При выделении зоны 30 мл с концентрацией ОАГ 42 мг/л получали препарат частотой около 74%. После лиофилизации было получено 1,9 мг порошка. С учетом концентрации ОАГ 42 мг/л х 0,03 л получено 1,4 мг ОАГ-1 (выход целевого продукта 17%), следовательно, в препарате около 26% примесей.

Следующий пример демонстрирует оптимальные параметрические значения, при которых выход препарата составляет 20%, а чистота 70%.

П р и м е р 2. К 100 мл ДЭАЭ-сефадекса, уравновешенного трис-HСl буфером (0,1 М, рН 8,0), приливают 100 мл экстракта аденокарциномы яичника, содержащей 10 мг ОАГ-1, инкубируют 30 мин и фильтруют через воронку Бюхнера в 100 мл интактного ДЭАЭ-сефадекса, уравновешенного тем же буфером. Через 30 мин отфильтровывают несвязавшуюся с ДЭАЭ фракцию и добавляют к ней 54 г сухого сульфата аммония, перемешивают до полного растворения и объем доводят до 200 мл. Через 30 мин преципитат осаждают центрифугированием, осадок растворяют в 10 мл дистиллированной воды и наносят на колонку с сефадексом Ж-75. К полученному элюату (50 мл с концентрацией ОАГ-1 25 мг/л) добавляют сульфат аммония (270 г/л), инкубируют 1 ч, центрифугируют, осадок растворяют в 5 мл дистиллированной воды и подвергают гель-фильтрации на сефадексе Ж-150, уравновешенном летучим аммоний-бикарбонатным буфером (0,1 М, рН 8,0). Объединяют фракции мол.м. 33-37 кД и лиофилизируют их. При выделении узкой зоны 30 мл с концентрацией ОАГ-1 53,3 мг/л получали препарат чистотой 70%. После лиофилизации было получено 2,5 мг белкового порошка. Выход препарата ОАГ 20%, чистота 70%, примесей 0,75 мг или 30%.

П р и м е р 3. К 100 мл ДЭАЭ-сефадекса, уравновешенного трис-HCl буфером (0,2 М, рН 8,5), приливают 100 мл экстракта аденокарциномы яичника, содержащей 10 мг ОАГ-1, инкубируют 30 мин и фильтруют через воронку Бюхнера в 100 мл интактного ДЭАЭ-сефадекса, уравновешенного тем же буфером. Через 30 мин отфильтровывают несвязавшуюся с ДЭАЭ фракцию и добавляют к ней 60 г сухого сульфата аммония, перемешивают до полного растворения и объем доводят до 200 мл. Через 30 мин преципитат отделяют центрифугированием, осадок растворяют в 10 мл дистиллированной воды и наносят на колонку с сефадексом Ж-75. К полученному с колонки элюату (50 мл с концентрацией ОАГ-1 25 мг/л) добавляют сульфат аммония (300 г/л), инкубируют 1 ч, центрифугируют, осадок растворяют в 5 мл дистиллированной воды и подвергают гель-фильтрации на сефадексе Ж-150, уравновешенном летучим аммоний-бикарбонатным буфером (0,2 М, рН 8,5). Объединяют фракции мол.м. 33-37 кД и лиофилизируют их. При выделении узкой зоны 30 мл с концентрацией 73,3 мг/л получали препарата чистотой 65% . После лиофилизации было получено 3,38 мг белкового порошка. Выход препарата ОАГ-1 22% (2,2 мг), чистота 65%, примесей 1,18 мг (около 35%).

П р и м е р 4. К 100 мл ДЭАЭ-сефадекса, уравновешенного трис-НСl буфером (0,1 М, рН 8,0), приливают 100 мл экстракта из метастазов первичного рака яичников в сальник, содержащего 10 мг ОАГ-1. Дальнейшие этапы полностью аналогичны приведенным в примере 2. Получено 2 мг препарата ОАГ-1 чистотой 70% и выходом 20%.

Данный способ может быть применен для выделения ОАГ-1 и из другого биологического материала. Однако выделение его из сыворотки крови больных раком яичников или амниотической жидкости, видимо, не оправдано из-за труднодоступности материала или чрезвычайно низкой концентрации его в нем (около 0,1 мг/л).

Контроль за чистотой препарата на этапах выделения осуществляли иммунохимическими методами и с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Количественное определение ОАГ-1 проводили иммунохимически.

Опыты по получению моноспецифических антисывороток при использовании в качестве антигена препарата ОАГ-1, полученному по описываемому способу, показали, что препарат обладает достаточной нативностью, высокой иммуногенностью, а полученные антисыворотки - высокой специфичностью.

Предлагаемый способ позволяет в обычных лабораторных условиях с помощью недорогих реактивов получать новый опухолеассоциированный протеин аденокарциномы яичников человека. ОАГ-1 секретируется в кровь больных при раке яичников и способ необходим для получения к нему моноспецифических антисывороток, которые могут быть использованы для разработки специфических методов иммунодиагностики рака яичников и исследований в области экспериментальной онкологии.

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к биологической химии и биотехнологии, и может быть использовано для выделения нового опухолевого маркера - онкоовариального альфа-1-глобулина аденокарциномы яичников человека-из экстрактов первичного и метастатического рака яичников. Онкоовариальный альфа-1-глобулин является необходимым препаратом для получения моноспецифических антисывороток к нему, которые будут использованы для разработки специфических методов иммунодиагностики опухолей яичников. Целью изобретения явилась разработка способа получения нового опухолевого маркера - онкоовариального альфа-1-глобулина. Поставленная цель достигается путем ионообменной хроматографии биологического материала, обработки несвязавшейся фракции сульфатом аммония, центрифугирования и растворения осадка в минимальном объеме дистиллированной воды, гель-фильтрации его на колонке с сефадексом Ж-75, осаждения сульфатом аммония и повторной гель-фильтрации на колонке с сефадексом Ж-150 в летучем аммоний-бикарбонатном буфере с последующей лиофилизацией целевого продукта. В результате последовательного применения указанных операций получается препарат онкоовариального альфа-1-глобулина с чистотой 70% и выходом 20%.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ОНКООВАРИАЛЬНОГО АЛЬФА-1-ГЛОБУЛИНА путем ионнообменной хроматографии экстракта аденокарциномы яичников, осаждения сульфатом аммония при 40 - 55% насыщения с последующей гельфильтрацией растворенного осадка на сефадексе G-75, повторного осаждения сульфатола аммония при 40 - 55% насыщении и гельфильтрации на сефадексе G-150 в 0,05 - 0,2 М аммоний-бикарбонатном буферном растворе pH 7,5 - 8,5 и лиофилизации целевого продукта с мол. м. 33 - 77 кД.