ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК R1/S-5A6 ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L., ПРОДУЦИРУЮЩИХ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К РИККЕТСИЯМ ПРОВАЧЕКА Российский патент 2003 года по МПК C12N5/18 C12P21/08 A61K39/40 G01N33/53 

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии, а именно гибридомной технологии, и представляет собой новый штамм гибридных клеток R1/S-5A6 животных Mus musculus L., продуцирующих в клеточных культурах и брюшной полости сингенных животных моноклональные антитела (МКАт) к риккетсиям Провачека, штамм Брейнль, которые могут быть использованы в научных исследованиях и при получении медицинских иммунобиологических препаратов.

Изобретение может быть использовано в микробиологических и иммунологических исследованиях при создании диагностикумов для выявления в пробах от людей и переносчиков риккетсий Провачека - возбудителей эпидемического сыпного тифа.

Сыпной тиф - инфекционное заболевание, вызываемое риккетсиями Провачека (Rickettsia prowazekii), сопровождающееся лихорадкой, специфической сыпью, поражением центральной нервной системы и кровеносных сосудов /1/.

В результате проведения крупномасштабных противоэпидемических мероприятий заболеваемость сыпным тифом в СССР к середине 80-х годов была снижена в сотни раз и в ее общей структуре преобладала болезнь Брилля (рецидивная форма заболевания). Однако наличие до настоящего времени всех компонентов триады сыпнотифозного потенциала (очага инфекции, которым являются переболевшие сыпным тифом люди, переносчика инфекции (платяная и, возможно, головная вошь) и восприимчивого населения) обуславливает сохранение эпидемической опасности сыпного тифа для здравоохранения РФ /2/.

Выявление сыпнотифозной инфекции при современном состоянии отечественной медицины является затруднительным в силу как наличия "стертых" форм заболевания, так и неполной готовности системы здравоохранения к проведению мероприятий по быстрой идентификации возбудителя, выявлению источника инфекции и своевременной ликвидации очага заболевания.

Существующие методы диагностики заболевания направлены в первую очередь на выявление специфических антител в сыворотках крови переболевших людей; методы, направленные на выявление в клиническом материале возбудителя заболевания, практически не внедрены в широкую практику /3, 4/.

Риккетсии Провачека - грамотрицательные палочки размером 0,3...0,6-0,8.. . 2,0 мкм; их субмикроскопическое строение схоже с организацией грамотрицательных бактерий /1, 2, 5, 6/. Риккетсиозные элементарные тельца состоят из достаточно большого числа выявленных простых и сложных полипептидов - до 30 /1, 6/.

Фракция оболочек R. prowazekii содержит 5 основных полипептидов с молекулярной массой (ММ) 12400, 21500, 29600, 34000 и 133600 Д, причем суммарная масса этих полипептидов составляет около 54% от таковой всех 30 полипептидов в препарате очищенных телец риккетсий, а целая оболочка, как и поверхностный гликопротеин с ММ 133600 Д, выделенный и исследованный индивидуально, способны индуцировать у животных (белых мышей, морских свинок) образование специфических антител и вызывать определенную устойчивость против инфекции /7-9/.

С помощью МКАт показано, что основные антигены R. prowazekii (видоспецифический термолабильный с MM 90...120 кД и групповой термостабильный с ММ 30 кД) расположены на таких структурах поверхности риккетсий, как микрокапсула и клеточная стенка /10, 11/.

Для обнаружения специфических антигенов возбудителей различных инфекционных заболеваний вирусной и риккетсиозной этиологии в последнее время широкое использование получили экспрессные иммунохимические методы, в частности иммуноферментный анализ (ИФА). В качестве одного из наиболее перспективных направлений повышения эффективности ИФА является использование в качестве антителсодержащего субстрата, применяемого в качестве диагностикума, моноклональных антител. Применение МКАт к R. prowazekii для диагностики риккетсиозов может обеспечить проведение дифференциации риккетсий группы сыпного тифа, исключить ложноположительные реакции, нередко возникающие при использовании тест-систем на основе поликлональных иммунных сывороток. Необходимо также отметить, что использование МКАт позволит стандартизировать производство тест-систем за счет возможности использования антител постоянной авидности и специфичности.

Целью настоящего изобретения является получение гибридомы, продуцирующей МКАт к риккетсиям Провачека, используемые в качестве антителсодержащего субстрата в серологических тестах при индикации и идентификации данного возбудителя.

Сущность изобретения состоит в том, что в результате слияния миеломы мыши линии Sp-2/0 и спленоцитов мышей BALB/c, иммунизированных инактивированным очищенным концентрированным антигеном риккетсий Провачека, при использовании в качестве сливающего агента полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 1000 и последующего клонирования методом предельных разведений получена гибридома R1/S-5A6, продуцирующая МКАт к риккетсиям Провачека. Данные МКАт при использовании в составе ИФА-тест-систем (для прямого и непрямого вариантов ИФА) позволяют проводить специфическое выявление риккетсий Провачека. Разрешающая способность тест-системы на основе МКАт составляет 6,0•10² гемолитически активных риккетсий в кубическом сантиметре (ГАР•см^-3).

Полученный штамм гибридом обладает следующими характеристиками;
1. Родословная: родословная штамма гибридомы R1/S-5A6, продуцирующей МКАт к риккетсиям Провачека, см. чертеж.

2. Число пассажей к моменту паспортизации: 11.

3. Стандартные условия выращивания in vitro. Посевная концентрация при выращивании in vitro - 2,0...3,0•10⁵ кл•см^-3. Среда культивирования - среда ДМЕМ с добавлением 10% ФТС. Температура культивирования 37^oС. Содержание СО₂ в атмосфере культивирования 5%.

4. Культуральные свойства штамма. Штамм является монослойно-суспензионным, ≈34% клеток находятся в суспензии, не прикрепляясь к поверхности культу-рального сосуда. Частота пассирования при посевной дозе 2,0...3,0•10⁵ кл•см^-3 - 3...4 суток. Индекс пролиферации при выращивании in vitro - 9,9.

5. Ростовые (кинетические) характеристики: см. табл. 1.

6. Характеристика культивирования в организме животного: при внутрибрюшинном введении мышам BALB/c 2,0...5,0•10⁶ клеток гибридомы на 7...21-е сутки формируются асцитические опухоли. Концентрация клеток гибридомы в иммуноасцитических жидкостях (ИАЖ) составляет от 30 до 50•10⁶ кл•см^-3.

7. Цитогенетическая (кариологическая) характеристика
7.1. Модальный класс - 58-62 хромосомы.

7.2. Доля клеток в модальном классе - 65%.

Модальный класс для родительской миеломной линии Sp-2/O - 57-59 хромосом.

8. Цитоморфологическая характеристика: штамм гибридомы представлен крупными округлыми клетками с размерами 20-25 мкм, близкими по морфологии клеткам исходной миеломы линии Sp-2/O.

9. Видовая принадлежность: Mus musculus.

10. Онкогенность: гибридома при внутрибрюшинном введении вызывает серозные (в 70% случаев) и солидные опухоли.

11. Маркерные характеристики: штамм продуцирует МКАт к риккетсиям Провачека.

12. Контроль контаминации: грибковая и бактериальная микрофлора в культуре штамма гибридомы отсутствует.

13. Биотехнологическая характеристика: штамм продуцирует МКАт к риккетсиям Провачека.

13.1. Титр МКАт при выращивании in vitro - 1:2560 (в ИФА).

Титр МКАт при выращивании in vivo - 1:163 840 (в ИФА).

13.2. Характеристика продуцируемых МКАт к риккетсиям Провачека. Белок-мишень - белок оболочки риккетсий Провачека с ММ 30 кД. Изотип продуцируемых иммуноглобулинов - IgG.

13.3. Количество изученных пассажей. In vitro - 15 (см. таблицу 2); in vivo - 5.

14. Способ криоконсервации. Осадок клеток ресуспедируют в среде, содержащей 90% ФТС и 10% DMSO, доводят до конечной концентрации 2,0•10⁶ кл•см³ и разливают в пластиковые ампулы по 0,5 см³. Ампулы охлаждают до минус 70^oС в установке для программного замораживания при скорости замораживания 1... 2^oС в минуту и затем помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом.

Пример наилучшего использования
Гибридому R1/S-5A6 выращивают in vitro до конечной концентрации 1,0... 1,5•10⁶ кл•см^-3. Клетки гибридомы осаждают с помощью низкоскоростного центрифугирования и вводят внутрибрюшинно мышам BALB/c, предварительно обработанным адъювантом Пристан, по 2,0...5,0•10⁶ клеток в объеме 0,5 см³. Асцитные опухоли формируются на 7. . .21-е сутки после введения гибридомы. Клетки гибридомы осаждают из ИАЖ с помощью низкоскоростного центрифугирования и используют для последующего пассажа in vivo. Супернатант, содержащий МКАт в высоких титрах, используют в качестве полуфабриката для выделения иммуноглобулина, который используют для получения диагностикума (МКАт, конъюгированных с пероксидазой хрена). В составе диагностической тест-системы МКАт целесообразно использовать в качестве "вторых" и "индикаторных" антител. Данные по чувствительности и специфичности ИФА-тест-системы на основе МКАт представлены в таблицах 3-5.

Источники информации
1. Воробьев А.М., Быков А.С., Пашков Е.П. и др. Микробиология. - М., Медицина, 1998.

2. Здородовский П.Ф., Голиневич Е.М. Учение о риккетсиях и риккетсиозах. - М., Медицина, 1972.

3. Голиневич Е.М. Наставление по серодиагностике сыпного тифа. - М., Медгиз, 1962.

4. Здородовский П.Ф., Соколова М.И. Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней. - М., Медицина, 1965.

5. Winkler H.H., Miller E.T. Phospolipid composition of Rikketsia prowazekii grown in chicken embrio yolk sacs//J.Bacteriol. - 1978. - Vol.136. - P.175.

6. Cordova N., Rehecik J. Microscopie examination of the organs of chicks infected with Rikketsia prowazekii//Acta Virol. - 1964. - Vol.8. - P. 465.

7. Логинов В. С. , Зезеров Е.Г., Ереськин А.В. Изучение полипептидного состава и протективных антигенов риккетсий Провачека//Ж. микробиол. - 1982. - 12. - С.78-83.

8. Биохимическое и иммунохимическое изучение антигенных препаратов риккетсий Провачека/ Е.Г.Зезеров, В.С.Логинов, В.И.Костюков и др.//Ж.микробиол. - 1986. - 1. - С.77-81.

9. Зезеров Е.Г., Логинов В.С., Березнева А.С. Полипептидный и фосфолипидный состав оболочки Rickettsia prowazekii и ее иммуногенные свойства//Ж. микробиол. - 1985. - 6. - С.6-13.

10. Моноклональные антитела к видоспецифическому и групповому антигенам Rikketsia prowazekii/Э. И. Дробышевская, Ю.А.Недялков, С.В.Спицин и др.//Ж. микробиол. - 1990. - 3. - С.68-73.

11. Недялков Ю.А. Моноклональные антитела к Rikketsia prowazekii и разработка на их основе высокоспецифических диагностических препаратов: Автореферат. дис.канд.мед.наук. - М., 1990.

12. Васильев Н.Н., Амбросов В.А., Складнев А.А. Моделирование процессов микробиологического синтеза. - М.: Лесная промышленность, 1975.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности гибридомной технологии. Гибридома R1/S-5A6 получена в результате слияния миеломы мыши линии Sp-2/0 и спленоцитов мышей BALB/c, иммунизированных инактивированным очищенным концентрированным антигеном риккетсий Провачека. Продуцируемые гибридомой моноклональные антитела (МКАт) используют в составе ИФА-тест-систем в качестве антителсодержащего субстрата при индикации и идентификации риккетсий Провачека. Разрешающая способность тест-системы на основе МКАт составляет 6,0•10² гемолитически активных риккетсий в 1 см³ (ГАР•см^-3). Использование гибридомы, продуцирующей МКАт к риккетсиям Провачека, позволяет выявить и идентифицировать возбудителя сыпного тифа. 1 ил., 5 табл.

Штамм гибридных клеток животных Mus musculus L. R1/S-5A6, продуцирующих в течение 15 изученных пассажей in vitro моноклональные антитела к риккетсиям Провачека, штамм Брейнль, относящиеся к изотипу IgG, пригодные для приготовления на их основе диагностикумов для специфического выявления риккетсий Провачека с помощью иммуноферментного анализа.