СПОСОБ ОЧИСТКИ БЕЛКА СЕМЕЙСТВА ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ, ПОЛУЧЕННОГО ИЗ ФОЛЛИКУЛЯРНОЙ ЖИДКОСТИ Российский патент 2003 года по МПК A61K35/54 

Изобретение относится к области биологической химии и может быть использовано для очистки белка семейства трансформирующих ростовых факторов (TGF-β), полученного из фолликулярной жидкости крупного рогатого скота.

Имеются многочисленные материалы, свидетельствующие о важной роли белков семейства трансформирующих факторов роста β в контроле роста и дифференцировки клеток.

Белки семейства TGF-β являются ростовыми факторами для остеобластов, восстанавливая дефекты в пораженной кости, возникшие в результате травм или в процессе метастазирования. Рост ранних эмбриональных фибробластов стимулируется этими факторами, тогда как на поздних стадиях их развития - ингибируется. Эти белки ингибируют рост большинства эпителиальных клеток, так же как и предшественников гематопоэтических и лимфоидных клеток. Белки этого семейства в раннем эмбриогенезе включают программы дифференцировки всех мезодермальных производных в зависимости от своей концентрации. Под влиянием белков этого семейства происходит принудительная дифференцировка злокачественных клеток.

Существующие данные показывают пластичность репертуара клеточных ответов на действие белков данного семейства, но во всех случаях они действуют как включатели клеточных программ, инициирующие новые направления экспрессии генов, что зависит не только от статуса дифференцировки клеток (мишеней), но и от их микроокружения. Следует особо подчеркнуть, что действие белков, составляющих данное семейство, существенно отличается от действия других ростовых факторов, основной точкой приложения которой является митоз.

Совокупность имеющихся данных позволяет считать, что белки этого семейства регулируют транскрипцию генов в клетках-мишенях. Представители этого семейства эволюционно высоко консервативны и между различными представителями этого семейства ростовых факторов определяется от 40 до 80% гомологии.

Изложенное выше убедительно показывает необходимость создания промышленной технологии очистки белков данного семейства.

Известен способ очистки фолликулярного регуляторного белка (ФРБ), согласно которому первоначально очистку осуществляют на анионообменной колонке с моно Q, затем элюируют фракции, имеющие ФРБ активность, и очищают их гель-фильтрацией на сферогеле TSK G 300000 W6 в воде жидкостной хроматографией высокого разрешения. Полученный ФРБ концентрируют ультрафильтрацией на Amicon Dia - flow cuctem с PN 10 (см. пат. США 5102867, кл. А 61 К 35/44, 1992 г.) - наиболее близкий аналог.

В результате анализа известного способа необходимо отметить, что он характеризуется сложностью осуществления, высокой трудоемкостью, невысоким выходом целевого очищенного продукта (белка), что осложняет освоение его промышленного производства. Кроме того, использование данного способа не позволяет получить белок с высокой степенью чистоты (согласно приведенной информации в патенте США - выделенные ФРБ имеют чистоту примерно 5%).

Задачей настоящего изобретения является разработка способа очистки белка, полученного из фолликулярной жидкости до высокой степени чистоты, исключающего (по крайней мере, сводящего к минимуму) применение вредных веществ, который может быть осуществлен в условиях промышленного производства с высоким процентом выхода белка.

Поставленная задача обеспечивается тем, что в способе очистки белка семейства трансформирующих ростовых факторов, полученного из фолликулярной жидкости, согласно которому препарат подвергают гель-фильтрации и очистке хроматографией, новым является то, что перед проведением гель-фильтрации препарат растворяют в буфере с нейтральным значением рН, фильтруют раствор и осуществляют его ионообменную хроматографию, после чего отбирают активную фазу и осуществляют ее гель-фильтрацию, фильтруют активную фазу и осуществляют двухступенчатую очистку фильтрата, причем на первой ступени очистку фильтрата осуществляют хроматографией высокого давления по принципу обратной фазы, на второй ступени очистку осуществляют препаративным изоэлектрофокусированием, причем в качестве буфера может быть использован буфер "HEPES".

Фильтрацию раствора буфера и белкового сырья осуществляют через нитроцеллюлозный фильтр.

Фильтрация через нитроцеллюлозный фильтр освобождает препарат от высокомолекулярных примесей.

Гель-фильтрация разделяет белки по размерам.

Последовательное использование операций очистки: ионообменной хроматографией, хроматографией высокого давления по принципу обратной фазы и препаративным изоэлектрофокусированием обеспечивает разделение белков по гидрофильности и изоточкам.

Необходимо отметить, и это подтверждено экспериментально, что заявленный технический результат может быть достигнут только при безусловном выполнении всех действий, отраженных в материалах заявки при строгом соблюдении заявленной их последовательности. Таким образом, признаки, изложенные в формуле изобретения, и последовательность их выполнения являются существенными.

При проведении патентных исследований не обнаружены решения, идентичные заявленному, а следовательно, заявленное изобретения соответствует критерию "новизна".

Сущность изобретения не следует явным образом из известных решений, а следовательно, заявленное изобретение соответствует критерию "изобретательский уровень".

Считаем, что сведений, изложенных в материалах заявки, достаточно для осуществления изобретения.

Способ очистки белка семейства трансформирующих ростовых факторов, полученного из фолликулярной жидкости, осуществляют следующим образом.

Для осуществления способа, в качестве сырья используют белок, выделенный из фолликулов яичников крупного рогатого скота.

Белковый препарат растворяют в буфере с нейтральным значением рН и осуществляют фильтрацию полученного раствора, через нитроцеллюлозный фильтр, затем осуществляют ионообменную хроматографию полученного в результате фильтрации супернатанта (надосадочной жидкости).

Отбирают активную фракцию и очищают ее гель-фильтрацией. Далее фильтруют полученный продукт и собирают фильтрат, который подвергают двухступенчатой очистке, причем на первой ступени очистку ведут хроматографией высокого давления по принципу обратной фазы, на второй ступени осуществляют очистку препаративным изоэлектрофокусированием.

Далее осуществляют контроль количества и качества очищенного белка.

Детально процесс осуществления способа рассмотрен в приведенном примере.

Пример.

Белок из фолликулярной жидкости может быть получен следующим образом.

Фолликулярную жидкость извлекают (например, шприцем) из фолликулов яичников крупного рогатого скота и охлаждают до 0^oС. Охлажденную фолликулярную жидкость центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 20 мин. Прошедшую центрифугирование жидкость осаждают охлажденным до -18^oС ацетоном, который добавляют в жидкость в объемном соотношении фолликулярная жидкость/ацетон - (2/3). Данное соотношение объемов компонентов позволяет обеспечить наиболее полное осаждение. Полученную осажденную взвесь отстаивают в течение 15 мин при температуре 4^oС и повторно центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 30 мин. После окончания центрифугирования выделяют осадок, который лиофилизируют.

Очистку полученного белка осуществляют следующим образом.

Выделенный из фолликулярной жидкости фолликулов яичников крупного рогатого скота порошкообразный белковый препарат растворяют в буфере с нейтральным значением рН. В качестве буфера целесообразно использовать HEPES рН 7,2 из расчета 1 мг сырья (порошка) на 1 мг буфера. Раствор фильтруют через нитроцеллюлозный фильтр (например, фильтр "Millipor" с диаметром перфораций 0,22 мкм).

Полученный супернатант подвергают ионообменной хроматографии. Далее полученный в результате ионообменной хроматографии компонент пропускают через 8 мм колонку (Cybracon фирмы ICN) с тем же буфером, длиной 200 мм и отбирают активную фракцию, которую очищают гель-фильтрацией (например, на 31 мм колонке с Sephadex G - 100). Полученный продукт фильтруют через фильтр УПМ - 200 и собирают фильтрат.

Далее осуществляют двухступенчатую очистку фильтрата.

На первой ступени очистку фильтрата осуществляют хроматоргафией высокого давления по принципу обратной фазы.

На второй ступени очистки фильтрата используют препаративное изоэлектрофокусирование. Очистку можно осуществлять в Ultrodex (LKB, Швеция) в диапазоне Ampholine 5-8.

В результате получают белок с выходом примерно 90% и чистотой примерно 95%, который по своим свойствам может быть отнесен к семейству TGF-β.
Контроль количества выделенного белка - спектрофотометрический (окраска по Bradford, 1973).

Контроль чистоты выделенного белка - электрофоретический (по Laemmli, 1971).

Для длительного хранения выделенный белок может быть лиофилизирован. Время проведения каждой операции способа, отмеченной в материалах заявки, определяется исходя из максимальной сохранности активных белков.

Выделенный белок имеет массу 62 кДа и рI 7,5 и, как показали исследования, обладает ярко выраженной опухолесупрессирующей активностью в отношении различных типов опухолей. Белок обладает способностью ингибировать рост разнообразных типов клеток. Это распространяется на опухолевые клетки эпителиального происхождения (карциномы, меланомы), мезодермального происхождения (саркомы), нейронального происхождения (глиобластомы), лимфоидные (лимфомы), миелоидные (лейкозы).

Возможно использование очищенного данным способом белка в качестве самостоятельной лекарственной формы.

Необходимо отметить, что для осуществления способа очистки белка используется известное оборудование. Неуказанные технические параметры реализации способов устанавливаются исходя из инструкций и других материалов, регламентирующих работу оборудования, на котором осуществляется реализация способа.

Изобретение относится к области биологической химии, может быть использовано для очистки белка семейства трансформирующих ростовых факторов (TGF-β). Белок, выделенный из фомикулов яичников крупного рогатого скота, растворяют в буфере с нейтральным значением рН и осуществляют многоступенчатую фильтрацию и очистку полученного раствора, причем раствор первоначально подвергают фильтрации и гель-фильтрации, ультрафильтрацией осуществляют дальнейшую двухступенчатую очистку фильтрата, причем на первой ступени очистку фильтрата осуществляют хроматографией высокого давления по принципу обратной фазы, а на второй ступени очистку осуществляют препаративным изоэлектрофокусированием. Технический результат: разработка способа очистки белка, полученного из фолликулярной жидкости до высокой степени чистоты, исключающего или сводящего к минимуму применение вредных веществ, который может быть осуществлен в условиях промышленного производства с высоким процентом выхода белка. 2 з.п.ф-лы.

1. Способ очистки белка семейства трансформирующих ростовых факторов, полученного из фолликулярной жидкости, согласно которому белок подвергают гель-фильтрации и очистке хроматографией, отличающийся тем, что перед проведением гель-фильтрации препарат растворяют в буфере с нейтральным значением рН, фильтруют раствор и осуществляют его ионообменную хроматографию, после чего отбирают активную фазу и осуществляют ее гель-фильтрацию, фильтруют активную фазу и осуществляют двухступенчатую очистку фильтрата, причем на первой ступени очистку фильтрата осуществляют хроматографией высокого давления по принципу обратной фазы, на второй ступени очистку осуществляют препаративным изоэлектрофокусированием. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве буфера используют буфер "НЕРЕS". 3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что фильтрацию раствора буфера и белкового препарата осуществляют через нитроцеллюлозный фильтр.