ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК Т2/S-6Е11 ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L., ПРОДУЦИРУЮЩИХ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К КОРОНАВИРУСУ - ВОЗБУДИТЕЛЮ ТЯЖЕЛОГО ОСТРОГО РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА Российский патент 2007 года по МПК C12N5/18 C07K16/08 C12P21/08 G01N33/53 G01N33/569 

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии, а именно гибридомной технологии, и представляет собой новый штамм гибридных клеток T2/S-6E11 животных Mus musculus L., продуцирующих в клеточных культурах и брюшной полости сингенных животных моноклональные антитела (МКАт) к вирусу тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС) штамм СоД, которые могут быть использованы в научных исследованиях и при получении медицинских иммунобиологических препаратов.

Изобретение может быть использовано в вирусологических и иммунологических исследованиях при создании диагностикумов для выявления в пробах вируса ТОРС - возбудителя тяжелого острого респираторного синдрома (атипичной пневмонии).

В конце 2002 г. в странах Юго-Восточной Азии появилась новая, ранее неизвестная нозологическая форма, быстро распространившаяся во многие регионы Земного шара - тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС).

ТОРС представляет собой вирусное респираторное заболевание, характеризующееся скоротечным развитием и высокой летальностью. Механизм передачи заболевания от человека к человеку - воздушно-капельный и, возможно, воздушно-пылевой. Заражение наиболее вероятно в условиях тесного бытового общения.

По данным эпидемиологического наблюдения в период с ноября 2002 г. по июнь 2003 г. заболевание получило наиболее широкое распространение в странах Юго-Восточной Азии (Китай, Гонконг, Тайвань, Сингапур, Вьетнам) и Северной Америки (США, Канада).

По результатам совокупного анализа всех материалов созданной ВОЗ сети из 11 сотрудничающих лабораторий стран, где зарегистрированы случаи заболеваний тяжелым острым респираторным синдромом (ТОРС), установлено, что их этиологическим агентом заболевания является атипичный коронавирус [1-4].

Для диагностики ТОРС использовались вирусологические, серологические, иммуногистохимические, электронно-микроскопические методы диагностики, а также ПЦР-анализ и методы секвенирования генома. Филогенетический анализ показал, что новый вирус не имеет тесной связи с другими известными кластерами коронавирусов (группы 1, 2 и 3) [4].

С учетом эндемичности возбудителя для территории сопредельных с РФ государств и возможности завоза следует констатировать, что ТОРС в настоящее время представляет потенциальную угрозу для здравоохранения РФ.

Учитывая организационные сложности, возникающие при медицинском обеспечении коллективов в чрезвычайных ситуациях, связанных с ликвидацией очагов эпидемических вспышек ГЛПС и ТОРС, актуальной является разработка и создание современных средств медицинской защиты, предназначенных для личного состава групп высокого риска и населения эндемичных районов [5].

В настоящее время приоритетными направлениями создания диагностикумов для выявления возбудителей инфекционных заболеваний являются:

- создание высокоспецифичных, чувствительных тест-систем с использованием современных иммунохимических методов;

- создание молекулярно-биологических тест-систем.

В исследованиях последних лет из иммунохимических методов наиболее широкое распространение получил иммуноферментный анализ (ИФА). Одним из наиболее перспективных путей совершенствования данного метода анализа является применение в качестве диагностикумов моноклональных антител (МКАт), синтезируемых гибридомами, которые получают с помощью соматической гибридизации клеток миеломных опухолей и В-лимфоцитов, продуцирующих антитела после иммунизации животных соответствующим антигеном. МКАт позволяют существенно повысить специфичность производимых анализов, а также решить проблему массового производства диагностикумов [6].

В настоящее время МКАт получены к представителям большинства семейств вирусов, однако на данный момент сведения о получении гибридом, продуцирующих МКАт к представителям семейства Coronaviridae - возбудителям ТОРС данные отсутствуют.

Целью настоящего изобретения является получение гибридомы, продуцирующей МКАт к вирусу ТОРС, используемые в качестве антителсодержащего субстрата в серологических тестах при индикации и идентификации данного вируса.

Сущность изобретения состоит в том, что в результате слияния миеломы мыши линии Sp-2/0 и спленоцитов мышей BALB/c, иммунизированных инактивированным вирусом ТОРС штамм СоД, при использовании в качестве сливающего агента полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 1000 и последующего клонирования методом предельных разведений получена гибридома T2/S-6E11, продуцирующая МКАт к вирусу ТОРС. Полученные МКАт при использовании в составе ИФА-тест-систем (для прямого и непрямого вариантов ИФА) позволяют проводить специфическое выявление вируса ТОРС. Разрешающая способность тест-системы на основе МКАт составляет 2,5·10³ бляшкообразующих единиц (вируса) (БОЕ)·см^-3, что соответствует максимальной разрешающей способности метода ИФА.

Полученный штамм гибридом обладает следующими характеристиками:

1 Родословная: см. чертеж.

2 Число пассажей к моменту паспортизации: 8.

3 Стандартные условия выращивания in vitro

Посевная концентрация при выращивании in vitro - (2,0-3,0)·10⁵ кл·см^-3. Среда культивирования - среда ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ФТС). Температура культивирования 37°С. Содержание СО₂ в атмосфере культивирования 5%.

4 Культуральные свойства штамма

Штамм является суспензионно-монослойным, около 60% клеток находится в суспензии, не прикрепляясь к поверхности культурального сосуда, частота пассирования при посевной дозе (2,0-3,0)·10⁵ кл·см^-3 - 4 суток. Индекс пролиферации при выращивании in vitro - 6,5.

5 Ростовые (кинетические) характеристики: см. таблицу 1.

6 Характеристика культивирования в организме животного

При внутрибрюшинном введении мышам BALB/c (2,0-5,0)·10⁶ клеток гибридомы на 9-18 сутки формируются асцитные опухоли. Концентрация клеток гибридомы в иммуноасцитических жидкостях (ИАЖ) составляет (30-50)·10⁶ кл·см^-3.

7 Цитогенетическая (кариологическая) характеристика

7.1 Модальный класс - 86-94 хромосом.

7.2 Доля клеток в модальном классе - 64%.

8 Цитоморфологическая характеристика

Штамм гибридомы представлен крупными округлыми клетками с размерами 20-25 мкм, близкими по морфологии клеткам исходной миеломы линии NSO.

9 Видовая принадлежность - Mus musculus.

10 Онкогенность

Гибридома при внутрибрюшинном введении вызывает серозные (в 70% случаев) и солидные опухоли.

11 Маркерные характеристики

Штамм продуцирует МКАт изотипа IgG к вирусу ТОРС.

12 Контроль контаминации

Таблица 1
Ростовые и кинетические характеристики гибридомы Т2/S-6E11, продуцирующей МКАт к вирусу ТОРС, при выращивании в различных условияхТ, чС_Т×10⁶ кл·см^-3, х±σР, процент, х±σС∞, ×10⁶ кл·см^-3, х±σβ₁М₀, ч^-1Выращивание в 24-луночных планшетах00,21±0,0178±11,38±0,140,034±0,003240,19±0,0177±6480,36±0,0484±3720,89±0,0786±4961,22±0,13 (88%)76±4Выращивание в пластиковых матрасах00,24±0,0178±11,68±0,100,033±0,003240,23±0,0476±5480,46±0,0580±3720,99±0,0876±4961,45±0,11 (86%)66±4Примечания
1 T - время культивирования.
2 C_T - концентрация клеток на время культивирования, T.
3 Р - доля жизнеспособных клеток.
4 C∞ - равновесная концентрация клеток, рассчитывали в соответствии с [7].
5 β₁М₀ - показатель относительной скорости роста клеток, рассчитывали в соответствии с [7].
6 х - средняя арифметическая.
7 σ - среднее квадратическое отклонение.

Грибковая и бактериальная микрофлора в культуре штамма гибридомы отсутствует.

13 Биотехнологическая характеристика

Штамм продуцирует МКАт к вирусу ТОРС.

13.1 Титр МКАт при выращивании in vitro - 1:1280 (в ИФА). Титр МКАт при выращивании in vivo - 1:12800 (в ИФА).

13.2 Характеристика продуцируемых МКАт к вирусу ТОРС

Изотип продуцируемых иммуноглобулинов - IgG.

13.3 Количество изученных пассажей

In vitro - 15; in vivo - 5 (см. таблицу 2).

Таблица 2
Секреторные характеристики гибридомы T2/S-6E11, продуцирующей МКАт к вирусу ТОРС№ пассажаТитр МКАт в ИФА, ^х/_:2In vitro11:128021:128031:128041:128051:64061:64071:128081:64091:320101:640151:120In vivo11:4096021:4096031:8192041:4096051:40960

14 Способ криоконсервации

Осадок клеток ресуспендируют в среде, содержащей 90% ФТС и 10% DMSO, доводят до конечной концентрации 2,0·10⁶ кл·см^-3 и разливают в пластиковые ампулы по 0,5 см³. Ампулы охлаждают до минус 70°С в установке для программного замораживания при скорости замораживания 1-2°С в минуту и затем помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом.

ПРИМЕР ВЫПОЛНЕНИЯ

Гибридому T2/S-6E11 выращивают in vitro до конечной концентрации (1,0-1,5)·10⁶ кл·см^-3. Клетки гибридомы осаждают с помощью низкоскоростного центрифугирования и вводят внутрибрюшинно мышам BALB/c, предварительно обработанным адъювантом Пристан, по (2,0-5,0)·10⁶ клеток в объеме 0,5 см³. Асцитные опухоли формируются на 9-18 сутки после введения гибридомы. Клетки гибридомы осаждают из ИАЖ с помощью низкоскоростного центрифугирования и используют для последующего пассажа in vivo. Супернатант, содержащий МКАт в высоких титрах, применяют в качестве полуфабриката для выделения иммуноглобулина, который используют для получения диагностикума (МКАт, конъюгированных с пероксидазой хрена [8]). В составе диагностической тест-системы МКАт целесообразно применение в качестве "индикаторных" антител. Данные по чувствительности и специфичности ИФА-тест-системы на основе МКАт представлены в таблице 3.

Таблица 3
Чувствительность и специфичность ИФА-тест-системы на основе МКАт к вирусу ТОРС (n=3).Исследуемый антигенКонцентрация биологически активного вируса, БОЕ·см^-3, X^x/_:S_xКонцентрация белка, г·см^-3, Х^x/_:S_xРезультат выявления антигена в ИФАВирус ТОРС1,0·10^3х/_:1,5-+Антиген вируса ТОРС-1,0·10^-8х/_:1,1+Антиген вируса Эбола-1,0·10^-4x/_:1,1-Антиген вируса Хантаан-1,0·10^-4x/_:1,1-Культура клеток Vero Е-6-1,0·10^-3x/_:1,1-Примечания
1 БОЕ - бляшкообразующая единица (вируса)
2 S_x - среднее квадратичное отклонение для средней геометрической

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. CDC Report on SARS (http://www.cdc.gov/ncidod/sars.' faq.htm).

2. Pei J., SekelHck M.J., Marcus P.I., Choi I.S., Collisson E.W, Chicken interferon type I inhibits infectious bronchitis virus replication and associated respiratory illness. J, Interferon. Cytokine Res. 2001. - V.21, №12. - 1071-1077.

3. Turner R.B., Felton A., Kosak К., Kelsey D.K., Meschievitz C.K. Prevention of experimental coronavirus colds with intranasal alpha-2b interferon. J. Infect. Dis. 1986, V.154, №3. - P.443-7.

4. Ng L.F., Liu D.X. Further characterization of the coronavirus infectious bronchitis virus 3С-like proteinase and determination of a new cleavage site. Virology. 2000, V.272, №1 - Р.27-39.

5. Онищенко Г.Г. Инфекционные болезни - важнейший фактор биоопасности // Эпидемиология и инфекционные болезни - 2003 - №3. - С.4-16.

6. Хаитов P.M., Сидорович И.Г., Игнатьева Г.А. Современные аспекты гибридомной технологии // Обзоры по проблемам медицины. М., 1987, №2. С.2-36.

7. Васильев Н.Н., Амбросов В.А., Складнев А.А. Моделирование процессов микробиологического синтеза. - М.: Лесная промышленность, 1975.

8. Nakane P.J., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody: a new method of conjugation // J. Histochem. Cytochem. - 1974. - Vol.32. - P.1084-1089.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности гибридомной технологии. В результате слияния миеломы мыши линии Sp-2/0 и спленоцитов мышей BALB/c, иммунизированных инактивированным формалином концентрированным очищенным препаратом вируса ТОРС штамм СоД при использовании в качестве сливающего агента полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1000 и последующего клонирования методом предельных разведений получена гибридома T2/S-6E11, продуцирующая МКАт к эпитопам данного возбудителя. Специфичность полученных МКАт продемонстрирована отсутствием перекрестных реакций в ИФА с антигенами вирусов Хантаан и Эбола, а также неинфицированными субстратами накопления вируса ТОРС. ИФА-тест-система на основе МКАт позволяют проводить специфическое выявление в исследуемых пробах вируса ТОРС. Чувствительность тест-системы на основе МКАт составляет 2,5·10³ бляшкообразующих единиц (вируса) в кубическом сантиметре (БОЕ·см^-3). Использование изобретения в иммунологических исследованиях при создании диагностикумов для выявления в пробах вируса ТОРС позволит повысить специфичность анализов при выявлении коронавирусов. 1 ил., 3 табл.

Штамм гибридных клеток T2/S-6E11 животных Mus musculus L., продуцирующих в течение 15 изученных пассажей in vitro моноклональные антитела к коронавирусу - возбудителю тяжелого острого респираторного синдрома, относящиеся к изотипу IgG, пригодные для приготовления на их основе диагностикумов для специфического выявления возбудителя ТОРС с помощью иммуноферментного анализа.