ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК Э4/N-6G5 ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L., ПРОДУЦИРУЮЩИХ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К ВИРУСУ ЭБОЛА Российский патент 2002 года по МПК C12N5/18 C12P21/08 A61K39/42 G01N33/53 

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии, а именно гибридомной технологии, и представляет собой новый штамм гибридных клеток Э4/N-6G5 животных Мus musсulus L., продуцирующих в клеточных культурах и брюшной полости сингенных животных моноклональные антитела (МКАт) к вирусу Эбола, штамм Заир, которые могут быть использованы в научных исследованиях и при получении медицинских иммунобиологических препаратов.

Изобретение может быть использовано в вирусологических и иммунологических исследованиях при создании диагностикумов для выявления в пробах вируса Эбола - возбудителя особо опасной геморрагической лихорадки.

Уровень техники
Представитель семейства Filоviridaе вирус Эбола впервые был выделен в 1976 г., когда в Заире и Судане произошла вспышка не известного ранее инфекционного заболевания с высокой летальностью (до 90%) и случаями заражения медицинского персонала /1/. Периодически возникающие вспышки данной инфекции на Африканском континенте /2/ и возможность заноса возбудителя в неэндемичные регионы делают необходимой разработку методов индикации возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания.

Одним из наиболее перспективных направлений совершенствования иммунохимических методов идентификации вирусов является использование тест систем на основе МКАт, которые позволяют существенно повысить специфичность производимых анализов, а также решить проблему массового производства диагностикумов /3/.

В настоящее время МКАт получены к представителям большинства семейств вирусов, однако по отношению к представителям семейства Filоviridaе известны две работы /4, 5/, в которых описано получение МКАт к белкам NР и VP 35 вируса Эбола и белкам VР40, VР35 и NР вируса Марбург. Необходимо заметить, что важным в инициации инфекции поверхностным структурным белком филовирусов является белок GР /6, 7/. В связи с этим для получения диагностических препаратов целесообразно получение МКАт к эпитопам этого белка.

На данный момент сведения о получении гибридом, продуцирующих МКАт к структурному гликопротеину вируса Эбола, в литературе отсутствуют.

Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является получение гибридомы, продуцирующей МКАт к вирусу Эбола, используемые в качестве антителсодержащего субстрата в серологических тестах при индикации и идентификации данного вируса.

Сущность изобретения состоит в том, что в результате слияния миеломы мыши линии NSО и спленоцитов мышей ВАLВ/с, иммунизированных инактивированньм вирусом Эбола, при использовании в качестве сливающего агента полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 1000 и последукщего клонирования методом предельных разведении получена гибридома Э4/М-6G5, продуцирующая МКАт к вирусу Эбола. Данные МКАт при использовании в составе ИФА-тест-систем (для прямого и непрямого вариантов ИФА) позволяют проводить специфическое выявление вируса Эбола. Разрешающая способность тест-системы на основе МКАт составляет 1,0.10³ бляшкообразующих единиц (вируса) (БОЕ)•см^-3, что соответствует максимальной разрешающей способности метода ИФА.

Полученный штамм гибридом обладает следующими характеристиками:
1. Родословная: см. чертеж.

2. Число пассажей к моменту паспортизации: 8.

3. Стандартные условия выращивания in vitro. Посевная концентрация при выращивании in vitro - 2,0...3,0•10⁵ кл•см^-3. Среда культивирования - среда ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ФТС). Температура культивирования 37^oС. Содержание СO₂ в атмосфере культивирования 5%.

4. Культуральные свойства штамма. Штамм является монослойно-суспензионным, ≈35% клеток находятся в суспензии, не прикрепляясь к поверхности культурального сосуда. Частота пассирования при посевной дозе 2,0...3,0•10⁵ кл. см^-3 - 3...4 суток. Индекс пролиферации при выращивании in vitro - 7,0.

5. Ростовые (кинетические) характеристики: см. таблицу 1.

6. Характеристика культивирования в организме животного: при внутрибрюшинном введении мышам ВАLВ/с 2,0. ..5,0•10⁶ клеток гибридомы на 7...21 сутки формируются асцитные опухоли. Концентрация клеток гибридомы в иммуноасцитических жидкостях (ИАЖ) составляет от 30 до 50•10⁶ кл•см^-3.

7. Цитогенетическая (кариологическая) характеристика
7.1. Модальный класс - 69-75 хромосом.

7.2. Доля клеток в модальном классе - 61%.

Модальный класс для родительской миеломной линии NSО - 56 хромосом.

8. Цитоморфологическая характеристика: штамм гибридомы представлен крупными округлыми клетками с размерами 20-25 мкм, близкими по морфологии клеткам исходной миеломы линии NSO.

9. Видовая принадлежность: Мus musсulus.

10. Онкогенность: гибридома при внутрибрюшинном введении вызывает серозные (в 70% случаев) и солидные опухоли.

11. Маркерные характеристики: штамм продуцирует МКАт изотипа IgG к вирусу Эбола.

12. Контроль контаминации: грибковая и бактериальная микрофлора в культуре штамма гибридомы отсутствует.

13. Биотехнологическая характеристика: штамм продуцирует МКАт к вирусу Эбола.

13.1. Титр МКАт при выращивании in vitro - 1:1280 (в ИФА).

Титр МКАт при выращивании in vitro - 1:12800 (в ИФА).

13.2. Характеристика продуцируемых МКАт к вирусу Эбола. Белок-мишень - белок GР вируса Эбола. Изотип продуцируемых иммуноглобулинов - IgG.

13.3. Количество изученных пассажей: in vitro - 15; in vitro - 10 (см. таблицу 2).

14. Способ криоконсервации. Осадок клеток ресуспендируют в среде, содержащей 90% ФТС и 10% DМSО, доводят до конечной концентрации 2,0•10⁶ кл.см^-3 и разливают в пластиковые ампулы по 0,5 см³. Ампулы охлаждают до минус 70^oС в установке для программного замораживания при скорости замораживания 1... 2^oС в минуту и затем помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом.

Пример наилучшего использования
Гибридому Э4/N-6G5 выращивают in vitro до конечной концентрации 1,0... 1,5•10⁶ кл•см^-3. Клетки гибридомы осаждают с помощью низкоскоростного центрифугирования и вводят внутрибрюшинно мышам ВАLВ/с, предварительно обработанным адъювантом Пристан, по 2,0...5,0•10⁶ клеток в объеме 0,5 см³. Асцитные опухоли формируются на 7...21 сутки после введения гибридомы. Клетки гибридомы осаждают из ИАЖ с помощью низкоскоростного центрифугирования и используют для последующего пассажа in vitro. Супернатант, содержащий МКАт в высоких титрах, применяют в качестве полуфабриката для выделения иммуноглобулина, который используют для получения диагностикума (МКАт, конъюгированных с пероксидазой хрена /9/). В составе диагностической тест-системы МКАт целесообразно применение в качестве "индикаторных" антител. Данные по чувствительности и специфичности ИФА тест-системы на основе МКАт представлены в таблице 3.

Источники информации:
1. Воwеn F., Рlаtt G., Llоуd G. еt аl. Virаl hаеmorrhagiс fеvеr in sоuthern Sudаn аnd nоrthern Zairе/ Рrеliminary setudies thе аеtiоlоgiс аgеnt // Lаnсеt. - 1977. - Vоl.l. - Р.571-573.

2. Еbоlа hаеmоrrhаgiс fеvеr // Wееkly Ерidеm. Rеs. WHО -1995.- Vоl.7. - Р. 241-242.

3. Борисевич И. В., Краснянский В.П., Михайлов В.В. и др. Разработка и получение иммуноглобулина против лихорадки Эбола/ В сб. Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций. - Кольцово, 1993. - С.44.

4. Моноклональные антитела к вирусу Эбола: получение, характеристика и изучение перекрестной рактивности с вирусом Марбург/ Е.И.Казачинская, А.В. Перебоев, А.А.Чепурнов и др. // Вопр.вирусол.- 2000. - 3. - С.39-44.

5. Разумов И.А., Беланов Е.Ф., Букреев А.А., Казачинская Е.И. Моноклональные антитела к белкам вируса Марбург и их иммунохимическая характеристика // Вопр. вирусол.- 1998. - 6. - С.274-279.

6. Еlliоtt L.Н., Кilеy М. Р., Мс Соrmiс G. В Dеsсriрtivе аnаlysis оf Еbоlа virus рrоtеins // Virоlоgy.- 1985.-Vоl.147. - Р.169-176.

7. Реtеrs С. J., Sаnсhеz А., Rоllin Р.Е. еt: аl. Filоviri-dае: Маrburg аnd Еbоlа virusеs // Fiеlds Virоlоgy/ Еds. B.N. Fiеlds, D.М. Кniре, Р.М. Ноwlеy еt аl. 3-rd. Еd. -Рhilаdеlрhiа, 1996. - Р. 1161-1176.

8. Васильев Н.Н., Амбросов В.А., Складнев А. А. Моделирование процессов микробиологического синтеза. - М., Лесная промышленность, 1975.

9. Nаkаnе Р.J., Каwаоi А. Реrохidаsе-lаbеlеd аntibоdy: а nеw mеthоd of соnjugаtiоn // J. Histосhеm. Сytосhеm. - 1974. - Vol.32.- Р.1084-1089.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности гибридомной технологии. Гибридома получена в результате слияния миеломы мыши линии NSO и спленоцитов мышей BALB/С, иммунизированных инактивированным вирусом Эбола. Гибридома продуцирует моноклональные антитела (МКАт) изотипа IgG к вирусу Эбола, используемые в составе ИФА-тест-системы при индикации и идентификации вируса Эбола. Разрешающая способность тест-системы на основе МКАт составляет 1,0•10³ БОЕ•см^-3. Использование гибридомы позволяет получить МКАт к белку GP вируса Эбола. 1 ил., 3 табл.

Штамм гибридных клеток животных Mus musculus L. Э4/N-6 G 5, продуцирующих в течение 15 изученных пассажей in vitro моноклональные антитела к структурному белку GP вируса Эбола, штамм Заир, относящиеся к изотипу Ig G, пригодные для приготовления на их основе диагностикумов для специфического выявления вируса Эбола с помощью иммуноферментного анализа.