ЛЕЧЕНИЕ КИСТОЗНОЙ БОЛЕЗНИ ПРИ ПОМОЩИ TNF-α Российский патент 2002 года по МПК A61K38/20 A61P13/12 

Настоящее изобретение относится к лечению кистозных болезней. Конкретнее, изобретение относится к лечению поликистозной почечной болезни путем введения TNF-α или реагентов, которые стимулируют производство TNF-α.

Существует много человеческих болезней, которые проявляются образованием кисты, содержащей либо полутвердое, либо жидкое вещество. Содержимое кисты иногда стимулируется из нормально сохраняющейся жидкости (например, жировая киста может содержать жидкость из закупоренной сальной железы) или из паразитической инфекции. Доброкачественные кисты могут встречаться в яичнике, селезенке, легком, почке и печени, где они чаще врожденные. Одни врожденные кисты происходят из эмбриональных пороков развития и развивающихся нарушений, тогда как другие являются прямыми результатами болезненного состояния.

Поликистозные почечные болезни (ППБ) представляют собой группу нарушений, характеризующихся наличием большого числа наполненных жидкостью кист повсеместно в чрезвычайно увеличенных почках (Gabow et al., "Diseases of the Kidney", Schrier et al. eds., 1992). У людей ППБ могут быть получены в наследство в автосоматической доминантной (АДППБ) или автосоматической рецессивной (АРППБ) формах. АДППБ является наиболее распространенной, доминантно-наследуемой болезнью почек у людей, встречающейся с частотой 1 на 800. АРППБ встречается с частотой 1 на 10000. Клинически ППБ представляет собой основную причину почечной болезни на конечной стадии. Микродиссекционное, гистохимическое и иммунологическое исследования показывают, что кисты в почках с АРППБ появляются из локальных расширений медуллярных собирающих потоков (NcDonald, "Semin. Nephrol", 11:632-642, 1991). Мутации по меньшей мере в трех различных локусах связаны у людей с АДППБ, включая ППБ1 в хромосоме 16, ППБ2 в хромосоме 4 и еще не откартированная ППБ3 (Reeders et al., "Nature", 317: 542-544, 1985, Kimberling et al., "Genomics", 18:467-472, 1993; Daoust et al., "Genomics", 25:733-736, 1995). АРППБ мутация найдена на человеческой хромосоме 6 (Zerres et al., "Nature Genet.", 7:429-432, 1994). Молекулярные механизмы, ведущие к увеличению кисты и прогрессирующей потере почечной функции в ППБ, не совсем понятны. Кроме диализа и трансплантации, которые являются паллиативными мерами, не существует профилактического или целебного лечения для ППБ.

В 1977 году было сообщено, что рецессивная врожденная поликистозная почечная (ВПП) болезнь спонтанно возникает у мышей линии C57BL/6J (Preminger et al., "J. Urol", 127:556-560, 1982). Мутация ВПП сопоставлена мышиной хромосоме 12 (Davisson et al., "Genomics", 9:778-781, 1991). Подробно охарактеризованы неправильное развитие почки и прогрессирование ППБ у мышей линии С57ВL/6J-ВПП/ВПП (Preminger, ibid. ; Mandell et al., "Am. J. Pathol", 113: 112-114, 1983). Пораженные животные кажутся нормальными при рождении и имеют микроскопические расширения проксимальных почечных канальцев. Эти расширенные канальцы развиваются в кистах. В возрасте 10-13 дней гомозиготные ВПП/ВПП животные могут быть узнаны по выпуклости брюшной полости, происходящей в результате значительно расширенных канальцев. Спустя 10-12 дней из медуллярных собирающих протоков быстро развиваются дополнительные кисты. Следовательно, почки быстро увеличиваются, достигая почти 2 г в весе почки за 24 дня по сравнению с приблизительно 0,18 г для нормальных почек соответствующего возраста. Расширение кисты сопровождается апоптотической потерей некистозных нефронов (Woo, "New Engl. J. Med", 333:18-25, 1995). Увеличению почки сопутствует постепенное снижение функции почки, при этом азот мочевины крови (АМК) достигает 120 мг/дл в возрасте 24 дней. Поликистозные мыши постепенно становятся вялыми и умирают в возрасте 28-35 дней из-за почечной недостаточности.

Качественные свойства кистозных изменений в человеческом эпителии с ППБ, такие как клеточная гиперплазия и аномальные базальные мембраны, наблюдаются в ВПП кистах как в обычном, так и в электронном микроскопах (Gattone et al., "Am. J. Kidney Dis", 17:606-607, 1991). Накопление жидкости в кистах указывает на патологический перенос жидкости в ВПП кистозном эпителии. Наличие измененного выражения базальной мембраны (Taub et al., "Kidney Int.", 37: 1090-1097, 1990; Ebihara et al., "Lab. Invest.", 58:262-269, 1988), измененного выражения управляющего ростом гена (Horikoshi et al., "Kidney lnt.", 39: 57-62, 1991; Gattone et al., "Dev. Biol.", 138:225-230, 1990; Cowly et al. , "J. Am. Soc. Nephrol", 1:1048-1053, 1991), измененного целеполагания нормально базолатерального натрий-калиевого рецептора АТР-азы и EGF (Avner et al., "Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A.", 89:7447-7451, 1992, Orellana et al., "Kidney Int. ", 47:490-499, 1995) и выражения развивающихся дедифференцированных фенотипов (Harding et al., "Dev. Biol.", 146:483-490, 1991) делает мышь с ВПП полезным животным для изучения различных почечных патологий ППБ. Общее развитие ППБ очень похожи в мыши с ВПП и у людей.

Специальное микроканальцевое лекарственное средство таксол значительно препятствует развитию ППБ и значительно продлевает существование поликистозных мышей с ВПП (Woo et al., "Nature", 368:750-753, 1994, PCT WO 94/08041). Вместо умирания от азотемии в возрасте четырех-пяти недель поликистозные мыши, проходящие еженедельный курс лечения таксолом, могут дожить до возраста более чем шесть месяцев. Таксол связывает микроканальцы и препятствует деполимеризации микроканальцев. Соответственно, цистоскелет микроканальцев обуславливается играть роль в патогенезе ППБ в ВПП мыши. В добавление к его воздействиям, стабилизирующим микроканальцы, таксол характерно вызывает выражение фактора-α некроза опухоли (TNF-α) в макрофагах и лимфоцитах. Способность таксола вызывать производство TNF-α не разделяется другими членами таксановой группы.

TNF-α является плейотропийным делителем клеток, представляющим собой промежуточное средство для различных клеточных реакций, включая цитотоксичность, стаз клеток крови, пролиферацию, дифференциацию и выражение специфических генов (Beutler et al., "Science", 264:667-668, 1994). TNF-α цитотоксичен для широкого ряда опухолевых клеток, но токсичен только для некоторых выбранных нормальных типов клетки (Carswell et al., "Proc. Natl. Acad Sci. U. S.A.", 72:3666-3670, 1975: Tsujimoto et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A", 82: 7626-7630, 1985). Несмотря на наличие клеточных поверхностных рецепторов TNF-α, большинство нормальных клеток млекопитающих невосприимчивы к цитотоксичным воздействиям TNF-α (Tsujimoto et al., ibid.). Вдобавок, TNF-α защищает от апоптотической клеточной смерти в нескольких типах клеток (Wong et al. , "Science", 242:941-944, 1988. Mangan et al., "J. Immunol. ", 146: 1541-1546, 1991; Warner et al.,"Am.J.Physiol.",260:L296-L301, 1991).

Таким образом, имеется необходимость в терапевтическом средстве, способном лечить кистозную болезнь. Настоящее изобретение удовлетворяет этой необходимости.

Одним выполнением настоящего изобретения является использование TNF-α или реагента, который стимулирует производство TNF-α в живом организме, при условии, что названный реагент не является таксолом при приготовлении лекарственного препарата для лечения кистозной болезни. Предпочтительно, реагент представляет собой индометацин, напроксен, ибупрофен, тенидап или имиквод. Согласно одному аспекту этого преимущественного выполнения кистозная болезнь является кистой молочной железы, бронхогенной кистой, кистой общего желчного протока, коллоидной кистой, врожденной кистой, зубной кистой, эпидермоидными включениями, печеночной кистой, эхинококковой кистой, легочной кистой, медиастинальной кистой, яичниковой кистой, периапикальной кистой, перикадиальной кистой или поликистозной болезнью почек. В частном предпочтительном выполнении кистозная болезнь включает в себя поликистозную болезнь почек. Предпочтительно, это лекарство пригодно для внутривенного, внутрибрюшного, внутриартериального, подкожного, перорального или внутримышечного введения.

Другим выполнением данного изобретения является способ лечения млекопитающего с кистозным заболеванием, содержащий шаг введения млекопитающему фармакологически эффективного противокистозного количества TNF-α или реагента, который стимулирует производство TNF-α в живом организме, при условии, что названный реагент не является таксолом, причем реагент вводится в фармакологически приемлемом носителе, наполнителе или разбавителе. Предпочтительно, млекопитающее является человеком. В одном аспекте этого преимущественного выполнения кистозная болезнь является кистой молочной железы, бронхогенной кистой, кистой общего желчного протока, коллоидной кистой, врожденной кистой, зубной кистой, эпидермоидными включениями, печеночной кистой, эхинококковой кистой, легочной кистой, медиастинальной кистой, яичниковой кистой, периапикальной кистой, перикадиальной кистой или поликистозной болезнью почек. Предпочтительно, кистозная болезнь включает в себя поликистозную болезнь почек. Преимущественно, шаг введения выбирается из группы, состоящей из внутривенного, внутрибрюшного, внутриартериального, подкожного, перорального или внутримышечного введения. Предпочтительнее, чтобы шаг введения являлся внутривенным.

Фиг. 1 показывает продолжительность жизни мышей с поликистозной ВПП болезнью, которые проходили курс лечения таксолом. Число дней после введения таксола или плацебо показано на оси х, а коэффициент выживаемости показан на оси у.

Фиг. 2 показывает продолжительность жизни мышей с ВПП болезнью, которые проходили курс лечения TNF-α. Число дней после введения TNF-α или плацебо показано на оси х, а накопленная продолжительность жизни показана на оси у.

Подробное описание предпочтительного выполнения
Настоящее изобретение обеспечивает способ лечения ППБ путем введения TNF-α или реагента, который стимулирует производство TNF-α. Хотя лечение ППБ приведено здесь для примера, лечение любой кистозной болезни находится в объеме изобретения. Такие кистозные болезни включают в себя кисту молочной железы, бронхогенную кисту, кисту общего желчного протока, коллоидную кисту, врожденную кисту, зубную кисту, эпидермоидные включения, печеночную кисту, эхинококковую кисту, легочную кисту, медиастинальную кисту, яичниковую кисту, периапикальную кисту, перикадиальную кисту или поликистозную болезнь почек.

TNF-α или реагент, который стимулирует производство TNF-α, может вводиться различными путями, включая внутривенный, внутрибрюшной, внутримышечный, внутриартериальный, подкожный, пероральный или любой иной подходящий путь, известный в уровне техники, в фармакологически приемлемом носителе, наполнителе или разбавителе. TNF-α для парентерального введения может быть в виде стерильного впрыскиваемого препарата, такого как стерильная впрыскиваемая водная или масляная суспензия. Эта суспензия может приготавливаться в соответствии со способами, общеизвестными в уровне техники, с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих реагентов и суспензирующих реагентов. Стерильный впрыскиваемый препарат может быть также стерильным впрыскиваемым раствором или суспензией в парентерально приемлемом наполнителе или разбавителе, таком как раствор в 1,3-бутанедиоле. Приемлемые разбавители включают в себя, к примеру, воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлористого натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспензирующей среды можно применять обычно стерильные нелетучие масла. Для этой цели можно использовать любое успокаивающее нелетучее масло, включая синтетические моно- и диглицериды. Кроме того, при приготовлении впрыскиваемых препаратов можно аналогично использовать жирные кислоты.

Допустимая доза рекомбинантного TNF- (в фазе I клинических испытаний составляет 150000 ед/кг (Bollon et al. , "J. Cell. Biochem.", 36:353-367, 1988). Предпочтительный диапазон эффективных доз TNF-α для лечения человеческих кистозных болезней находится между 50000 ед/кг и 150000 ед/кг; более предпочтительная доза находится между 75000 ед/кг и 125000 ед/кг; наиболее предпочтительная доза составляет 100000 ед/кг. Это лечение обычно повторяется каждые два или три дня до тех пор, пока не станет наблюдаться значительное улучшение в кистозной болезни. TNF-α может вводиться либо перед образованием кисты для предотвращения ее образования, либо после того, как киста уже обнаружена.

В дополнение к этому в лечении кистозных болезней полезны также реагенты, которые стимулируют выработку TNF-α. Такие реагенты включают в себя, к примеру, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства индометацин, напроксен и ибупрофен ("Drugs Exp. Clin. Res.", 19:243-248, 1993), тенидап (Golding et а1., "J. Immunol", 154:5384-5390, 1995), синтетический нетоксичный аналог липида А (Akimoto et а1., "Int. J. Immunopharmacol.", 16: 887-893, 1994) и имиквод ("J. Leukoc. Biol.", 55:234-240, 1994). Способность таких соединений лечить кистозные болезни можно определить одним из обычных для специалиста путей с использованием модели поликистозной болезни у ВПП мышей, как описано в Примере 1 для лечения TNF-α и таксолом.

Пример 1
Лечение TNF-α и таксолом ВПП мышей
Мыши гетерозиготной породы C57BL/6-ВПП/+ были получены из Джексоновской лаборатории (Бар Харбор, Мэн). Колония ВПП мышей поддерживалась с помощью спаривания известных гетерозигот. Мыши содержались со своими матерями, пока их не отнимали от груди в возрасте 28 дней.

Таксол, полученный из Отделения химии и синтеза лекарств Национального ракового института (Бетесда, Мэриленд), растворялся при 10 мг/мл в диметилсульфоксиде (ДМСО) и хранился при -20^oС. Лечение таксолом начиналось на поликистозных ВПП мышах в возрасте 10 дней, диагностированных в качестве поликистозных наличием пальпируемо увеличенных почек. Мышам впрыскивали внутрибрюшинно 10 мкг таксола на грамм веса тела на 10-й день и 100 мкг таксола на животное в последующие недели. Поликистозные мыши, проходившие курс лечения равным объемом ДМСО, использовались в качестве контрольных.

Еженедельное лечение таксолом явно увеличивает коэффициент выживаемости ВПП мышей (n= 43) по сравнению с контрольными мышами, проходящими лечение (наполнителем носителя) (фиг.1). Когда еженедельное лечение таксолом начиналось в возрасте 10 дней, 60% всех поликистозных мышей выживали после 40 дней жизни, тогда как к этому времени 80% поликистозных ВПП мышей, не проходящих лечения, умирали. 35% поликистозных мышей, проходящих еженедельное лечение таксолом, жили после 90 дневного возраста, тогда как все поликистозные ВПП мыши, проходившие лечение ДМСО, умирали. Статистически разность в выживаемости между контрольными и лечившимися таксолом мышами является весьма значительной (логарифмический ранг по критерию χ-квадрат=7,80, а ρ= 0,005). Серозный креатинин трех лечившихся таксолом поликистозных ВПП мышей после их усыпления в возрасте 90 дней был 2,8±0,8 мг/дл (против 6,0 мг/дл в нелечившейся мыши в возрасте 24 дней).

Стерильный рекомбинантный мышиный TNF-α (1 мг/мл, Генетех, Южный Сан-Франциско, Калифорния) хранился при 4^oС в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР). Начиная с 7-го дня после рождения, всему помету мышей от выборочного спаривания впрыскивали внутрибрюшинно 2 мкл TNF-α через день. После 10 дней только мыши с пальпируемыми поликистозными почками продолжали получать TNF-α. Поликистозные мыши, проходившие аналогичное лечение ФСБР, использовались в качестве контрольных. Все поликистозные мыши проходили непрерывное лечение в течение всей их жизни.

Все опыты с TNF-α начались на 7-й день путем введения TNF-α всему помету. Несмотря на лечение, почки ВПП мышей, проходивших лечение TNF-α на 7-й день, продолжали увеличиваться и становились пальпируемыми на 10-й день. Почки мышей без пальпируемо увеличенных почек на 10-й день были все гистологически нормальными. Фиг. 2 сравнивает выживаемость 21 поликистозной ВПП мыши, которым давали 2 мкг TNF-α через день, и 25 поликистозных ВПП мышей, проходивших аналогичное лечение солевым раствором. Более 90% поликистозных ВПП мышей, проходивших лечение TNF-α, выжили после возраста в 40 дней. В противоположность этому только 20% ВПП мышей, проходивших лечение солевым раствором, выжили после возраста в 40 дней. Почти 50% мышей, проходивших лечение TNF-α, выжили после возраста в 100 дней. В противоположность этому ни одна из мышей, проходивших лечение солевым раствором, не прожила дольше возраста в 90 дней. Статистически разность в коэффициентах выживаемости между контрольными и лечившимися TNF-α ВПП мышами является весьма значительной (логарифмический ранг по критерию χ-квадрат=24,17, а ρ<0,0001). Поскольку известно, что таксол стимулирует производство TNF-α, способность таксола препятствовать развитию ППБ в поликистозных ВПП мышах по меньшей мере частично обязана этой активности.

Для гистологических исследований животные усыплялись и их почки фиксировались на ночь в 10%-ом нейтральном буферном формалине (Фишер Сайентифик, Питтсбург, Пенсильвания), дегидратировались в этаноле, пропитывались и заливались парафином. Приготавливались гистологические срезы толщиной в 5 мкм и окрашивались периодическим кислым красителем Шиффа, противоокрашивались гематоксилином и визуализировались световым микроскопом.

Наблюдался разительный контраст между плотно упакованными функциональными нефронами, видимыми в гистологических срезах нормальных мышей, и апоптотической потерей некистозных нефронов в почках поликистозных мышей. Прямое сравнение между нормальными мышами и поликистозными мышами в возрасте 10 дней выявило потерю приблизительно 50% некистозных нефронов. Почти все оставшиеся некистозные нефроны были быстро и полностью потеряны в течение следующих десяти-четырнадцати дней. На третьей-четвертой неделе после рождения оставалось только малое число поддерживающих жизнь нефронов. В продолжение трех или четырех недель быстрого развития до полной почечной недостаточности в поликистозных ВПП почках не было обнаружено никаких признаков некроза канальцев, интерстициального воспаления или интерстициального фиброза
По сравнению с почками, полученными от азотемической поликистозной ВПП мыши в возрасте 28 дней, почки, полученные от видимо здоровой поликистозной ВПП мыши, проходившей лечение TNF-α в течение 90 дней, были значительно меньше по размеру. Почки от поликистозных ВПП мышей, проходивших лечение TNF-α, выглядели очень похожими на почки от поликистозных ВПП мышей, проходивших еженедельное лечение таксолом в течение того же периода времени, как по величине, так и по гистологическим критериям. И те, и другие из этих проходивших лечение почек имели очень мало и намного меньшие кисты, чем почки от нелечившихся или лечившихся солевым раствором поликистозных ВПП мышей. Гистологическое исследование выявило наличие нескольких гипертрофированных нефронов в почках мышей, лечившихся как TNF-α, так и таксолом. Значительное интерстициальное воспаление также наблюдалось в почках мышей, лечившихся как TNF-α, так и таксолом. Обе проходивших лечение группы имели почки с большим заполненным жидкостью центральным просветом, который появляется от увеличения почечной лоханки. Этот признак вероятнее всего является результатом хронического почечного болезненного состояния, проявляющегося у лечившихся мышей, а не в результате лечения TNF-α или таксолом.

Почечная функция оценивалась, как описано в следующем примере.

Пример 2
Определение почечной функции
Мыши усыплялись в отмеченном возрасте и из аорты собиралось 0,5 мл крови. Серозный креатинин измерялся троекратно с использованием креатининового комплекта (Сигма, Сент-Луис, Миссури) со следующими видоизменениями. Поскольку гемолизу сыворотки сильно препятствует креатининовый образец, гемоглобин в образцах сыворотки (100 мкл) осаждался с помощью трихлоруксусной кислоты с конечной концентрацией 10%. Осажденные белки удалялись центрифугированием при 1300 об/мин в течение 10 мин, и сыворотка нейтрализовалась до рН 7,0. Определение креатинина выполнялось в 25 мкл нейтрализованной сыворотки на плоскодонных жестких микротитровых пластинах (Корнинг, Корнинг, Нью-Йорк) согласно инструкциям набора для анализа креатинина, но с пропорциональным уменьшением до 250 мкл анализируемого объема. Поглощение регистрировалось как до, так и после добавления кислотного реагента на 490 нм с использованием считывателя ячеечных пластин молекулярного прибора VMax 96.

Средний серозный креатинин трех активных поликистозных мышей, проходивших лечение TNF-α, был 3,3±0,6 мг/дл, когда их усыпили в возрасте 90 дней.

Человеческие кисты могут проходить лечение в живом организме, как это описано в следующем примере.

Пример 3
Лечение человеческой кисты
Сначала идентифицируется субъект, имеющий кистозную болезнь или риск развития кистозной болезни. К примеру, субъект может идентифицироваться врачом, который диагностирует, что этот субъект имеет АДППБ. После идентификации подходящего субъекта для лечения этому субъекту внутривенно вводят фармакологически эффективную дозу (например, 100000 ед/кг) рекомбинантной человеческой TNF-α. TNF-α может вводиться либо до образования кисты, чтобы предотвратить ее образование, либо после того как киста уже обнаружена в субъекте. Это введение повторяется, например, каждые три дня в течение времени, когда пациент имеет кисту или подвержен ее развитию. В этом случае в субъекте можно поддерживать эффективное количество данного соединения.

Следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается только теми выполнениями, которые рассмотрены в подробном описании. Любое выполнение, которое поддерживает дух настоящего изобретения, следует рассматривать попадающим в его объем. Однако изобретение ограничивается только объемом нижеследующей формулы изобретения.

Изобретение относится к медицине. Предложено применение TNF-α в качестве средства для лечения млекопитающего с поликистозной болезнью почек посредством внутрибрюшного введения и способ лечения с его использованием. Изобретение расширяет арсенал средств указанного назначения. 2 с. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Применение TNF-α в качестве средства для лечения млекопитающего с поликистозной болезнью почек посредством внутрибрюшного введения. 2. Способ лечения млекопитающего с поликистозной болезнью почек, включающий внутрибрюшное введение упомянутому млекопитающему фармакологически эффективного антикистозного количества TNF-α в фармакологически приемлемом носителе, наполнителе или разбавителе. 3. Способ по п.2, в котором упомянутым млекопитающим является человек.