ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК М1/N-10G9 ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L., ПРОДУЦИРУЮЩИХ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К ВИРУСУ МАРБУРГ Российский патент 2002 года по МПК C12N5/18 C12P21/08 A61K39/42 G01N33/53 

Изобретение относятся к области биотехнологии и вирусологии, а именно гибридомной технологии, и представляет собой новый штамм гибридных клеток M1/N-10G9 животных Mus musculus L., продуцирующих в клеточных культурах и брюшной полости сингенных животных моноклональные антитела (МКАт) к вирусу Марбург, штамм Рорр, которые могут быть использованы в научных исследованиях и при получении медицинских иммунобиологических препаратов.

Изобретение может быть использовано в вирусологических и иммунологических исследованиях при создании диагностикумов для выявления в пробах вируса Марбург - возбудителя особо опасной геморрагической лихорадки.

Впервые выделенный в 1967 г. во время внутрилабораторной вспышки в ФРГ /1/, относящийся к семейству Filoviridae вирус Марбург /2/, является возбудителем геморрагической лихорадки, характеризующейся высоким уровнем летальности среди заболевших /3/.

Возможность заноса возбудителя в неэндемичные регионы обуславливает необходимость разработки средств и методов его индикации и идентификации, а также диагностики вызываемого им заболевания. В практике лабораторных исследований для решения этих задач наиболее часто применяют серологические тесты, чувствительность и специфичность которых во многом определяется качеством антителсодержащего субстрата. В настоящее время широкое распространение получили тосты, основанные на использовании МКАт, обеспечивающие высокую специфичность, чувствительность методов и воспроизводимость результатов.

Вирионы вируса Марбург содержат 7 структурных белков, из которых единственным поверхностным белком является гликопротеин GP с молекулярной массой (ММ) 125 кД /4/, играющий важную роль в процессе инициации инфекции. Естественно, что при создании тест-системы наиболее эффективным будет использование МКАт именно к этому белку. Полученные недавно МКАт к внутренним структурным белкам вируса Марбург (VP 40, VP 35, NP) /5/, вряд ли могут быть использованы в диагностических целях из-за отсутствия взаимодействия с интактными вирионами.

На данный момент сведения о получении гибридом, продуцирующих МКАт к поверхностному гликопротеину вируса Марбург, в литературе отсутствуют.

Целью настоящего изобретения является получение гибридомы, продуцирующей МКАт к вирусу Марбург, используемые в качестве антителсодержащего субстрата в серологических тестах при индикации и идентификации данного вируса.

Сущность изобретения состоит в том, что в результате слияния миеломы мыши линии NSO и спленоцитов мышей BALB/c, иммунизированных инактивированным вирусом Марбург, при использовании в качестве сливающего агента полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 1450 /6/ и последующего клонирования методом предельных разведений получена гибридома M1/N-10G9, продуцирующая МКАт к вирусу Марбург. Данные МКАт при использовании в составе ИФА-тест-систем (для прямого и непрямого вариантов ИФА) позволяют проводить специфическое выявление вируса Марбург. Разрешающая способность тест-системы на основе МКАт составляет 1,0•10³ БОЕ см^-3, что соответствует максимальной разрешающей способности метода ИФА.

Полученный штамм гибридом обладает следующими характеристиками:
1. Родословная: см. чертеж.

2. Число пассажей к моменту паспортизации: 8.

3. Стандартные условия выращивания in vitro. Посевная концентрация при выращивании in vitro - 2,0...3,0•10⁵ кл•см^-3. Среда культивирования - среда ДМЕМ с добавлением 10% ФТС. Температура культивирования 37^oС. Содержание CО₂ в атмосфере культивирования 5%.

4. Культуральные свойства штамма. Штамм является монослойно-суспензионным, ≈68% клеток находятся в суспензии, не прикрепляясь к поверхности культурального сосуда. Частота пассирования при посевной дозе 2,0...3,0•10⁵ кл•см^-3 - 3...4 суток. Индекс пролиферации при выращивании in vitro - 7,3.

5. Ростовые (кинетические) характеристики: см. таблицу 1.

6. Характеристика культивирования в организме животного: при внутрибрюшинном введении мышам BALB/c 2,0. ..5,0•10⁶ клеток гибридомы на 7...21 сутки формируются асцитические опухоли. Концентрация клеток гибридомы в иммуноасцитических жидкостях (ИАЖ) составляет от 30 до 50•10⁶ кл•см^-3.

7. Цитогенетическая (кариологическая) характеристика.

7.1. Модальный класс - 88-96 хромосом.

7.2 Доля клеток в модальном классе - 52%.

Модальный класс для родительской миеломной линии NSO - 56 хромосом.

8. Цитоморфологическая характеристика; штамм гибридомы представлен крупными округлыми клетками с размерами 20-25 мкм, близкими по морфологии клеткам исходной миеломы линии NSO.

9. Видовая принадлежность: Mus musculus.

10. Онкогенность: гибридома при внутрибрюшинном введении вызывает серозные (в 70% случаев) и солидные опухоли.

11. Маркерные характеристики: штамм продуцирует МКАт к вирусу Марбург.

12. Контроль контаминации: грибковая и бактериальная микрофлора в культуре штамма гибридомы отсутствует.

13. Биотехнологическая характеристика: штамм продуцирует МКАт к вирусу Марбург.

13.1. Титр МКАт при выращивании in vitro - до 1:8192 (в ИФА).

Титр МКАт при выращивании in vivo - до 1:1638400 (в ИФА).

13.2 Характеристика продуцируемых МКАт к вирусу Марбург. Белок-мишень - белок GP вируса Марбург. Изотип продуцируемых иммуноглобулинов - IgG.

13.3. Количество изученных пассажей. In vitro - 30 (см. таблицу 2); in vivo - 5.

14. Способ криоконсервации. Осадок клеток ресуспендируют в среде, содержащей 90% ФТС и 10% DMSO, доводят до конечной концентрации 1,0•10⁶ кл•см^-3 и разливают в пластиковые ампулы по 0,5 см³. Ампулы охлаждают до минус 70^oС в установке для программного замораживания и затем помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом.

Пример наилучшего использования
Гибридому Ml/N-10G9 выращивают in vitro до конечной концентрации 1,0... 1,5•10⁶ кл•см^-3. Клетки гибридомы осаждают с помощью низкоскоростного центрифугирования и вводят внутрибрюшинно мышам ВАLВ/с, предварительно обработанным адьювантом Пристан, по 2,0...5,0•10⁶ клеток в объеме 0,5 см³. Асцитные опухоли формируются на 7...21 сутки после введения гибридомы. Клетки гибридомы осаждают из ИАЖ с помощью низкоскоростного центрифугирования и используют для последующего пассажа in vivo. Супернатант, содержащий МКАт в высоких титрах, используют в качестве полуфабриката для выделения иммуноглобулина, который используют для получении диагностикума (МКАт, коньюгированных с пероксидазой хрена /8/).

В составе диагностических тест-систем МКАт целесообразно использовать в качестве "индикаторных" антител. Данные по чувствительности и специфичности ИФА-тест-системы на основе МКАт представлены в таблицах 3,4.

Источники информации:
1. Agent of disease contacted from green monkeys/ R.E.Kissling, R.Q.Robinson, F.A.Murphy, S.C.Whitefield // Science - 1968. - Vol.160. - P. 888-890.

2. Filoviridae: a taxonomic home for Marburg and Ebola viruses/ M.P. Kiley, E. T. W. Bowen, G.A.Eddy et al.// Intervirol. - 1982.- Vol. 18. - P. 24-32.

3. Siegert R. Marburg virus // Virol. Monogr. - 1972 - Vol. 11. - P. 105-132.

4. Peters C.J., Sanchez A., Rollin P.E. et al. Filoviridae: Marburg and Ebola viruses // Fields Virology/ Eds. B.N. Fields, D.M Knipe, P.M. Howley et al. 3-rd Ed. - Philadelphia, 1996. - P. 1161-1176.

5. Моноклональные антитела к белкам вируса Марбург и их иммунохимические характеристики/ И.А.Разумов, Б.Ф.Беланов, А.А.Букреев, Е.И.Казачинская Вопр. вирусол. - 1998. - 6. - С.274-279.

6. Gefter M. L. , Margulies D.H., Sharff M.D. A simple method for polyethylenglycol promoted hybridization of mouse myeloma cells //Somat. Cell Genet. - 1977. Vol.3.-P.231-236.

7. Васильев Н.Н., Амбросов В.А., Складнев А.А. Моделирование процессов микробиологического синтеза - М., Лесная промышленность, 1975.

8. Nakane P.J., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody: a new method of conjugatior // J. Histochem. Cytochem. - 1974. - Vol.32. - P.1084-1089.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности гибридомной технологии. Гибридома получена путем слияния миеломы мыши линии NSO и спленоцитов мышей BALB/с, иммунизированных инактивированным вирусом Марбург. Продуцируемые гибридомой моноклональные антитела (МКАт) к поверхностному гликопротеину вируса Марбург, штамм Рорр, могут быть использованы в составе ИФА-тест-систем для специфического выявления вируса Марбург. Разрешающая способность тест-системы на основе МКАт составляет 1,0•10³ БОЕ см^-3. Использование гибридомы, продуцирующей МКАт к вирусу Марбург, позволяет осуществлять индикацию и идентификацию данного вируса. 1 ил., 4 табл.

Штамм гибридных клеток животных Mus musculus L. M1/N-10G9, продуцирующих в течение 30 изученных пассажей in vitro моноклональные антитела к структурному белку GP вируса Марбург, штамм Рорр, относящиеся к изотипу IgG, пригодные для приготовления на их основе диагностикумов для специфического выявления вируса Марбург с помощью иммуноферментного анализа.