СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ НЕЙРОСЕКРЕТОРНЫХ СТРУКТУР ЭПИТАЛАМУСА МОЗГА МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 1999 года по МПК A61K35/12 G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, точнее к клинической иммунологии, и касается иммунокоррекции тимусзависимых и эпиталамозависимых иммунодефицитных состояний у человека и животных и может найти применение в получении иммуномодулирующих препаратов из секреторных структур мозга, а также в лечении иммунодефицитных состояний, связанных с функциональной недостаточностью тимуса и эпиталамуса мозга.

Известен способ получения из тимуса телят смеси иммунологически активных веществ, превращающих стволовые клетки-предшественники костно-мозгового происхождения в зрелые Т-лимфоциты (смесь веществ под названием "Тимозин"), заключающийся в гомогенизации ткани тимуса в 0,15 М растворе хлористого натрия, центрифугировании при 14000 • g без предварительной инкубации гомогената, т. е. отдельной стадии экстракции, прогревании супернатанта до 80^oC, удалении термоденатурирующих белков, осаждении ацетоном иммунологически активных веществ, высаливании сульфатом аммония, ультрафильтрации, хроматографировании на колонке с сефадексом G-25 и выделении конечного продукта "Тимозина" с мол. м. от 1200 до 14000 дальтон.

Однако этот способ не обеспечивает высокого выхода иммунологически активного материала, способного превращать незрелые клетки-предшественники в зрелые Т-лимфоциты. Из 1 кг тимуса получают до 200 мг сухого конечного продукта, т. е. 0,02%. Активность целевого продукта в количественном тесте in vitro - 300 мкг/мл на 3 • 10⁶ клеток селезенки тимэктомированных мышей, т.е. удельная активность его довольно низкая, препарат вызывает восстановление чувствительности к азатиоприну клеток селезенки тимэктомированых мышей на 50% в минимальной дозе 300 мкг/мл /1/. Способ трудоемок, не отличается экологической чистотой, т.к. требует использования большого количества ацетона (5-кратный объем ацетона по отношению к объему гомогената) /2/.

Известен способ получения иммунологически активного препарата из тимуса телят "Тактивин", вызывающего дифференцировку Т-лимфоцитов, заключающийся в гомогенизации ткани тимуса в 0,15 М растворе хлористого натрия в соотношении 1 к 3, инкубации гомогената в течение 16 ч при +4^oC (стадия аутолитической экстракции), центрифугировании в течение 1 ч при 2000 • g, фильтровании, нагревании до 80^oC в течение 15 мин, удалении денатурирующих белков при 2000 • g в течение 1 ч центрифугированием, осаждении ацетоном, центрифугировании при 2000 • g в течение 30 мин, отмывке ацетоном, высушивании, растворении порошка в 10 мМ натрий-фосфатном буфере pH 7,0, удалении нерастворимого осадка центрифугированием при 30000 • g в течение 40 мин, высаливании сульфатом аммония, центрифугировании при 30000 • g в течение 40 мин, закислении уксусной кислотой до pH 4,0, (трехкратное высаливание сульфатом аммония при различных значениях pH), ультрафильтрации, обессоливании на сефадексе G-15, хроматографировании на сефадексе G-50, выделении фракции с мол. м. 1000 - 6000 дальтон, обессоливании ее на сефадексе G-15, лиофилизации. В результате получают конечный продукт, проявляющий активность в количественном тесте в минимальной дозе 10 мкг (концентрация 10 мкг/мл) на 3 • 10⁶ клеток селезенки тимэктомированных мышей, т.е. восстанавливает чувствительность к азатиоприну на 50% в дозе, в 30 меньшей, чем препарат "Тимозин", получаемый предыдущим способом. Выход целевого продукта из 1 кг тимуса - 100 мг с мол. м. 1000 - 6000 дальтон, т.е. 0,01% /3/.

Однако способ не является экологически чистым, т.к. требует применения большого количества ацетона для осаждения и отмывки препарата, длителен, трудоемок, не обеспечивает высокий выход активного материала (до 0,01% от исходного веса тимуса).

Известен способ получения иммунологически активного материала (смеси веществ под названием "Эпиталамин"), проявляющего активность в тестах in vivo, получаемого из всей области эпиталамуса мозга крупного рогатого скота (КРС), состоящей топографически из эпифиза мозга (шишковидной железы), субкомиссурального органа (скопление секреторных эпендимоцитов III-го желудочка мозга) и габенулярных ядер. Способ заключается в обработке ацетоном исходного материала - всей области эпиталамуса - в течение 48 ч с трехкратной сменой ацетона, измельчении ткани, экстракции в 3% растворе уксусной кислоты при pH 2,5 в присутствии хлористого цинка в течение 72 ч при 1 - 4^oC, центрифугировании при 3000 об/мин в течение 20 мин, осаждении из супернатанта конечного продукта холодным ацетоном, фильтровании, промывке ацетоном и эфиром, высушивании /4/.

Однако способ не обеспечивает выход достаточно активного материала. Выход целевого продукта (эпиталамина) из всей области эпиталамуса от одного животного в среднем составляет 2 мг (примерно из 0,25 - 0,30 г, т.е. примерно 6,6 г в пересчете на 1 кг исходного материала), до 0,6 - 0,7% от сырого веса ткани эпиталамуса мозга. Материал обладает невысокой удельной активностью, так как проявляет свое действие в высоких дозах: стимулирует уровень антителопродуцирующих клеток селезенки (АОК) в минимальной дозе 100 мкг на мышь, увеличивает кожную реакцию на туберкулин у морских свинок в дозе 5 мг на мышь (10 доз по 5 мг в течение 10 дней), активность в тестах in vitro не проявлялась, не показано влияние получаемого данным способом материала на созревание Т-лимфоцитов. Кроме того, способ отличается длительностью, не является экологически чистым, 48-часовая экстракция ацетоном и 72-часовая экстракция в уксусной кислоте не способствуют сохранению нативной активности целевого продукта. Мол. м. получаемого материала от 250 до 11000 дальтон.

Последний способ взят нами в качестве прототипа, так как он применяется для получения иммунологически активных веществ из исходного сырья, как и в заявляемом способе, области эпиталамуса мозга, дает больший выход активного материала в пересчете на общее число активных доз по сравнению с известными способами.

Целью изобретения является повышение количественного выхода активного материала, повышение его удельной активности, упрощение и ускорение способа, повышение его экологической чистоты.

Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа получения иммунологически активных веществ из секреторных структур области эпиталамуса мозга экстракцию активного материала из гомогената проводят 1 - 3,5 ч физраствором pH 4,8 - 5,0, гомогенизацию и экстракцию проводят одностадийно, центрифугируют при 19000 - 20000 об/мин в течение 1 ч, выделяют вещества с мол. м. ниже 10000 дальтон путем хроматографии на сефадексе G-75, лиофилизируют и получают конечный продукт с мол. м. 300 - 3000 дальтон путем гельхроматографии на сефадексе G-25.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве исходного материала берут только секреторный комплекс области эпиталамуса "эпифиз + субкомиссуральный орган (СКО)" без окружающей балластной ткани или каждую из этих структур в отдельности (эпифиз или СКО) с целью повышения специфической удельной активности иммуномодулирующих веществ целевого продукта еще на стадии гомогената ткани. Ткань эпифиза, СКО или их смесь взвешивают, определяют их сырой вес, измельчают ножницами и гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе в физрастворе (0,85 - 0,9% раствор хлористого натрия), pH 4,8 - 5,0, на ледяной бане при 1 - 4^oC в соотношении 1 : 9 (сырой вес в г: объем раствора в мл). Гомогенат инкубируют при 1 - 4^oC в течение 1,5 - 3,5 ч на магнитной мешалке при постоянном перемешивании. После экстракции гомогенат центрифугируют при 19000 - 20000 об/мин в течение 1 ч при 1 - 4^oC, супернатант замораживают и лиофилизируют. Проводят гельхроматографию материала на колонке с сефадексом G-75, уравновешенной дистиллированной водой, предварительно растворив пробы в дистиллированной воде (если остается нерастворимый осадок, то его удаляют центрифугированием при 19000 - 20000 об/мин в течение 30 мин при 1 - 4^oC), элюцию также проводят дистиллированной водой. Колонку предварительно калибруют маркерами с известной молекулярной массой (голубой декстран - 2 • 10⁶, хемотрипсиноген - 25 • 10³, витамин B-12 - 1250, динитрофенил-лейцин - 290 дальтон). Собирают фракции элюата с мол. м. ниже 10000 дальтон (300 - 10000 д), лиофилизируют. Проводят гельхроматографию на колонке с сефадексом G-25, уравновешенной дистиллированной водой, предварительно откалиброванной маркерами (ХТГ - 25 x 10³, B-12 - 1250, ДНФ-л - 290 д), пробы растворяют в дистиллированной воде, элюцию проводят также водой. Из элюата отбирают фракции с мол. м. в диапазоне 300 - 3000 д, лиофилизируют. Определяют вес в г и выход в % целевого продукта от исходного сырого веса ткани по схеме, приведенной в конце описания. Активность полученного материала оценивают в тесте восстановления чувствительности к азатиоприну розеткообразующих клеток селезенки тимэктомированных мышей /1/. Суть метода заключается в следующем. Готовят взвесь клеток селезенки с концентрацией 3 • 10⁷ /мл, а также взвесь свежих эритроцитов барана в 199 среде, концентрация 12 • 10⁷ клеток/мл. В пробирки помещают по 3 • 10⁶ клеток селезенки в объеме 0,1 мл, 1 мкг азатиоприна в 0,05 мл среды 199, различные дозы целевого продукта (1, 5, 10 мкг и т.д.) и доводят объем до 0,4 мл средой 199. Контрольные пробы содержат только клетки селезенки и азатиоприн. Пробы инкубируют 90 мин при 37^oC, после чего добавляют по 0,1 мл 1%-й суспензии эритроцитов барана. Конечный объем пробы 0,5 мл. Пробы центрифугируют при 1000 об/мин, 1 - 4^oC, 5 мин, оставляют на 1 ч при той же температуре, затем подсчитывают количество фоновых розеткообразующих клеток (фРОК). Результаты выражают в процентах восстановления чувствительности фРОК к азатиоприну (A ± a, %) по формуле

где M_k -среднее арифметическое для количества фРОК в контроле у тимэктомированных мышей;
V₀ - среднее арифметическое для количества фРОК у тимэктомированных мышей в опыте, то есть с разными дозами тестируемого целевого продукта;
a - стандартная ошибка в опыте.

Активными считают фракции, вызывающие в какой-либо из доз восстановление чувствительности фРОК к азатиоприну на 50% и более. Минимальную активную дозу принимают на 1 ЕД активности, определяют число таких доз в целевом продукте - общее число ЕД активности, а также удельную активность - число ЕД в 1 мг продукта.

Пример 1. Ткань комплекса "эпифиз + СКО" крупного рогатого скота (КРС) от 10 животных взвешивают - 2,2 г, измельчают ножницами, гомогенизируют на ледяной бане в стеклянном гомогенизаторе в физрастворе pH 4,8, +4^oC в соотношении 1 : 9, т.е. в 19,8 мл, гомогенат выдерживают при +4^oC в холодильнике в течение 2,5 ч на магнитной мешалке при постоянном перемешивании. Затем материал центрифугируют при 20000 об/мин в течение 1 ч при +4^oC, супернатант отбирают, замораживают и лиофилизируют. Проводят гельхроматографию материала на колонке с сефадексом G-75 (размеры колонки: 4 см х 14,5 см, объем = 180 мл): пробы лиофилизата растворяют в дистиллированной воде в концентрации 10 мг/мл, на колонку наносят по 5 мл, элюцию проводят дистиллированной водой. Колонку предварительно калибруют следующими маркерами: ГД - 2 • 10⁶, хемотрипсиноген (ХТГ) - 25 • 10³, витамин B-12 - 1250, ДНФ-л - 290 дальтон. Измеряют экстинкцию элюата при 230 нм, строят профиль элюции, элюат собирают во фракции по 5 мл. Фракции с мол. м. ниже 10000 дальтон объединяют и лиофилизируют. Профиль элюции и выделяемая область в результате хроматографии на сефадексе G-75 показана на фиг. 1. Проводят гельхроматографию на колонке с сефадексом G-25 (размеры колонки 2,5 х 40 см, объем - 200 мл): пробы лиофилизата растворяют в дистиллированной воде в концентрации 10 мг/мл, наносят на колонку по 5 мл, элюцию осуществляют дистиллированной водой. Колонка предварительно откалибрована: ХТГ - 25•10³, B-12 - 1250, ДНФ-л - 290 дальтон; в свободном объеме колонки выходит материал с мол. м. выше 5000 дальтон. Экстинкцию элюата измеряют при 230 нм, строят профиль элюции, фракции собирают по 5 мл. Фракции в области мол. м. 300 - 3000 дальтон объединяют, лиофилизируют, определяют вес полученного целевого продукта от 10 животных - 7,2 мг выход от одного животного в среднем из комплекса "эпифиз-СКО", выход от исходного сырого веса ткани - 3,3%. Профиль элюции и область выхода целевого продукта в результате гельхроматографии на сефадексе G-25 показаны на фиг. 2. В тесте E_аза-РОК определяют минимальную активную дозу целевого продукта, которая восстанавливает чувствительность к азатиоприну фоновых розеткообразующих клеток селезенки тимэктомированных мышей линии C57B1/6 на 50%. Эту дозу принимают за 1 ЕД активности и вычисляют общее число активных минимальных доз в целевом продукте - минимальная доза 1 мкг, общее число минимальных доз до 1 животного - 7200 ЕД, удельная активность продукта - 1000 ЕД в 1 мг. Результаты выхода целевого продукта в мг от одного животного и его активность, полученные в примере 1, представлены в табл. 1. Выход целевого продукта в % представлен в табл. 4. В приведенном примере получения иммунологически активных веществ из нейросекреторных структур эпиталамуса мозга КРС, а именно из комплекса "эпифиз + СКО" по заявляемому способу при проведении экстракции 2,5 ч в физрастворе выход целевого продукта от одного животного в среднем в 3,6 раз выше, чем у авторов прототипа (7,2 мг по сравнению с 2 мг).

Примеры 2, 3, 4, 5 осуществляют так же, как и пример 1, за исключением того, что экстракцию активного материала из гомогената ткани проводят 1 ч, 1,5 ч, 3,5 ч и 24 ч соответственно при всех прочих равных условиях. Результаты, полученные в примерах 1 - 5, приведены в табл. 1 и в табл. 4.

Пример 6. Проводят выделение целевого продукта по прототипу. Берут ткань всей области эпиталамуса, включающую эпифиз и СКО, от 10 животных (сырой вес - 3,0 г), обрабатывают ацетоном в течение 48 ч при +4^oC с заменой ацетона через каждые 24 ч, подсушивают после ацетона, измельчают механически до порошкообразного состояния, добавляют 3% уксусную кислоту, доводят pH до 2,5 уксусной кислотой, проводят экстракцию при +4^oC с 0,1% хлористым цинком при перемешивании в течение 72 ч, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин, супернатант обрабатывают холодным ацетоном в течение 2 ч в соотношении 1 к 5, удаляют надосадочную жидкость, осадок промывают ацетоном 3 раза, эфиром 3 раза при +4^oC, подсушивают на воронке Бюхнера, взвешивают, определяют сухой вес целевого продукта от 10 животных - 20 мг и от одного животного - 2 мг. Минимальная активная доза целевого продукта в тесте E_аза-РОК, восстанавливающая чувствительность к азатиоприну фоновых розеткообразующих клеток селезенки тимэктомированных мышей линии C57B1/6 на 50%, составляет 100 мкг, общее число минимальных активных доз от одного животного - 20 ЕД, удельная активность - 10 ЕД в 1 мг продукта. Результаты представлены в табл. 1. Выход целевого продукта в % от сырого веса исходной ткани - 0,67%, результат представлен в табл. 4.

Примеры 7, 8, 9, 10 и 11 проводят так же, как и пример 1, за исключением того, что в качестве исходного сырья используют только ткань эпифиза из области эпиталамуса мозга, выделяют из 3,3 г ткани, определяют общий выход целевого продукта и его активность. Результаты представлены в табл. 2. Выход в % от сырого веса исходного материала представлен в табл. 4.

Пример 12 проводят, как в примере 6 (по прототипу), за исключением того, что целевой продукт выделяют только из ткани эпифиза. Выход в мг и активность продукта представлены в табл. 2, выход в % от исходного сырого веса - в табл. 4.

Примеры 13 - 16 осуществляют так же, как пример 1, за исключением того, что целевой продукт выделяют только из ткани СКО, из 3,3 г. Результаты представлены в табл. 3 и табл. 4.

Пример 17 осуществляют, как пример 6 (по прототипу), за исключением того, что целевой продукт выделяют только из ткани СКО, из 3,3 г. Результаты представлены в табл. 3 и табл. 4.

Как видно из табл. 1, выход целевого продукта в мг только из секреторного комплекса области эпиталамуса - "эпифиз + СКО" - от одного животного (КРС) по заявляемому способу при экстракции 1 - 3,5 ч физраствором в 3,5 - 4 раза выше, чем достигаемый по прототипу. Минимальная активная доза продукта, получаемого по заявляемому способу при экстракции 2,5 ч, в 100 раз ниже, чем получаемого по прототипу, то есть выход общего числа минимальных активных доз в 360 раз выше (для крайних значений интервала времени экстракции 1,0 и 3,5 ч - в 40 раз выше), чем по прототипу, а удельная активность в 100 раз выше (для крайних значений интервала - 1 и 3,5 ч - в 10 раз).

Как видно из табл. 2, выход целевого продукта только из ткани эпифиза КРС достигаемый заявляемым способом при экстракции 1 - 3,5 ч физраствором, в 2 - 2,5 раза выше, чем по прототипу из ткани эпифиза. Общее число минимальных активных доз возрастает в 200 раз (для крайних значений времени 1 ч и 3,5 ч - примерно в 50 раз), минимальная активная доза снижается в 100 раз, удельная активность повышается в 100 раз при экстракции 2,5 ч (для крайних значений интервала времени - в 10 раз) по сравнению с прототипом.

Как видно из табл. 3, выход целевого продукта из ткани СКО, достигаемый заявляемым способом, в 2 - 3 - 4 раза выше, чем из того же количества исходной ткани СКО, но достигаемый при выделении по прототипу. Активность продукта увеличивается в 100 раз, выход минимальных активных доз более чем в 250 раз.

Как видно из приведенных примеров, новый способ получения иммунологически активных веществ из секреторных структур области эпиталамуса мозга животных (КРС) позволяет осуществление процедур в экологически чистых условиях (без использования ацетона, эфира и уксусной кислоты), обеспечивает повышение количественного выхода активного материала в 3 - 4 раза, повышение удельной активности в 10 - 100 раз, упрощение и ускорение способа.

Список литературы
1) Dardenne V., Bach I.-F. (The sheep-cell rosette assay for the avaluation of thymic hormones.) In: Biological activity of thymic hormones. Ed. by Van Bekkum D.W. Rotterdam - 1975, p. 235 - 245.

2) Goldestein A. L. , Thurman G.B., Conen G.H., Hooper J.A. (Thymosin: chemistry, biology, and clinicak applications) In: Biological activity of thymic hormones. Ed. by D.W Van Bekkum. Rotterdam - 1975, p. 235 - 245.

3) Арион В.Я. Выделение, физико-химические свойства и биологическая активность Т-активина. В кн. Итоги науки и техники. Сер. Иммунология. М., ВИНИТИ, 1982, т. 10, с. 45 - 53.

4) Хавинсон В.Х. "Выделение их эпифиза физиологически активных веществ и изучение их влияния на перевиваемые опухолитинекоторые функции организма." Л., канд. диссертация 1978.

Изобретение относится к области медицины, точнее к способу получения иммунологически активных веществ из нейросекреторных структур эпиталамуса млекопитающих. Сущность способа заключается в том, что он включает измельчение, гомогенизацию секреторной части эпиталамуса, экстракцию, центрифугирование, очистку и высушивание целевого продукта. Новым в способе является гомогенизация в физрастворе рН 4,8-5,0 без предварительной обработки ацетоном, экстракция тем же раствором в течение 1-3,5 ч при постоянном перемешивании, центрифугирование при 19-20•10³ оборотах в минуту в течение 1 ч, выделение активного материала с мол.м. 300-3000 дальтон путем гельхроматографии последовательно на сефадексе G - 75 и G -25 и высушивание целевого продукта путем лиофилизации. Технический результат - повышение количественного выхода активного материала, его удельной активности, упрощение способа, повышение его экологической чистоты. 2 л., 4 табл.

Способ получения иммунологически активных веществ из нейросекреторных структур эпиталамуса мозга млекопитающих путем гомогенизации, экстракции с последующим центрифугированием, очисткой и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что используют только секреторный комплекс эпиталамуса, гомогенизацию и экстракцию осуществляют одностадийно физиологическим раствором в течение 1 - 3,5 ч, а выделение целевого продукта с мол.м. 300 - 3000 дальтон проводят гельхроматографией последовательно на сефадексе G-75 и G -25.