МОДУЛИРОВАНИЕ АКВАПОРИНОВ РЕЛАКСИНОМ Российский патент 2015 года по МПК A61K38/22 A61P7/10 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам модулирования аквапориновых каналов. Изобретение относится, прежде всего, к способам модулирования аквапориновых каналов в ткани млекопитающего путем введения релаксина.

Предпосылки создания изобретения

Семейство аквапоринов

Аквапорины образуют семейство низкомолекулярных (24-30 кДа) пороформирующих интегральных мембранных белков, характеризующихся наличием шести трансмембранных спиралей, которые избирательно пропускают воду или другие малые незаряженные молекулы под действием градиента осмотического давления. Указанные белки образуют тетрамеры, при этом каждый мономер формирует индивидуальную пору. Семейство аквапориновых белков получило сначала такое свое название по названию основного внутреннего белка (MIP) волокон хрусталика млекопитающих, который в настоящее время обозначен как AQP0 (аквапорин 0). Когда в конечном итоге было установлено, что гомологи MIP функционируют в качестве водных каналов, то название «аквапорин» было присвоено всему семейству. Представители семейства аквапоринов встречаются во всех царствах, включая архейных, эубактерии, грибы, растения и животных. Гомологи MIP, проницаемые только для воды, называют аквапоринами, в то время как гомологи, проницаемые для воды и глицерина, называют акваглицеропоринами. У позвоночных в настоящее время идентифицировано одиннадцать различных аквапоринов, которые соответствуют человеческим белкам AQP0-AQP10. Из них семь аквапоринов (AQP0, AQP1, AQP2, AQP4, AQP5, AQP6 и AQP8) охарактеризованы как классические аквапорины, которые обеспечивают транспорт воды у млекопитающих. Остальные четыре аквапорина (AQP3, AQP7, AQP9 и AQP10) обеспечивают транспорт глицерина у млекопитающих и поэтому их относят к подсемейству GLP. В Е. coli, дрожжах и растениях были идентифицированы дополнительные виды аквапоринов (Kruse и др., Genome Biology 7(2)(206), 2006, сс.1-6).

Первым подробно описанным представителем семейства аквапоринов был каналоподобный интегральный мембранный белок мембраны человеческих эритроцитов. Этот белок первоначально был известен как белок CHIP28 с молекулярной массой 28 кДа. На основе результатов функциональных анализов указанный белок позднее был переименован в аквапорин-1 (AQP1). Эксперименты по изучению первичной белковой последовательности аквапорина-1 (AQP1) позволили установить наличие шести трансмембранных спиралей (I-VI), соединенных пятью петлями (петли A-E). Петли A, C и E расположены вне клетки, а петли В и D расположены внутри клетки. Кроме того, белок содержит два внутренних тандемных повтора, которые грубо соответствуют амино- и карбокси-концевым половинам белка. Каждый повтор состоит из трех трансмембранных спиралей и высококонсервативной петли после второй трансмембранной спирали (петли B и E соответственно). Указанная петля включает консервативный характеристический мотив аспарагин-пролин-аланин (NPA). Петли B и E формируют короткие α-спирали, которые образуют складку, возвращаясь в мембрану, при этом петля В входит в мембрану с цитоплазматической стороны, а петля Е - с внеклеточной стороны. Таким образом, формируется седьмой трансмембранный домен, в котором два NPA-бокса ориентированы по отношению друг к другу на 180°, создавая водный путь через белковую пору. Поскольку все аквапорины имеют родственную структуру и имеют характеризующиеся большим сходством консенсусные области, прежде всего в пороформирующих доменах, то, по-видимому, они обладают сходным обеспечивающим транспорт механизмом. Предполагается, что гидрофобный домен, образуемый петлями B и E, определяют специфичность в отношении субстрата и/или ограничении по размеру. Проход через мономер аквапорина выстлан консервативными гидрофобными остатками, что обеспечивает быстрый транспорт воды в форме проходящих по очереди связанных водородными связями молекул воды («single-file»-CHCTeMa). Пора имеет две области сжатия, а именно, ароматическая область, которая содержит консервативный остаток аргинина (Arg195), формирует наиболее узкую часть поры, в то время как высококонсервативные NPA-мотивы формируют второй фильтр, где отдельные молекулы воды взаимодействуют с двумя боковыми цепями аспарагина. Поскольку при этом происходит непосредственное взаимодействие между молекулами воды и NPA-мотивами, то биполярная молекула воды поворачивается на 180° при прохождении через пору. Обе области фильтра создают электростатические барьеры, которые препятствуют проникновению протонов. В человеческом AQP1 гидрофобная боковая цепь фенилаланина (Phe24) внедрена в пору и усиливает взаимодействие отдельных проникающих молекул воды с NPA-петлями. Фактически Phe24 действует как заграждающий (ограничивающий размер) фильтр, препятствуя прохождению через AQP1 более крупных молекул, таких как глицерин. Оценки показывают, что проницаемость человеческих аквапоринов для воды составляет от 0,25×10^-14 см³/с для AQP0 до 24×10^-14 см³/с для AQP4. Однако, по-видимому, аквапорины обладают различными характеристиками в отношении осморегуляции и прохождения воды через мембрану в различных тканях, органах и на различных стадиях развития организма. У млекопитающих аквапорины локализованы в эпителии, где требуется высокая скорость потока воды, например, в собирающем протоке почки, капиллярах легкого и секреторных клетках слюнных желез. Кроме того, аквапорины млекопитающих различаются своей транскрипционной регуляцией, посттрансляционной регуляцией и субклеточным распределением (Kruse и др. (выше)).

Отек

Отек представляет собой опухание тканей, которое происходит при избыточном накоплении жидкости в рассматриваемых тканях. Отек является симптомом системных заболеваний, т.е. заболеваний, поражающих различные системы органов организма. Он может вызываться локальными состояниями, затрагивающими только пораженные конечности. При периферическом отеке опухание является результатом накопления слишком большого количества жидкости под кожей в пространствах между тканями, которые называют также интерстициальными пространствами или интерстицием, образованными / образованным соединительной тканью. Большая часть общей воды организма находится вне клеток и в здоровом состоянии присутствует в кровеносных сосудах и интерстициальных пространствах. При различных заболеваниях и при определенных состояниях избыточная жидкость может накапливаться в любом одном или в обоих указанных компартментах. Наиболее распространенными локальными состояниями, вызывающими отек, являются варикозные вены и тромбофлебит, т.е. воспаление вен, поражающее глубокие вены ног. Эти состояния могут приводить к неадекватной перекачке крови венами, что в свою очередь приводит к венозной недостаточности. Возникающее в результате этого противодавление вызывает застаивание жидкости в конечностях, прежде всего в лодыжках и ступне. Затем избыточная жидкость просачивается в интерстициальные пространства, вызывая отек. Хотя опухание может ограничиваться определенными областями, такими как нижние конечности, оно может распространяться также и на большие области организма. Системный отек наиболее часто ассоциирован с заболеваниями сердца, печени и почек. Он обусловлен, прежде всего, тем, что в организме удерживается слишком много соли, такой как хлорид натрия. Избыток соли заставляет организм удерживать воду. Затем указанная вода просачивается в интерстициальные пространства, что проявляется в виде отека.

В целом отек классифицируют на основе расположения области опухания ткани. Многочисленными примерами могут служить периферический отек, который представляет собой в основном отек нижних конечностей; отек легких, который представляет собой накопление жидкости в легких; периорбитальный отек, который представляет собой опухание вокруг глаз; отек глаза, который обусловлен удерживанием жидкости в роговице; церебральный отек, который представляет собой опухание ткани головного мозга; асциты (избыток жидкости в брюшной полости); массивный отек (т.е. анасарка), который представляет собой опухание, захватывающее большую часть тела; и т.п. Другими областями организма, которые могут опухать, являются десны, лимфатические железы, лицо, брюшная полость, молочные железы, мошонка, печень и суставы. Признаки и симптомы отека могут варьироваться в зависимости от места расположения ткани и степени опухания. Для многих типов отека характерно проникновение жидкости под кожу, которое вызывает опухание и приводит к тому, что лежащая выше область растягивается и приобретает лоснящийся (блестящий) вид. Отек может представлять собой отек с возникновением ямки при надавливании или отек без возникновения ямки при надавливании. В случае отека с возникновением ямки при надавливании после надавливания пальцем опухшей области на ней возникает углубление, которое затем после прекращения надавливания медленно исчезает. Когда отек становится более серьезным, то ткань опухает настолько сильно, что оказывается невозможно вдавить ее и на коже не остается углубления после надавливания, в этом случае имеет место отек без возникновения ямки при надавливании. Отек, который возникает в местах подвергающихся давлению, которые расположены над костными областями тела, может развиваться с образованием серьезных пролежней или язв, прежде всего у прикованных к постели пациентов.

Известно также, что отек сам по себе является симптомом, ассоциированным с некоторыми различными лежащими в его основе заболеваниями, такими как заболевания почек, печени и сердца. Таким образом, отек может являться продолжительным и прогрессирующим проявлением нарушения, сопровождающегося серьезными последствиями. Например, отек легких может являться осложнением сердечной недостаточности. Когда эффективность нагнетательной функции сердца снижается, жидкость просачивается из вен в легкие и заполняет воздушные мешки или альвеолы, затрудняя тем самым дыхание. Отек легких может стать угрожающим жизни и, если его не лечить, то он может быстро привести к смерти. Симптомы отека легких включают одышку, хрипы при дыхании (стерторозное дыхание), потрескивающий или дребезжащий звук, прослушиваемый с помощью стетоскопа (хрипы), стридор, состояние тревоги, беспокойство, кашель, избыточное потоотделение, аномально бледную кожу (бледность), аномальное сердцебиение или аномальный сердечный ритм и боль в грудной клетке. Однако даже пациенты с менее серьезной сердечной недостаточностью, которая может не приводить к отеку легких, могут страдать также серьезным опуханием их нижних конечностей. Отек может вызываться также хроническим заболеванием легких. Серьезное заболевание легких, такое как хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), эмфизема или хронический бронхит, может ограничивать кровоток в кровеносных сосудах в легких. Ограниченный кровоток создает давление в кровеносных сосудах, которое может передаваться в остальную часть сердечно-сосудистой системы. Это давление, в свою очередь, заставляет жидкость просачиваться в окружающие ткани, вызывая опухание, т.е. отек, например, в ногах и ступнях.

Другими причинами отека являются варикозные вены (являющиеся результатом застоя крови в нижних частях ног); длительное пребывание в сидячем или стоячем положении, как это имеет место в случае ортостатического отека (например, являющегося результатом жаркой погоды, длительных полетов на самолете или длительных поездок на автомобиле); определенные лекарственные средства (например, оральные контрацептивы, содержащие эстроген или прогестерон, лекарственные средства для регулирования кровяного давления, определенные антидепрессанты, оральные кортикостероиды, тестостерон); беременность (в этом случае отек является результатом повышения кровяного давления в нижних конечностях, что может быть обусловлено преэклампсией); аллергические реакции; солнечные ожоги; нарушение питания, повреждение или травма; блокады лимфатической системы (например, вызываемые инфекцией, воспалением или раком), пребывание в условиях высокогорья, которое может приводить к высотному отеку; гормональные изменения, ассоциированные с менструацией у некоторых женщин; нефротический синдром (при котором поврежденные почки высвобождают избыток белка в мочу, что приводит к серьезному опуханию лодыжек); и серьезное заболевание печени (приводящее к циррозу и выраженному опуханию лодыжек).

Поскольку отек часто является симптомом другого вызывающего его заболевания, то факторы риска возникновения отека являются теми же самыми, что и факторы риска возникновения вызывающего отек заболевания. Поэтому для отека характерны те же самые факторы риска, что и в случае заболевания почек, печени, сердца и легкого. Например, курение является основным фактором риска возникновения хронического заболевания легких, высокое кровяное давление является основным фактором риска возникновения заболевания сердца, а ожирение является основным фактором риска возникновения, как заболевания сердца, так и диабета. Все эти факторы риска повышают также риск возникновения отека у индивидуума. Кроме того, отек встречается более часто у индивидуумов более старшего возраста, поскольку многие вызывающие отек причины более часто встречаются в популяциях людей более старшего возраста.

Краткое описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Одним из объектов изобретения является способ модулирования аквапориновых каналов у млекопитающего, заключающийся в том, что вводят млекопитающему релаксин в количестве, эффективном для модификации экспрессии аквапорина в ткани млекопитающего. Экспрессия аквапорина может представлять собой экспрессию гена аквапорина и/или экспрессию белка аквапорина. Экспрессию, как гена, так и белка аквапорина, можно подвергать как повышающей, так и понижающей регуляции. В одном из вариантов осуществления изобретения ген аквапоринового канала включает (но, не ограничиваясь только ими) ген аквапорина-0 (aqp0), ген аквапорина-1 (aqp1), ген аквапорина-2 (aqp2), ген аквапорина-3 (aqp3), ген аквапорина-4 (aqp4), ген аквапорина-5 (aqp5), ген аквапорина-6 (aqp6), ген аквапорина-7 (aqp7), ген аквапорина-8 (aqp8), ген аквапорина-9 (aqp9) и ген аквапорина-10 (aqp10). В другом варианте осуществления изобретения аквапориновый канал включает (но, не ограничиваясь только ими) аквапорин-0 (AQP0), аквапорин-1 (AQP1), аквапорин-2 (AQP2), аквапорин-3 (AQP3), аквапорин-4 (AQP4), аквапорин-5 (AQP5), аквапорин-6 (AQP6), аквапорин-7 (AQP7), аквапорин-8 (AQP8), аквапорин-9 (AQP9) и аквапорин-10 (AQP10). В следующем варианте осуществления изобретения ген аквапоринового канала включает (но, не ограничиваясь только ими) ген аквапорина-1 (aqpl), ген аквапорина-2 (aqp2), ген аквапорина-3 (aqp3), ген аквапорина-4 (aqp4) и ген аквапорина-5 (aqp5). В еще в одном варианте осуществления изобретения аквапориновый канал включает (но, не ограничиваясь только ими) аквапорин-1 (AQP1), аквапорин-2 (AQP2), аквапорин-3 (AQP3), аквапорин-4 (AQP4) и аквапорин-5 (AQP5).

Другим объектом изобретения является способ модулирования аквапоринового канала у млекопитающего, заключающийся в том, что вводят млекопитающему релаксин в количестве, эффективном для модификации экспрессии аквапорина в ткани млекопитающего, в котором экспрессия аквапорина включает экспрессию одного или нескольких из следующих генов аквапорина: aqp2, aqp3, aqp4 и aqp5, и/или одного или нескольких из следующих белков аквапоринов: AQP2, AQP3, AQP4 и AQP5. В одном из вариантов осуществления изобретения aqp3 подвергают повышающей регуляции в шейке матки. В другом варианте осуществления изобретения aqp5 подвергают понижающей регуляции в шейке матки. В другом варианте осуществления изобретения AQP3 подвергают повышающей регуляции в шейке матки. В другом варианте осуществления изобретения AQP5 подвергают понижающей регуляции в шейке матки. В другом варианте осуществления изобретения aqp2 и aqp4 подвергают повышающей регуляции в почке. Еще в одном варианте осуществления изобретения AQP2 и AQP4 подвергают повышающей регуляции в почке.

Другим объектом изобретения является способ модулирования аквапоринового канала у млекопитающего, заключающийся в том, что вводят млекопитающему релаксин в количестве, эффективном для модификации экспрессии аквапорина в ткани млекопитающего, в котором ткань включает (но, не ограничиваясь только ими) ткань органа, мышечную ткань, эпителиальную ткань и эндотелиальную ткань. В одном из вариантов осуществления изобретения ткань органа включает (но, не ограничиваясь только ими) ткань головного мозга, ткань почки, ткань легкого и ткань репродуктивной системы. В другом варианте осуществления изобретения млекопитающее представляет собой человека.

Кроме того, под объем изобретения подпадает способ модулирования аквапоринового канала у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят релаксин. В одном из вариантов осуществления изобретения релаксин модулирует экспрессию гена аквапорина. В другом варианте осуществления изобретения релаксин модулирует экспрессию белка аквапорина. Еще в одном варианте осуществления изобретения ген аквапорина включает (но, не ограничиваясь только ими) ген аквапорина-1 (aqp1), ген аквапорина-2 (aqp2), ген аквапорина-3 (aqp3), ген аквапорина-4 (aqp4) и ген аквапорина-5 (aqp5). В следующем варианте осуществления изобретения белок аквапорин включает (но, не ограничиваясь только ими) аквапорин-1 (AQP1), аквапорин-2 (AQP2), аквапорин-3 (AQP3), аквапорин-4 (AQP4) и аквапорин-5 (AQP5).

Другим объектом изобретения является способ лечения отека. Способ заключается в том, что вводят человеку фармацевтически активный релаксин в количестве, эффективном в отношении снижения ассоциированного с отеком накопления жидкости в ткани человека. Для лечения отека релаксин вводят в форме фармацевтической композиции. Релаксин, который применяют в фармацевтических композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой, например, синтетический или рекомбинантный релаксин, или фармацевтически эффективный агонист релаксина. В одном из вариантов осуществления изобретения релаксин представляет собой человеческий релаксин H1. В другом варианте осуществления изобретения релаксин представляет собой человеческий релаксин Н2. Еще в одном варианте осуществления изобретения релаксин представляет собой человеческий релаксин Н3. В другом варианте осуществления изобретения релаксин представляет собой синтетический или рекомбинантный человеческий релаксин или фармацевтически эффективный агонист релаксина. Так, можно лечить отек у индивидуума с помощью фармацевтической композиции, содержащей синтетический или рекомбинантный человеческий релаксин или агонист релаксина, или любой агент, обладающий релаксин-подобной активностью. В одном из вариантов осуществления изобретения индивидуума лечат синтетическим человеческим релаксином. В другом варианте осуществления изобретения индивидуума лечат рекомбинантным человеческим релаксином. Еще в одном варианте осуществления изобретения индивидуума лечат фармацевтически эффективным агонистом релаксина. Релаксин можно вводить человеку многочисленными различными путями, включая (но, не ограничиваясь только ими) внутривенное, подкожное, внутримышечное, подъязычное, интраназальное, интрацеребральное, интрацеребровентрикулярное введение, местное применение, введение в стекловидное тело и введение посредством ингаляции. Такие пути введения включают (но, не ограничиваясь только ими) внутривенную инфузию, внутривенное болюсное введение, подкожную инфузию, подкожное болюсное введение, введение с использованием подкожного насоса, инъекцию в стекловидное тело и местное применение с использованием глазных капель. Более конкретно, фармацевтическую композицию, содержащую релаксин или агонист релаксина, можно вводить индивидууму в количестве, составляющем примерно от 10 до 1000 мкг/кг веса тела индивидуума в день. В одном из вариантов осуществления изобретения релаксин вводят путем внутривенной или подкожной инфузии со скоростью, составляющей от примерно 3 до примерно 150 мкг/кг/день. В другом варианте осуществления изобретения релаксин вводят путем внутривенной или подкожной инфузии со скоростью примерно 30 мкг/кг/день. По существу релаксин вводят индивидууму таким образом, чтобы поддерживать концентрацию релаксина в сыворотке на уровне от примерно 1 до примерно 500 нг/мл. В одном из вариантов осуществления изобретения релаксин вводят для того, чтобы поддерживать его концентрацию в сыворотке на уровне от примерно 1 до примерно 100 нг/мл. В другом варианте осуществления изобретения релаксин вводят для того, чтобы поддерживать его концентрацию в сыворотке на уровне примерно 10 нг/мл. Снижение накопления жидкости, ассоциированного с отеком, в ткани человека может быть выявлено в течение периода времени, составляющего примерно 24 ч после начала лечения релаксином, путем сравнения с результатами обработки с использованием плацебо. В некоторых обстоятельствах снижение накопления жидкости, ассоциированного с отеком, в ткани человека может быть выявлено уже в период времени, составляющий примерно от 4 до 6 ч после начала лечения релаксином, путем сравнения с результатами обработки с использованием плацебо.

Другим объектом изобретения является способ лечения отека головного мозга человека. Способ заключается в том, что вводят человеку фармацевтически активный релаксин в количестве, эффективном в отношении снижения накопления жидкости, с которым ассоциирован отек, в ткани головного мозга у человека. Отек головного мозга может поражать одну или несколько областей головного мозга. В одном из вариантов осуществления изобретения отек головного мозга представляет собой церебральный отек. Изобретение относится также к лечению и других форм отека головного мозга. Для лечения отека головного мозга релаксин можно вводить, например, внутривенно, подкожно, интрацеребрально или интрацеребровентрикулярно. В этом случае пораженным индивидуумам можно вводить релаксин, например, посредством внутривенной инфузии, внутривенного болюсного введения, подкожной инфузии или подкожного болюсного введения. Тип введения релаксина зависит от состояния пациента и конкретный обстоятельств. В одном из вариантов осуществления изобретения релаксин вводят для поддержания его концентрации в сыворотке человека на уровне от примерно 1 до примерно 100 нг/мл. В другом варианте осуществления изобретения релаксин вводят для поддержания его концентрации в сыворотке человека на уровне примерно 10 нг/мл. В следующем варианте осуществления изобретения релаксин вводят путем внутривенной или подкожной инфузии со скоростью, составляющей от примерно 3 до примерно 150 мкг/кг/день. Еще в одном варианте осуществления изобретения релаксин вводят путем внутривенной или подкожной инфузии со скоростью, составляющей примерно 30 мкг/кг/день. Релаксин можно вводить в форме внутривенного или подкожного болюса со скоростью, составляющей от примерно 3 до примерно 150 мкг/кг/день. Еще в одном варианте осуществления изобретения релаксин вводят в форме внутривенного или подкожного болюса со скоростью примерно 30 мкг/кг/день. Снижение накопления жидкости, с которым ассоциирован отек, в ткани головного мозга человека может быть выявлено в течение периода времени, составляющего примерно 24 ч после начала лечения релаксином, путем сравнения с результатами обработки с использованием плацебо. В некоторых обстоятельствах снижение накопления жидкости, с которым ассоциирован отек, в ткани головного мозга человека может быть выявлено уже в период времени, составляющий примерно от 4 до 6 ч после начала лечения релаксином, путем сравнения с результатами обработки с использованием плацебо. В зависимости от состояния пациента и серьезности отека снижение накопления жидкости может быть выявлено на основе того, что в определенные моменты времени может быть установлено уменьшение отека. Указанное снижение накопления жидкости можно измерять с помощью визуализации методом ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) или других методов, доступных врачам. Кроме того, снижение накопления жидкости в головном мозге может быть определено по улучшению поведения пациента, такому, например, как улучшение координации, уровней сознания и степени онемения, а также по снижению головокружения, тошноты и потери памяти.

Другим объектом изобретения является способ лечения отека, заключающийся в том, что человеку вводят фармацевтически активный релаксин в количестве, эффективном в отношении модификации экспрессии аквапорина в ткани головного мозга человека. Такой способ может включать лечение (но, не ограничиваясь только им) церебрального отека, в том числе вазогенного и цитотоксического отека.

Кроме того, в изобретении предложен способ лечения отека, заключающийся в том, что человеку вводят фармацевтически активный релаксин в количестве, эффективном в отношении снижения накопления жидкости, с которым ассоциирован отек в роговичной ткани у указанного человека. В одном из вариантов осуществления изобретения отек представляет собой отек глаза. Для лечения отека глаза релаксин можно вводить внутривенно, подкожно, применять местно или вводить внутрь стекловидного тела. Внутривенное введение можно осуществлять посредством внутривенной инфузии или внутривенного болюсного введения. Подкожное введение можно осуществлять посредством подкожной инфузии или подкожного болюсного введения. Местное применение можно осуществлять посредством местного нанесения глазных капель. Введение в стекловидное тело можно осуществлять посредством инъекции, например, инъекции в глаз. В одном из вариантов осуществления изобретения релаксин вводят для поддержания его концентрации в сыворотке человека на уровне от примерно 1 до примерно 100 нг/мл. В другом варианте осуществления изобретения релаксин вводят для поддержания его концентрации в сыворотке человека на уровне примерно 10 нг/мл. В другом варианте осуществления изобретения релаксин вводят путем внутривенной или подкожной инфузии со скоростью, составляющей от примерно 3 до примерно 150 мкг/кг/день. Еще в одном варианте осуществления изобретения релаксин вводят путем внутривенной или подкожной инфузии со скоростью, составляющей примерно 30 мкг/кг/день. В следующем варианте осуществления изобретения релаксин вводят в форме внутривенного или подкожного болюса со скоростью, составляющей от примерно 3 до примерно 150 мкг/кг/день. Еще в одном варианте осуществления изобретения релаксин вводят в форме внутривенного или подкожного болюса со скоростью примерно 30 мкг/кг/день. Снижение накопления жидкости, с которым ассоциирован отек, в роговичной ткани человека может быть выявлено в течение периода времени, составляющего примерно 24 ч после начала лечения релаксином, путем сравнения с результатами обработки с использованием плацебо. В некоторых обстоятельствах снижение накопления жидкости, с которым ассоциирован отек, в роговичной ткани человека может быть выявлено уже в период времени, составляющий примерно от 4 до 6 ч после начала лечения релаксином, путем сравнения с результатами обработки с использованием плацебо. В зависимости от состояния пациента и серьезности глазного отека снижение накопления жидкости может быть выявлено на основе того, что в определенные моменты времени может быть установлено улучшение отека. Указанное снижение накопления жидкости можно измерять с помощью визуализации методом ядерно-магнитного резонанса (ЯМР), определять на основе визуальной оценки врачом степени опухания и/или воспаления роговицы, оценивать по уменьшению нарушения зрения, а также по уменьшению дискомфорта в глазу и фотофобии.

Следующим объектом изобретения является способ лечения отека, заключающийся в том, что человеку вводят фармацевтически активный релаксин в количестве, эффективном в отношении модификации экспрессии аквапорина в роговичной ткани человека. Такое способ включает лечение (но, не ограничиваясь только им) отека глаза.

Кроме того, в изобретении предложен способ лечение отека, заключающийся в том, что человеку вводят фармацевтически активный релаксин в количестве, эффективном в отношении снижения ассоциированного с отеком накопления жидкости в ткани легких человека. В одном из вариантов осуществления изобретения отек представляет собой отек легких. Для лечения отека легких или любого отека, возникающего в легком, релаксин можно вводить внутривенно или подкожно. Внутривенное введение можно осуществлять посредством внутривенной инфузии или внутривенного болюсного введения. Подкожное введение можно осуществлять посредством подкожной инфузии или подкожного болюсного введения. В одном из вариантов осуществления изобретения релаксин вводят для поддержания его концентрации в сыворотке человека на уровне от примерно 1 до примерно 100 нг/мл. В другом варианте осуществления изобретения релаксин вводят для поддержания его концентрации в сыворотке человека на уровне примерно 10 нг/мл. В другом варианте осуществления изобретения релаксин вводят путем внутривенной или подкожной инфузии со скоростью, составляющей от примерно 3 до примерно 150 мкг/кг/день. Еще в одном варианте осуществления изобретения релаксин вводят путем внутривенной или подкожной инфузии со скоростью, составляющей примерно 30 мкг/кг/день. В следующем варианте осуществления изобретения релаксин вводят в форме внутривенного или подкожного болюса со скоростью, составляющей от примерно 3 до примерно 150 мкг/кг/день. Еще в одном варианте осуществления изобретения релаксин вводят в форме внутривенного или подкожного болюса со скоростью примерно 30 мкг/кг/день. Снижение накопления жидкости, с которым ассоциирован отек, в ткани легких человека может быть выявлено в течение периода времени, составляющего примерно 24 ч после начала лечения релаксином, путем сравнения с результатами обработки с использованием плацебо. В некоторых обстоятельствах снижение накопления жидкости, с которым ассоциирован отек, в ткани легких человека может быть выявлено уже в период времени, составляющий примерно от 4 до 6 ч после начала лечения релаксином, путем сравнения с результатами обработки с использованием плацебо. В зависимости от состояния пациента и серьезности отека легких снижение накопления жидкости может быть выявлено на основе того, что в определенные моменты времени может быть установлено улучшение отека. Указанное снижение накопления жидкости можно измерять с помощью рентгеноскопии грудной клетки. Кроме того, снижение накопления жидкости может быть выявлено по ослаблению застоя в легких, а также по улучшению дыхания (что оценивают путем аускультации, проводимой с целью выслушивания улучшений дыхания) и повышению насыщения кислородом (что оценивают путем осуществления анализа газа в артериальной крови).

Следующим объектом изобретения является способ лечения отека, заключающийся в том, что индивидууму вводят фармацевтически активный релаксин в количестве, эффективном в отношении модификации экспрессии аквапорина в ткани легких человека. В одном из вариантов осуществления изобретения отек представляет собой отек легких.

Еще одним объектом изобретения является способ лечения периферического отека, заключающийся в том, что человеку вводят фармацевтически активный релаксин в количестве, эффективном в отношении снижения накопления жидкости, с которым ассоциирован отек в опухшей ткани человека, где опухшая ткань включает область, находящуюся под кожей человека. В одном из вариантов осуществления изобретения опухшая ткань представляет собой соединительную ткань кожи. Периферический отек может встречаться у конкретных популяций пациентов, таких как популяции пациентов, страдающих определенным состоянием, включая застойную сердечную недостаточность, травму, алкоголизм, высотную болезнь, беременность, гипертензию или другие состояния. Кроме того, такие пациенты могут страдать болезнью печени или определенным типом заболевания сердца. Кроме того, такие пациенты могут страдать также тем или иным типом недостаточности органа. Периферический отек может возникать также сам по себе, как в случае пациентов, имеющих опухшие конечности, у которых опухание не ассоциировано с определенным состоянием и не может быть связано с определенным заболеванием или причиной. Иногда такие индивидуумы просто находятся в течение продолжительных периодов времени в сидячем или стоячем положении без движения (например, люди в офисах, которые сидят за столами в течение продолжительных периодов времени, или люди, работающие на сборочных линиях (конвейерах), которые стоят на ногах в течение продолжительных периодов времени). Релаксин можно применять для лечения периферического отека, который возникает сам по себе или отека, который является симптомом другого заболевания или связан с другим болезненным состоянием. Для лечения периферического отека релаксин можно вводить внутривенно или подкожно. Внутривенное введение можно осуществлять посредством внутривенной инфузии или внутривенного болюсного введения. Подкожное введение можно осуществлять посредством подкожной инфузии или подкожного болюсного введения. В одном из вариантов осуществления изобретения релаксин вводят для поддержания его концентрации в сыворотке человека на уровне от примерно 1 до примерно 100 нг/мл. В другом варианте осуществления изобретения релаксин вводят для поддержания его концентрации в сыворотке человека на уровне примерно 10 нг/мл. В другом варианте осуществления изобретения релаксин вводят путем внутривенной или подкожной инфузии со скоростью, составляющей от примерно 3 до примерно 150 мкг/кг/день. Еще в одном варианте осуществления изобретения релаксин вводят путем внутривенной или подкожной инфузии со скоростью, составляющей примерно 30 мкг/кг/день. В следующем варианте осуществления изобретения релаксин вводят в форме внутривенного или подкожного болюса со скоростью, составляющей от примерно 3 до примерно 150 мкг/кг/день. Еще в одном варианте осуществления изобретения релаксин вводят в форме внутривенного или подкожного болюса со скоростью примерно 30 мкг/кг/день. Снижение накопления жидкости, с которым ассоциирован периферический отек, в опухшей ткани человека может быть выявлено в течение периода времени, составляющего примерно 24 ч после начала лечения релаксином, путем сравнения с результатами обработки с использованием плацебо. У некоторых пациентов снижение накопления жидкости, с которым ассоциирован периферический отек, в опухшей ткани человека может быть выявлено уже в период времени, составляющий примерно от 4 до 6 ч после начала лечения релаксином, путем сравнения с результатами обработки с использованием плацебо. В зависимости от состояния пациента и серьезности периферического отека снижение накопления жидкости может быть выявлено на основе того что в определенные моменты времени может быть установлено уменьшение отека. Такое снижение накопления жидкости можно оценивать по уменьшению опухания при проведении объективного (физикального) обследования, а также по резкому снижению веса тела в течение 24-48 ч. Когда организм пациента теряет воду, то происходит заметное снижение веса тела, что, в свою очередь, непосредственно связано с уменьшением отека.

Другим объектом изобретения является способ лечения периферического отека, заключающийся в том, что человеку вводят фармацевтически активный релаксин в количестве, эффективном в отношении модификации экспрессии аквапорина в ткани человека. В одном из вариантов осуществления изобретения ткань представляет собой опухшую ткань, которая включает область, находящуюся под кожей. В другом варианте осуществления изобретения ткань представляет собой соединительную ткань.

Объектом изобретения является также способ лечения системного отека, заключающийся в том, что человеку вводят фармацевтически активный релаксин в количестве, эффективном в отношении снижения накопления жидкости, с которым ассоциирован отек в ткани человека. Ткань может включать (но, не ограничиваясь только ими) легкое, сердце, почку и печень. Так же, как и в случае периферического отека, системный отек может возникать в специфических популяциях пациентов, таких как популяции пациентов, страдающих конкретным состоянием. Например, такие пациенты могут страдать заболеванием печени, определенным типом заболевания сердца, гипотиреозным состоянием, заболеванием легких, почечным нарушением и т.п. Кроме того, такие пациенты могут страдать также тем или иным типом недостаточности органа. Системный отек может возникать также в одном органе, как это имеет место, например, у пациентов, которые имеют цирроз и/или асциты и страдают отеком печени. В альтернативном варианте системный отек может возникать одновременно более чем в одном органе. Релаксин можно применять для лечения системного отека, возникающего в одном или нескольких органах. Для лечения системного отека релаксин можно вводить внутривенно или подкожно. Внутривенное введение можно осуществлять посредством внутривенной инфузии или внутривенного болюсного введения. Подкожное введение можно осуществлять посредством подкожной инфузии или подкожного болюсного введения. В одном из вариантов осуществления изобретения релаксин вводят для поддержания его концентрации в сыворотке человека на уровне от примерно 1 до примерно 100 нг/мл. В другом варианте осуществления изобретения релаксин вводят для поддержания его концентрации в сыворотке человека на уровне примерно 10 нг/мл. В другом варианте осуществления изобретения релаксин вводят путем внутривенной или подкожной инфузии со скоростью, составляющей от примерно 3 до примерно 150 мкг/кг/день. Еще в одном варианте осуществления изобретения релаксин вводят путем внутривенной или подкожной инфузии со скоростью, составляющей примерно 30 мкг/кг/день. В следующем варианте осуществления изобретения релаксин вводят в форме внутривенного или подкожного болюса со скоростью, составляющей от примерно 3 до примерно 150 мкг/кг/день. Еще в одном варианте осуществления изобретения релаксин вводят в форме внутривенного или подкожного болюса со скоростью примерно 30 мкг/кг/день. Снижение накопления жидкости, с которым ассоциирован системный отек, в пораженной ткани или пораженном органе человека может быть выявлено в течение периода времени, составляющего примерно 24 ч после начала лечения релаксином, путем сравнения с результатами обработки с использованием плацебо. У некоторых пациентов снижение накопления жидкости, с которым ассоциирован системный отек, в пораженной ткани или пораженном органе человека может быть выявлено уже в период времени, составляющий примерно от 4 до 6 ч после начала лечения релаксином, путем сравнения с результатами обработки с использованием плацебо. В зависимости от состояния пациента и серьезности системного отека снижение накопления жидкости может быть выявлено на основе того, что в определенные моменты времени может быть установлено уменьшение отека. Такое снижение накопления жидкости можно оценивать путем обследования пациента для выявления облегчения соответствующего симптома или путем сканирования, пригодного для оценки состояния, которое является причиной отека, такого как КТ-сканирование или ультразвуковое обследование (что позволяет выявлять уменьшение брюшной полости и вздутия), с помощью ЯМР (что позволяет выявлять снижение содержания воды в конкретном органе), рентгеноскопии грудной клетки (что позволяет выявлять снижение количества жидкости в легких) и получения эхокардиограммы (что позволяет определять размер сердечных камер и другие изменения в сердце и окружающей его области).

Другим объектом изобретения является способ лечения системного отека, заключающийся в том, что человеку вводят фармацевтически активный релаксин в количестве, эффективном в отношении модификации экспрессии аквапорина в ткани человека. В одном из вариантов осуществления изобретения ткань представляет собой легкое, сердце, почку и печень.

Еще одним объектом изобретения является способ лечения отека, заключающийся в том, что животному вводят фармацевтически активный релаксин в количестве, эффективном в отношении снижения накопления жидкости, с которым ассоциирован отек, в ткани животного. В предпочтительном варианте осуществления изобретения животное представляет собой собаку, кошку или лошадь.

Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения нефрогенного несахарного диабета (ННД), заключающийся в том, что человеку вводят фармацевтически активный релаксин в количестве, эффективном в отношении снижения хронической экскреции разбавленной мочи у человека. Поскольку пациенты с ННД страдают частым и затрудненным мочеиспусканием, чрезмерной жаждой и ощущением общей слабости, то снижение одного или нескольких из указанных симптомов в результате лечения релаксином должно приводить к улучшению состояния. Например, снижение частоты мочеиспускания, уменьшение 24-часового объема мочи, последующее измерение осмоляльности мочи и/или ослабление интенсивной жажды, испытываемой пациентом, может быть непосредственно связано с облегчением ННД в результате применения релаксина. Как таковой, релаксин вводят для поддержания его концентрации в сыворотке человека на уровне от примерно 1 до примерно 100 нг/мл. В другом варианте осуществления изобретения релаксин вводят для поддержания его концентрации в сыворотке человека на уровне примерно 10 нг/мл. В следующем варианте осуществления изобретения релаксин вводят путем подкожной инфузии со скоростью, составляющей от примерно 3 до примерно 150 мкг/кг/день. Еще в одном варианте осуществления изобретения релаксин вводят путем подкожной инфузии со скоростью, составляющей примерно 30 мкг/кг/день. Кроме того, релаксин можно вводить в течение длительного времени различными путями, включая поочередное введение путем подкожной инъекции или с помощью насоса. В частности релаксин можно вводить непрерывно в течение по меньшей мере 24 ч. У страдающего ННД пациента снижение экскреции разбавленной мочи, ассоциированной с ННД, может быть выявлено в течение примерно 24 ч после начала лечения релаксином путем сравнения с результатами обработки с использованием плацебо. В альтернативном варианте снижение экскреции разбавленной мочи, ассоциированной с ННД, может быть выявлено у человека уже в период времени, составляющий примерно от 4 до 6 ч после начала лечения релаксином, путем сравнения с результатами обработки с использованием плацебо.

Следующим объектом изобретения является способ лечения нефрогенного несахарного диабета (ННД), заключающийся в том, что человеку вводят фармацевтически активный релаксин в количестве, эффективном в отношении модификации экспрессии аквапорина и его клеточной локализации в ткани почек у человека. В одном из вариантов осуществления изобретения аквапорин представляет собой аквапорин-2 (AQP2), аквапорин-3 (AQP3) и/или аквапорин-4 (AQP4).

Краткое описание чертежей

Настоящее описание должно стать более понятным после ознакомления с прилагаемыми чертежами, которые служат для иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Следует иметь в виду, что объем изобретения не ограничивается конкретными вариантами осуществления изобретения, проиллюстрированными на чертежах.

На чертежах показано:

На фиг.1 - снижение экспрессии гена aqp3 в шейке матки мышей с дефицитом релаксина (Rln^-/-), находящихся на поздней стадии беременности;

На фиг.2 - данные, демонстрирующие, что белок AQP3 локализован преимущественно в базальном слое эпителиальных клеток (см. стрелки) в шейке матки мышей. Для Rln^-/- -мышей характерен более низкий уровень экспрессии белка AQP3 по сравнению с мышами дикого типа (Rln^+/+);

На фиг.3 - данные, демонстрирующие, что обработка релаксином повышает уровень экспрессии гена aqp3 (фиг.3А) и снижает уровень экспрессии гена aqp5 (фиг.3Б) в шейке матки беременных Rln^-/--мышей;

На фиг.4 - данные, демонстрирующие, что обработка релаксином повышает уровень экспрессии белка AQP3 (стрелки) и снижает уровень экспрессии белка AQP5 (звездочки) в базальных эпителиальных клетках шейки матки беременных Rln^-/--мышей;

На фиг.5 - данные, демонстрирующие влияние обработки релаксином на осмоляльность плазмы у самцов Rln^-/--мышей;

На фиг.6 - результаты измерения с помощью количественной ПЦР экспрессии рецептора релаксина Rxfpl в почках самцов мышей (фиг.6А) и самок мышей (фиг.6Б);

На фиг.7 - результаты определения уровня экспрессии рецептора релаксина Rxfpl в почках самцов и самок крыс. На фиг.7А представлены данные иммуногистохимического анализа по выявлению белка RXFP1 в поперечных срезах почечных канальцев в корковом слое, наружном мозговом веществе и внутреннем мозговом веществе. На фиг.7Б и фиг.7В представлены результаты измерения с помощью количественной ПЦР уровня экспрессии гена Rxfpl в корковом слое и областях мозгового вещества самок и самцов крыс. На фиг.7Г - результаты количественной оценки уровня экспрессии белка в корковом слое и областях мозгового вещества, полученные методом Вестерн-блоттинга;

На фиг.8А - данные, демонстрирующие повышение экспрессии гена aqp2 в почках самцов Rln^+/+-мышей, обработанных релаксином, по сравнению с контролями, обработанными физиологическим раствором (VEH). β-актин представляет собой применяемый в качестве стандарта контроль. На фиг.8Б представлены данные, свидетельствующие об умеренном повышении уровня экспрессии гена aqp2 в сосочках самцов Rln^-/--мышей, которых обрабатывали релаксином в течение пяти дней. На фиг.8В представлены данные, свидетельствующие о небольшом повышении уровня экспрессии гена aqp2 в мозговом веществе самцов крыс, которых обрабатывали релаксином в течение пяти дней;

На фиг.9 - данные, демонстрирующие, что обработка моноклональным антителом к крысиному релаксину (МСА1) крыс, находящихся на поздней стадии беременности, снижает уровень экспрессии гена aqp2 в области мозгового вещества почки;

На фиг.10А - данные, свидетельствующие о снижении уровня экспрессии гена aqp4 в почках самцов Rln^-/--мышей. На фиг.10Б и фиг.10В представлены данные, свидетельствующие о том, что обработка релаксином самцов Rln^-/--мышей в течение либо 5, либо 14 дней повышает уровень экспрессии гена aqp4 в области почечных сосочков. На фиг.10Г представлены данные, свидетельствующие о повышении уровня экспрессии гена aqp4 в мозговом веществе самцов крыс, которых обрабатывали релаксином в течение пяти дней;

На фиг.11 - результаты, свидетельствующие о повышении уровня экспрессии гена aqp4 в мозговом веществе самцов крыс, которых обрабатывали релаксином в течение пяти дней.

Подробное описание вариантов осуществления изобретения

Общий обзор

Настоящее изобретение относится к способам модулирования аквапориновых каналов посредством введения релаксина. Аквапорины представляют собой белки, встроенные в клеточную мембрану большинства типов клеток для регулирования потока воды и глицерина в различных тканях организма. При создании настоящего изобретения было установлено, что релаксин обладает способностью модулировать указанные водные каналы, а именно, релаксин обладает способностью осуществлять повышающую и/или понижающую регуляцию экспрессии специфических аквапоринов в определенных тканях и/или органах. Это в свою очередь оказывает воздействие на поток воды через специфические аквапорины в определенных тканях и/или органах и тем самым изменяет проницаемость биологических мембран для воды, и следовательно изменяет содержание жидкости в тканях и/или органах организма. При создании настоящего изобретения было установлено, что для конкретных аквапоринов воздействие, модифицирующее экспрессию их генов в одной ткани, сохраняется и в другой ткани. Поскольку аквапорины экспрессируются в большинстве типов тканей млекопитающих и характеризуются высокой консервативностью в системе млекопитающих, то возможность осуществлять повышающую и понижающую регуляцию их экспрессии обеспечивает фундаментальную основу для понимания многих процессов развития заболеваний. Например, отек представляет собой состояние, являющееся результатом избыточного накопления воды в тканях и/или органах, таким образом, лечение релаксином может оказывать благоприятное воздействие на индивидуумов, страдающих отеком и/или имеющих его симптомы.

Более конкретно, установлено, что обработка мышей человеческим рекомбинантный (Н2) релаксином повышает экспрессию гена aqp3 и количество белка AQP3 в эпителиальных клетках шейки матки на поздней стадии беременности. Это стимулирует приток воды из полости шейки матки в ткань стромы через эпителиальные клетки и повышает содержание воды в ткани стромы, облегчая тем самым ремоделирование внеклеточного матрикса. Обработка релаксином может также снижать уровень аквапоринов в той же самой ткани. Например, релаксин снижает экспрессию гена aqp5 и количество белка AQP5 в базальном слое эпителиальных клеток шейки матки на поздней стадии беременности. В другом исследовании было установлено, что обработка релаксином повышает экспрессию гена aqp2 и гена aqp4 в мозговом веществе и областях сосочков в почках двух видов млекопитающих. Такое воздействие стимулирует перемещение воды в почках из фильтрата нефрона через клетки нефрона назад в кровь, что необходимо для концентрирования мочи и снижения осмоляльности плазмы.

Таким образом, настоящее изобретение относится также к способам снижения отека путем введения релаксина пораженным индивидуумам. В частности, указанные способы включают введение фармацевтически активного релаксина в количестве, эффективном в отношении снижения накопления жидкости, с которым, как правило, ассоциирован отек. Поскольку отек представляет собой распространенное побочное действие или симптом многих заболеваний и, кроме того, представляет собой состояние, которое поражает пожилых людей, то оно ассоциировано с постоянно растущими затратами для системы здравоохранения. Например, существуют многочисленные формы отека, включая (но, не ограничиваясь только ими) церебральный отек, отек глаза, отек легких, асциты, наследственный ангионевротический отек, периферический отек и системный отек, которые все являются результатом накопления жидкости в тканях или органах организма. Кроме того, отек представляет собой распространенное состояние, ассоциированное с травматическим повреждением головного мозга и спинного мозга, такое, как отек головного мозга или церебральный отек. Кроме того, отек часто сопровождает «удар» и он может сильно осложнять клиническое развитие опухолей головного мозга. Однако современные подходы к лечению отека головного мозга являются ограниченными и включают осмотерапию и применение глюкокортикоидов. При осуществлении осмотерапии вводят гипертонический раствор маннита с целью реверсии опухания головного мозга. Однако возможность такого лечения является ограниченной и часто оно оказывается безуспешным, поскольку осмотерапия приводит к сжатию здоровой ткани головного мозга наряду с тканью в поврежденной области. Кроме того, было установлено, что применение глюкокортикоидов не приносило значительного успеха при лечении большинства форм отека головного мозга и оказалось полностью безуспешным в случае отека, ассоциированного с «ударом». Аналогично этому, хирургическая декомпрессия, которая представляет собой инвазивную процедуру, часто является рискованной для пациента. К сожалению, указанные подходы к лечению, которые применяли в течение последних 70 лет, имели очень небольшой успех. Ежегодные затраты только на лечение травматического повреждения головного мозга и ассоциированного с ним отека превышают 14 миллиардов долларов США и постоянно возрастают. Таким образом, для популяции пациентов, пораженных отеком, требуются новые терапевтические методы, позволяющие улучшать и стабилизировать состояние пациентов, не вызывая при этом серьезных побочных действий. Релаксин представляет собой встречающуюся в естественных условиях субстанцию, которая после ее введения индивидуумам, страдающим отеком, может снижать накопление жидкости в ткани, с которым ассоциирован отек, не оказывая неблагоприятного воздействия на соседнюю ткань. По существу, релаксин открывает возможность применения новой формы лечения, которая позволяет улучшать самочувствие пациента, и, кроме того, открывает новый путь снижения затрат на лечение индивидуумов, пораженных отеком. Кроме того, под объем изобретения подпадает способ лечения нефрогенного несахарного диабета (ННД), заключающийся в том, что пораженным индивидуумам вводят фармацевтически активный релаксин.

Определения

Понятие «модулирующая» относится к способности регулировать или корректировать активность и/или присутствие, и/или воздействие биологической субстанции, включая (но, не ограничиваясь только ими) ген и белок.

Понятие «ткань» относится к скоплению клеток одного и того же происхождения. Например, ткань млекопитающего представляет собой скопление клеток из организмов видов млекопитающих. Не требуется, чтобы клетки, образующие ткань, были идентичными, но вместе они выполняют определенную функцию. Понятие «отек» обозначает накопление жидкости в ткани и/или органе в организме млекопитающего. Понятие «вводить» относится к введению индивидууму или нанесению на индивидуума фармацевтического лекарственного средства или композиции конкретным путем, включая (но, не ограничиваясь только ими) внутривенное, подкожное, внутримышечное, подъязычное, интраназальное, интрацеребральное, интрацеребровентрикулярное введение, местное нанесение, введение в стекловидное тело и введение посредством ингаляции. Понятие «эффективный», как оно используется во фразе «эффективный в отношении снижения накопления жидкости, с которым ассоциирован отек», относится к количеству фармацевтически активного релаксина, которое приводит к поддающемуся выявлению требуемому медицинскому или клиническому благоприятному действию на пациента по сравнению с исходным статусом пациента или статусом индивидуума, которого не подвергали лечению или обрабатывали плацебо (например, не лечили релаксином).

Понятие «релаксин» относится к пептидному гормону, хорошо известному в данной области. В контексте настоящего описания понятие «релаксин» включает человеческий релаксин, в том числе интактный полноразмерный человеческий релаксин или часть молекулы релаксина, которая сохраняет его биологическую активность. Понятие «релаксин» включает человеческий препрорелаксин, прорелаксин и релаксин H1; препрорелаксин, прорелаксин и релаксин Н2; и препрорелаксин, прорелаксин и релаксин Н3. Кроме того, понятие «релаксин» включает также биологически активный (в настоящем описании обозначен также как «фармацевтически активный») релаксин, полученный из рекомбинантных, синтетических или нативных источников, а также варианты релаксина, такие как варианты аминокислотной последовательности. По существу, понятие включает синтетический человеческий релаксин и рекомбинантный человеческий релаксин, в том числе синтетический человеческий релаксин H1, Н2 и Н3 и рекомбинантный человеческий релаксин H1, Н2 и Н3. Кроме того, понятие включает также активные субстанции, обладающие релаксин-подобной активностью, такие как агонисты релаксина и/или аналоги релаксина и их фрагменты, которые сохраняют биологическую активность, включая все субстанции, которые конкурентно вытесняют связанный релаксин из рецептора релаксина (например, из рецептора RXFP1, рецептора RXFP2, рецептора RXFP3, рецептора RXFP4, которые ранее обозначали как LGR7, LGR8, GPCR135, GPCR142 соответственно). Таким образом, фармацевтически эффективный релаксин или агонист релаксина представляет собой любую субстанцию, обладающую релаксин-подобной активностью, которая обладает способностью связываться с рецептором релаксина, вызывая релаксин-подобный ответ. Кроме того, фармацевтически эффективный релаксин или агонист релаксина представляет собой любую субстанцию, обладающую релаксин-подобной активностью, которая обладает способностью осуществлять повышающую и/или понижающую регуляцию и/или модификацию экспрессии молекулы аквапорина (AQP), в результате чего происходит модулирование и/или изменение проницаемости биологических мембран для воды, что, в свою очередь, может изменять содержание жидкости в тканях и/или органах организма. Кроме того, не требуется, чтобы нуклеотидная последовательность человеческого релаксина, применяемого согласно настоящему изобретению, была идентична на 100% нуклеотидной последовательности человеческого релаксина (например, H1, Н2 и/или Н3), но она может быть идентичной по меньшей мере примерно на 40, 50, 60, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% нуклеотидной последовательности человеческого релаксина. Релаксин, применяемый согласно настоящему изобретению, можно получать любым методом, известным специалистам в данной области. Примеры таких методов представлены, например, в U.S. №5759807, а также у Bullesbach и др., The Journal of Biological Chemistry 266, 1991, cc.10754-10761. Примеры молекул релаксина и их аналоги представлены, например, в U.S. №5166191. Встречающийся в естественных условиях биологически активный релаксин можно получать из таких источников, как человек, представители мышиных (а именно, мышь или крыса), свинья или другие млекопитающие. Определение включает также релаксин, модифицированный с целью удлинения его времени полужизни in vivo, например, ПЭГилированный релаксин (т.е. релаксин, конъюгированный с полиэтиленгликолем), релаксин, в котором модифицированы аминокислоты, которые подвергаются расщеплению расщепляющими ферментами, и т.п. Понятие включает также релаксин, содержащий A- и B-цепи, укороченные на N- и/или C-конце. В целом, в релаксине Н2 A-цепь может варьироваться от А(1-24) до А(10-24) и B-цепь может варьироваться от В(1-33) до В(10-22); а в релаксине H1, A-цепь может варьироваться от А(1-24) до А(10-24) и B-цепь может варьироваться от В(1-32) до В(10-22). Под понятие «релаксин» подпадают также другие варианты, полученные путем инсерций, замен или делеций одного или нескольких аминокислотных остатков, варианты с различной схемой гликозилирования, негликозилированный релаксин, органические и неорганические соли, ковалентно модифицированные производные релаксина, препрорелаксин и прорелаксин. Под понятие «релаксин» подпадает также аналог релаксина, имеющий аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности дикого типа (т.е. от встречающейся в естественных условиях), включая (но, не ограничиваясь только ими) аналоги релаксина, описанные в U.S. №5811395. Возможными модификациями аминокислотных остатков релаксина могут служить ацетилирование, формилирование или сходная защита свободных аминогрупп, включая N-концевые, амидирование C-концевых групп или образование эфиров гидроксильных или карбоксильных групп, например, модификация триптофанового остатка (Trp) на В2 путем добавления формильной группы. Формильная группа является типичным примером легко удаляемой защитной группы. Другими возможными модификациями являются замена одной или нескольких встречающихся в естественных условиях аминокислот в B-цепи и/или A-цепи на другую аминокислоту (включая D-форму встречающейся в естественных условиях аминокислоты), включая (но не ограничиваясь только ими) замену остатка Met в В24 на норлейцин (Nle), валин (Val), аланин (Ala), глицин (Gly), серии (Ser) или гомосерин (HomoSer). Другими возможными модификациями являются делеция встречающейся в естественных условиях аминокислоты из цепи или добавление к цепи одной или нескольких дополнительных аминокислот. Дополнительными модификациями могут служить аминокислотные замены в стыках B/C и C/A прорелаксина, указанные модификации облегчают отщепление C-цепи от прорелаксина; и вариант релаксина, содержащий не встречающийся в естественных условиях C-пептид, например, описанный в U.S. №5759807. Под понятие «релаксин» подпадают также слитые полипептиды, содержащие релаксин и гетерологичный полипептид. Гетерологичный полипептид (например, полипептид, не являющийся релаксином), который представляет собой компонент слияния, может находиться на C-конце или на N-конце компонента слитого белка, представляющего собой релаксин. Гетерологичные полипептиды включают обнаруживаемые иммунологическими методами полипептиды (например, «эпитопные метки»); полипептиды, обладающие способностью генерировать обнаруживаемый сигнал (например, зеленый флуоресцентный белок, ферменты, такие как щелочная фосфатаза, и другие известные в данной области); терапевтические полипептиды, включая (но не ограничиваясь только ими) цитокины, хемокины и факторы роста. Все такие вариации или изменения структуры молекулы релаксина, приводящие к образованию вариантов, подпадают под объем настоящего изобретения, если они сохраняют функциональную (биологическую) активность релаксина. Предпочтительно любая модификация аминокислотной последовательности или структуры релаксина представляет собой модификацию, которая не повышает его иммуногенность в организме индивидуума, которому вводят вариант релаксина. Варианты релаксина, обладающие указанной функциональной активностью, можно легко идентифицировать с помощью анализов in vitro и in vivo, известных в данной области.

Релаксин

Релаксин представляет собой полипептидный гормон, сходный по размеру и форме с инсулином. Он является эндокринным и аутокринным / паракринным гормоном, относящимся к суперсемейству генов инсулина. Активная форма кодируемого белка состоит из A-цепи и B-цепи, соединенных дисульфидными связями, двумя межцепочечными и одной внутрицепочечной. Таким образом, с точки зрения расположения дисульфидных связей структура очень близка к структуре инсулина. У человека известны три неаллельных гена релаксина, релаксин-1 (RLN-1 или H1), релаксин-2 (RLN-2 или Н2) и релаксин-3 (RLN-3 или Н3). H1 и Н2 обладают высокой степенью гомологии последовательностей.

Для этого гена описаны два образующихся в результате альтернативного сплайсинга варианта транскрипта, кодирующие различные изоформы. H1 и Н2 отличаются дифференциальной экспрессией в репродуктивных органах (U.S. №5023321 и Garibay-Tupas и др., Molecular and Cellular Endocrinology 219, 2004, cc.115-125), в то время как Н3 обнаружен в основном в головном мозге. В целом эволюция рецепторов пептидного семейства релаксинов хорошо известна в данной области (Wilkinson и др., ВМС Evolutionary Biology 5, 2005, cc. 1-17; и Wilkinson и Bathgate, глава 1, Relaxin and Related Peptides, изд-во Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, 2007). Кроме того, релаксин, рецепторы релаксина и агонисты релаксина описаны более подробно в заявке на патент №20100048475.

Физиология и нарушения, ассоциированные с аквапорином

Естественно, что аквапорины (AQP) участвуют во многих физиологических процессах. Например, AQP1 присутствует в почках в больших количествах, как в апикальной, так и в базолатеральной мембранах почечных проксимальных канальцев и в эндотелии капилляров. По существу AQP1 обеспечивает механизм противотока при концентрировании и обмене мочи. В слюнной железе AQP3 обнаружен в базолатеральных мембранах, через которые происходит отбор воды из интерстициального пространства, a AQP5 обнаружен в апикальной мембране, через которую происходит высвобождение воды. С потерей функции или дисфункцией аквапоринов связан целый ряд клинических нарушений, включая патологии почечной функции, потерю зрения, начало отека головного мозга и голодание. Кроме того, по-видимому, AQP1 участвует в ангиогенезе, заживлении ран, регенерации органов и онкогенезе (Kruse и др. (выше)).

AQP4, представляющий собой водный канал мембраны глиальных клеток, связан с образованием отека головного мозга, который играет важную роль в заболеваемости, обусловленной такими нарушениями нервной системы, как травма головного мозга, опухоли, «удар», инфекция и нарушения метаболизма. Современные подходы к лечению отека головного мозга ограничены применением гиперосмолярных препаратов и осуществлением хирургической декомпрессии, т.е. теми подходами к лечению, которые стали применять более 70 лет тому назад. В ряде исследований на модели отека головного мозга, вызванного острой водной интоксикацией, было продемонстрировано, что мыши с дефицитом AQP4 характеризуются более высокой выживаемостью по сравнению с мышами дикого типа. При этом было установлено, что содержание воды в ткани головного мозга и процессы опухания перикапиллярных астроцитарных «ножек» может быть снижено у мышей с дефицитом AQP4. Характерные процессы опухания астроцитарных «ножек» были обнаружены также в ткани головного мозга пациентов с травмой головного мозга. С использованием другой модели отека головного мозга, такой как ишемический «удар», вызываемый окклюзией средней мозговой артерии, было продемонстрировано, что для мышей с дефицитом AQP4 характерен также более благоприятный неврологический исход. Степень церебрального отека оценивают путем измерения увеличения размера (в процентах) полушария через 24 ч, и было установлено, что у мышей с дефицитом AQP4 она снижена на 35%. Эти данные позволяют предположить, что AQP4 играет ключевую роль в модулировании водного транспорта в головном мозге, и, кроме того, свидетельствуют о том, что ингибирование AQP4 может представлять собой новый терапевтический подход к снижению отека головного мозга в случае широкого разнообразия церебральных нарушений (Manley и др., Nature Medicine 6, 2000, сс.159-163). Однако в другом исследовании было выдвинуто предположение о том, что непосредственная активация астроцитарного рецептора ЕТВ (эндотелии В) снижает экспрессию AQP4, вызывая уменьшение экскреции вызывающей отек жидкости и приводя к аггравации вазогенного отека головного мозга (Коуата и др., Neuroscience Letters 469, 2010, сс.343-347). В указанном исследовании было выдвинуто также предположение о том, что цитотоксический отек можно уменьшать посредством снижения экспрессии AQP4 благодаря предупреждению поступления воды, в то время как вазогенный отек можно уменьшать посредством повышения экспрессии AQP4 благодаря увеличению оттока вызывающей отек жидкости.

Проводилось изучение экспрессии AQP1, AQP4 и AQP9 в головном мозге в период беременности. В этом случае для оценки экспрессии aqpl, aqp4 и aqp9 осуществляют количественную ПЦР в реальном времени с использованием образцов, полученных из различных областей головного мозга в период беременности и в послеродовом состоянии. В процессе беременности встречаются патологические состояния, характеризующиеся образованием церебрального отека, включая последующий синдром обратимой энцефалопатии, эклампсии и преэклампсии. Эклампсия и преэклампсия представляют собой серьезные осложнения беременности, при которых возникают неврологические симптомы. Эти симптомы развиваются вследствие образования вазогенного отека головного мозга, обусловленного острым повышением кровяного давления. Образование отека при эклампсии происходит в основном в задних областях головного мозга. Следует отметить, что в задней области большого мозга наблюдается более высокий уровень экспрессии AQP4, чем в передней области большого мозга, как у животных, находящихся на поздней стадии беременности, так и у животных, находящихся на послеродовой стадии, указанные две стадии представляют собой стадии, на которых, как правило, развивается эклампсия (Wiegman и др., Reproductive Sciences 15, 2008, cc.506-516).

AQP1 и AQP5 связаны с опуханием и отеком роговицы. При связанных с отеком заболеваниях роговицы теряют прозрачность, что приводит к значительной потере зрения. AQP1 и AQP5 экспрессируются в эндотелиальных и эпителиальных клетках роговицы соответственно, и их функция заключается облегчении водного транспорта, происходящего под действием осмотического давления. Для изучения вопроса о том, участвуют ли указанные аквапорины в транспорте жидкости в роговице и обеспечении ее прозрачности, создавали трансгенных мышей. Для этой цели проводили, например, сравнение толщины роговицы, ее проницаемости для воды и ответа на вызываемое экспериментальным путем опухание у мышей дикого типа и трансгенных мышей с отсутствием aqp1 и aqp5. Было установлено, что делеция aqp5 у мышей приводит к увеличению толщины роговицы и снижению осмотической проницаемости роговичного эпителия для воды. Кроме того, было установлено, что делеция aqpl приводит к уменьшению толщины роговицы и снижению осмотической проницаемости роговичного эндотелия для воды и ухудшает восстановление прозрачности роговицы после вызванного экспериментальным путем опухания. Следовательно, ингибирование AQP5 или AQP1 нетоксичными блокаторами может изменять структуру роговицы и содержание воды. Кроме того, повышающая регуляция AQP1 в эндотелии роговицы может оказаться очень полезной с точки зрения уменьшения отека роговицы и увеличения ее прозрачности после повреждения (Thiagarajah и др., The Journal of Biological Chemistry 277, 2002, сс.19139-19144). Аналогично этому установлено, что AQP1, AQP3 и AQP4 связаны с псевдофакической буллезной кератопатией (ПБК), афакической буллезной кератопатией (АБК) и дистрофией Фукса. Указанные нарушения представляют собой заболевания роговицы, при которых основными патофизиологическими компонентами являются дисфункция эндотелиальных клеток и хронический отек. Когда присутствуют эти состояния, то происходит накопление жидкости в эпителиальных клетках и может существенно увеличиваться толщина роговицы, приводя к потере ее прозрачности и снижению зрения. Было установлено, что при ПБК и АБК в роговице изменяется распределение AQP1, AQP3 и AQP4, в то время как при дистрофии Фукса в роговице имеют место изменения AQP1 (Kennedy и др., Journal of Histochemistry and Cytochemistry 52, 2004, сс.1341-1350).

Аквапорины участвуют также в клинических нарушениях разбавления и концентрирования мочи. Изучение AQP1 и прежде всего AQP2, AQP3 и AQP4, наряду с транспортерами мочи и ионов позволило глубже понять механизм разбавления и концентрирования мочи на клеточном и молекулярном уровнях. Например, AQP1 конститутивно экспрессируется как на апикальной, так и на базолатеральной мембранах проксимального канала и нисходящей ветви петли Хенла. Мыши с «выключенным» aqp1 характеризуются сниженной максимальной осмоляльностью мочи. Этот факт имеет место также и у людей, у которых отсутствует ген aqp1. AQP3 и AQP4 локализованы на базолатеральной мембране основных клеток в собирающем протоке. AQP3 регулируется аргинин-вазопрессином (AVP). Для мышей с «выключенным» aqp3 характерна выраженная полиурия, являющаяся следствием устойчивого к вазопрессину нефрогенного несахарного диабета (ННД). AQP4 присутствует преимущественно на базолатеральной мембране внутренней области мозгового слоя и не регулируется A VP. Для мышей с «выключенным» aqp4 также характерен ННД, но он является менее серьезным, чем у мышей с «выключенным» aqp3. AQP3 и AQP4 образуют выводные каналы для перемещения воды через базолатеральную мембрану собирающего протока, в то время как AQP2 представляет собой водный канал для реабсорбции воды через апикальную мембрану основных клеток собирающего протока. Фактически AQP2 обнаружен исключительно в основных клетках собирающего канальца и собирающего протока, регулируемых аргинин-вазопрессином (AVP). Однако некоторые результаты позволяют предположить, что регулирование AQP2 обусловлено гиперосмоляльностью, которая не зависит от AVP. Помимо многочисленных других нарушений водный дисбаланс может приводить как к имеющей клиническое значение гипонатриемии, так и к гипернатриемии. Гипонатриемия является более распространенной, и она представляет собой наиболее часто встречающееся нарушение жидкостно-электролитного баланса у госпитализированных пациентов, а именно, ее встречаемость превышает встречаемость гипонатриемии у госпитализированных пациентов на 15-30% (Schrier, Journal of the American Society of Nephrology 17, 2006, cc.1820-1832).

Релаксин модулирует аквапорины, оказывая воздействия на репродуктивную физиологию

На поздней стадии беременности происходит экстенсивное изменение внеклеточного матрикса (ЕСМ) шейки матки в результате созревания шейки матки, что позволяет плоду проходить через родовой канал при родах. Созревание шейки матки вызывается серией процессов, приводящих к расщеплению и рассасыванию коллагена. Пептидный гормон релаксин, присутствующий в яичнике, является одним из факторов, участвующих в этих процессах, однако современные теории, касающиеся механизмов действия релаксина, не дают ответа на многие вопросы. При создании настоящего изобретения была проверена новая гипотеза о том, что релаксин вызывает повышение содержания воды в шейке матки и рассасывание коллагеновых волокон посредством регулирования аквапоринов (AQP) (см. пример 1). Было установлено, что экспрессия гена aqp3 в шейке матки существенно снижалась у мышей с «выключенным» геном релаксина (Rln^-/-) в конце беременности (фиг.1). Белок AQP3 был локализован в основном в базальных эпителиальных клетках в шейке матки мышей и у Rln^-/--мышей было выявлено снижение уровня иммунореактивного AQP3 в этой области (фиг.2). Во втором исследовании беременных Rln^-/--мышей обрабатывали релаксином, что приводило к значительному увеличению уровня aqp3 в шейке матки и к снижению экспрессии гена aqp5 по сравнению с контролями, которых обрабатывали плацебо (фиг.3). У беременных Rln^-/--мышей, обработанных релаксином, был выявлен обладающий большей иммунореактивностью AQP3 в базолатеральном эпителии и обладающий более низкой иммунореактивностью AQP5 в базальных клетках эпителия по сравнению с контролями, которых обрабатывали плацебо (фиг.4). Кроме того, обработка релаксином приводила к значительному увеличению влажной массы шейки матки и рассасыванию коллагена в стромальном ЕСМ. Эти результаты свидетельствуют о том, что релаксин модулирует экспрессию гена и белка аквапорина и может модулировать водный баланс в репродуктивных тканях.

AQP5, по-видимому, регулируется цАМФ. Вероятно, это осуществляется посредством активации протеинкиназы А (РКА), поскольку ингибирование РКА блокирует цАМФ-опосредованную транслокацию AQP5 в клетки линии MLE-12 легочного эпителия (Sidhaye и др., The Journal of Biological Chemistry 280, 2005, сс.3590-3596). Как указано выше, обработка релаксином беременных Rln^-/--мышей снижала экспрессию AQP5 по сравнению с контролями, которых обрабатывали физиологическим раствором. В этом случае по данным анализа методом ELISA установлено, что на 6-й день после осуществления инфузии концентрации релаксина снижались, но при пониженной концентрации релаксина не происходило снижения ингибирующего действия релаксина на экспрессию AQP5. Авторы изобретения постулировали, что релаксин может регулировать экспрессию AQP5 или транслокацию посредством цАМФ-пути, в котором участвует активация РКА. Релаксин активирует также цАМФ двухступенчатым образом, посредством активации фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), что требуется для второго пути (Dessauer и Nguyuen, Annals of the New York Academy of Sciences 1041, 2005, cc.272-279). В шейке матки функциональное значение AQP5 на ранней стадии беременности заключается в том, что он обеспечивает приток воды в строму, а также усиливает секрецию слизи в эпителиальных клетках (Anderson и др., Endocrinology 147, 2006, сс.130-140). Авторы изобретения выдвинули предположение о том, что снижение экспрессии AQP5 у Rln^+/+-мышей, находящихся на поздней стадии беременности, обусловлено ингибирующим действием присутствующего в естественных условиях релаксина.

Другой возможный механизм действия AQP5 связан с участием провоспалительного агента. Было выдвинуто предположение о том, что созревание шейки матки представляет собой воспалительный ответ, который обусловлен высокими уровнями провоспалительных агентов, обнаруженных в шейке матки беременных особей. Еще предстоит изучить точную роль и взаимосвязи провоспалительных агентов, таких как цитокины, прежде всего IL-8, или фактор активации тромбоцитов (PAF), хемотаксический для моноцитов белок-1 (МСР-1) и макрофаги, в шейке матки, но наличие высоких уровней провоспалительных факторов совпадает с активной фазой созревания шейки матки. Возможным путем регулирования AQP5 является активация канонического NF-kB-пути посредством TNF-альфа, представляющего собой провоспалительный фактор, который связывается с TNFR1, в результате чего осуществляется тем самым ингибирование и/или понижающую регуляцию мРНК AQP5 (снижение в 2 раза) и белка (снижение в 10 раз) (Towne и др., The Journal of Biological Chemistry 276, 2001, cc.18657-18664). AQP5 подвергается также повышающей регуляции посредством независимого ERK-пути, но это имеет место только в гиперосмотических условиях в MLE-15-клетках (Hoffert и др., The Journal of Biological Chemistry 275, 2000, cc.9070-9077). Хотя NF-kB активирует несколько сигнальных путей, таких как ERK- и МЕК-путь, основное вклад в регулирование AQP5 обусловлен непосредственно NF-kB-транскриптами. Как показали проведенные в последние годы исследования, связь в данном случае заключается в том, что в человеческих ТНР-1-клетках релаксин приводит к повышению уровней двух субъединиц NF-kB, а именно р50 и р65 (активаторы транскрипции), и снижает уровень IkB-альфа, который ингибирует транслокацию NF-kB в ядро (Но и др., Journal of Leukocyte Biology 81, 2007, cc.1303-1310). Следует иметь в виду, что данное исследование было проведено для того, чтобы продемонстрировать индукцию ММР-9 релаксином посредством NF-kB-пути, и следовательно, указанный путь является всего лишь одним из возможных механизмов.

Релаксин модулирует аквапорины, оказывая воздействуя на жидкостной гомеостаз

Большинство исследований пептидного гормона релаксина сфокусированы на изучении его роли в репродукции млекопитающих, поскольку указанный гормон секретируется яичником в высоких концентрациях в период беременности. Его классическая роль ассоциирована с процессами ремоделирования ткани, которые происходят во внеклеточном матриксе шейки матки и влагалища животного до начала родов. Однако в настоящее время стало очевидным, что релаксин играет важную роль в почках.

Известно, что определенные виды обитающих в пустыне животных решают проблему ограниченной доступности воды посредством разнообразных морфологических, поведенческих и физиологических адаптации. В частности, они обладают способностью концентрировать свою мочу для предупреждения потери воды в больших количествах при экскретировании остатков, образовавшихся в результате метаболизма. По-видимому, это представляет собой наиболее важный механизм сохранения воды, доступный наземным позвоночным, прежде всего тем, которые обитают в засушливых условиях. Сохранение воды осуществляется в собирающем протоке почки. Если осмоляльность плазмы (т.е. параметр, характеризующий концентрацию растворенного вещества, который выражают в виде количества осмолей (осм) растворенного вещества на литр (л) раствора) повышается, то проницаемость указанных протоков для воды существенно возрастает и вода перемещается из нефрона в окружающее мозговое вещество. Один из основных механизмов концентрирования мочи, ассоциированный с реабсорбцией воды, основан на гормоне вазопрессине и его взаимодействиях со специфическими молекулами водного канала (а именно, аквапоринами), конкретно с AQP2, присутствующим в собирающем протоке, который простирается до почечных сосочков. Однако конкретная функция почечных сосочков в настоящее время недостаточно изучена. Важно отметить, что иглистые мыши переносят значительное повышение осмоляльности плазмы, возникающее после поглощения соли, не употребляя в больших количествах воду, в то время как лабораторные мыши нуждаются в питье. Например, австралийские прыгающие мыши очень быстро реагируют на недостаток воды путем уменьшения объема мочи, и повышения осмоляльности мочи. У лабораторной мыши этого не происходит. Поэтому при создании изобретения было проведено изучение механизма концентрирования мочи на лабораторных мышах и крысах для того, чтобы установить корреляцию полученных данных с данными, полученными на других млекопитающих, включая человека. Это оказалось трудной задачей, поскольку механизм концентрирования мочи не базируется на повышении уровня вазопрессина или ренин-ангиотензина. Поэтому при создании изобретения было сделано предположение о существовании ранее неизвестно функции пептидного гормона релаксина и его рецептора, т.е. RXFP1, в производстве концентрированной мочи в почке, прежде всего в ответ на ограничение воды и повышение солености. Авторы настоящего изобретения выдвинули предположение о том, что релаксин представляет собой имеющий решающее значение регуляторный фактор, участвующий в производстве концентрированной мочи в почке, и что релаксин оказывает непосредственное действие на клетки собирающего протока во внутреннем мозговом слое, стимулируя внутриклеточный цАМФ и опосредуя транспорт AQP2 в апикальную мембрану (см. пример 2). При создании настоящего изобретения был выявлен высокий уровень экспрессии RXFP1 в сосочках лабораторных мышей (см. фиг.6), т.е. в специфической области почки, в которой происходит экспрессия AQP2 и AQP4 (см. фиг.8 и фиг.10). При создании настоящего изобретения была выявлена также экспрессия RXFP1 в почечных канальцах, находящихся как в области коркового слоя, так и мозгового слоя почек лабораторных крыс (фиг.7). Эти данные, полученные на различных видах животных, свидетельствуют о наличии рецепторов релаксина в областях почки, в которых происходит экспрессия AQP2 и AQP4, ответственных за проницаемость для воды. Кроме того, релаксин может непосредственно воздействовать на вазопрессин и оказывать непосредственное осморегулирующее действие на саму почку (см. пример 2). При создании настоящего изобретения было установлено, что обработка релаксином мышей и крыс повышает экспрессию AQP2 и AQP4 в почке (см. фиг.8, 10 и 11). Эти данные впервые свидетельствуют о наличии связи между релаксином и аквапоринами. Известно также, что обработка релаксином крыс стимулирует высвобождение вазопрессина посредством усиления нервной активности в головном мозге (McKinley и др., Journal of Neuroendocrinology 16, 2004, cc.340-347). Основываясь на этих данных, авторы настоящего изобретения выдвинули предположение о том, что механизм сохранения воды в почке базируется на непосредственном регуляторном воздействии релаксина на аквапорины или на косвенном регуляторном воздействии на AQP, которое опосредуется высвобождением вазопрессина из головного мозга.

Лечение отека релаксином

Отек представляет собой форму опухания, которое обусловлено задержкой жидкости в тканях. Наиболее часто это происходит в нижних конечностях, а именно, в ступнях, щиколотках и голенях, но может иметь место также и в других частях организма, таких как лицо и руки. Отек может возникать вследствие слишком продолжительного времени нахождения в сидячем или стоячем положении на одном месте, поскольку вода спускается вниз в ноги под действием силы тяжести. Отек может являться также результатом ослабления клапанов в венах ног (т.е. венозной недостаточности). Это состояние приводит к тому, что венам становится трудно проталкивать кровь назад к сердцу, в результате чего возникают варикозные вены и происходит застаивание жидкости в ногах. Определенные заболевания или состояния (например, застойная сердечная недостаточность, заболевание легких, заболевание печени, заболевание почек, заболевание щитовидной железы, травматическое повреждение головы) могут приводить к возникновению отека или увеличивать его. Отек в ногах может вызываться беременностью, поскольку матка повышает давление в кровеносных сосудах, находящихся в нижней части туловища. Кроме того, к отеку могут приводить преэклампсия и эклампсия, состояния, ассоциированные с беременностью. Преэклампсия вызывает изменения в кровеносных сосудах, которые приводят к «просачиванию» жидкости из них в ткани. Просачивание вызывает опухание тканей, приводящее к отеку. Когда преэклампсия становится более серьезной, то опухание может иметь место в печени, что может приводить к разрыву печени, сопровождающемуся кровоизлиянием. Иногда опухание может иметь место также в головном мозге, приводя к судорогам, известным как эклампсия.

Церебральный отек представляет собой опасное заболевание, которое при отсутствии лечения может приводить к смерти. Он является результатом избыточного накопления воды во внутриклеточных и/или внеклеточных пространствах головного мозга. Существуют различные формы церебрального отека, включая вазогенный церебральный отек, который дополнительно подразделяют на гидростатический церебральный отек, возникающий при острой и злокачественной гипертензии; церебральный отек, вызываемый раком головного мозга; и церебральный отек большой возвышенности (High Altitude Cerebral Edema, HACE). Помимо вазогенного церебрального отека существует цитотоксический церебральный отек (т.е. отек, обусловленный нарушением клеточного метаболизма вследствие неадекватного функционирования натриевого и калиевого насоса в мембране глиальных клеток, что приводит к удерживанию натрия и воды в клетке и набуханию астроцитов в сером и белом веществе головного мозга); осмотический церебральный отек (т.е. отек, при котором нарушена осмоляльность спинномозговой жидкости (СМЖ) и внеклеточной жидкости (ВЖ) в головном мозге, в результате чего создается аномальный градиент давления, приводящий к притоку воды в головной мозг); и интерстициальный церебральный отек (как, например, в случае окклюзионной гидроцефалии, при которой отек вызывается разрушением барьера между СМЖ и головным мозгом, которое приводит к трансэпендимальному току СМЖ, позволяющему СМЖ проникать в головной мозг и распространяться по внеклеточному пространству в белом веществе).

Вазогенный отек обусловлен разрушением гематоэнцефалического барьера. Это разрушение позволяет интраваскулярным белкам и жидкости, которые в здоровом состоянии изолированы, проникать во внеклеточное пространство паренхимы головного мозга. Когда компоненты плазмы проникают через гематоэнцефалический барьер, то происходит распространение отека, которое часто бывает довольно быстрым. Когда вода поступает в белое вещество, то она перемещается вне клеток вдоль путей прохождения волокон и таким образом может повреждать также серое вещество. Установлено, что такой тип отека возникает в ответ на травму головного мозга, опухоли, очаговое воспаление, наблюдается на поздних стадиях ишемии головного мозга и гипертензивной энцефалопатии. Например, только в Соединенных Штатах ежегодно регистрируется примерно два миллиона визитов в кабинеты неотложной помощи по поводу травм головы, примерно 475000 госпитализаций по поводу травм головы, примерно 52000 смертей и примерно 80000 случаев возникновения серьезной продолжительной потери трудоспособности. До настоящего времени не имеется разрешенного FDA лекарственного средства для лечения серьезной травмы головы и обусловленного ей отека. Пациенты с травматическим повреждением головы часто имеют серьезные нарушения и страдают потерей сознания, потерей памяти и очаговыми неврологическими дефектами, которые могут быть кратковременными, но могут и не быть таковыми.

Существует мнение, что в развитии церебрального отека участвуют AQP1, AQP4 и AQP9. По-видимому, AQP4, представляющий собой присутствующий в наибольшем количестве в головном мозге аквапорин, играет основную роль в связанных с водой особенностях физиологии головного мозга, отеке головного мозга и гидроцефалии (Brian и др., Cerebrospinal Fluid Research 7, 2010, сс.15). На моделях вызванного экспериментальным путем церебрального отека у крыс (например, путем обработки эпсилон-токсином) было установлено повышение уровня экспрессии AQP4, что согласуется с полученными ранее данными (см. Manley и др. (выше)). Однако результаты, полученные с применением другой экспериментальной модели, позволили предположить, что непосредственная активация рецептора эндотелина В (ЕТВ) астроцитов вызывает снижение уровня экспрессии AQP4, приводя к уменьшению экскреции жидкости, вызывающей отек, и к обострению вазогенного отека головного мозга (Koyama и др., Neuroscience Letters 469, 2010, сс.343-347). Важно отметить, что в рассматриваемом исследовании сделано также предположение о том, что цитотоксический отек можно уменьшать путем снижения экспрессии AQP4 благодаря предупреждению поступления воды, в то время как вазогенный отек можно уменьшать путем повышения экспрессии AQP4 благодаря увеличению оттока жидкости, вызывающей отек. Авторы изобретения выдвинули предположение о том, что обработка релаксином может снижать уровень экспрессии AQP4 в случае цитотоксического отека, это согласуется с данными о том, что релаксин обладает эффективностью в качестве агониста рецептора ЕТВ и антагониста эндотелина-1 (Dschietzig и др., Circ Res. 92, 2003, сс.32-40). Кроме того, релаксин может повышать уровень экспрессии AQP4 в случае вазогенного отека, что может осуществляться посредством второго механизма действия. Следует отметить, что при создании изобретения было установлено, что после обработки релаксином имеет место повышение уровня экспрессии AQP4 в ткани почки (в дополнение к повышению уровня AQP2). Следовательно, сходное действие в отношении AQP4 может иметь место и ткани головного мозга в случае вазогенного отека, это согласуется с данными о том, что AQP4 представляет собой новую потенциальную мишень для лекарственных средств (см. Manley и др. и Коуата и др. (выше)).

Существует мнение о том, что в развитии отека глаза участвуют AQP1, AQP3, AQP4 и AQP5. Установлено, что при отеке глаза, связанном с псевдофакической/афакической буллезной кератопатией (РВК/АВК) роговиц и дистрофии роговиц Фукса имеет место повышенная экспрессия AQP3 и AQP4 в пораженных заболеванием роговицах, что может вносить вклад в развитие опухания. Авторы изобретения выдвинули предположение о том, что лечение глазного отека релаксином может вызывать модуляцию AQP3 и/или AQP4 в роговице пациента.

Существует мнение о том, что в развитии отека легких участвуют AQP1, AQP3, AQP4 и AQP5. На моделях вызванного экспериментальным путем отека легких у крыс и мышей было установлено снижение уровня экспрессии AQP1, AQP4 и AQP5 и повышение уровня экспрессии AQP3. Например, обработка тиомочевиной приводила к очень быстрому снижению уровня экспрессии указанных аквапоринов, в то время как при обработке гипероксической смесью снижение происходило в течение 72 ч. Авторы изобретения выдвинули предположение о том, что лечение отека легких релаксином может вызывать модуляцию AQP1, AQP3, AQP4 и/или AQP5. Одним из возможных сценариев является повышение уровня экспрессии AQP1, AQP4 и/или AQP5 и снижение уровня экспрессии AQP3 в легком пациента в результате лечения релаксином.

Предполагается, что релаксин ослабляет системный отек посредством механизма, который регулирует и/или модулирует водные каналы (т.е. аквапорины), как подробно изложено в настоящем описании. Однако, в уменьшении отека по меньшей мере частично может участвовать по меньшей мере один из двух дополнительных механизмов. Так, второй механизм, который также может играть роль в данном случае, заключается в регулировании ионного транспорта и градиентов осмотического давления, поэтому релаксин, например, при отеке легких, может увеличивать ионный транспорт и, следовательно, градиент осмотического давления через альвеолярные эпителиальные клетки, способствуя тем самым клиренсу жидкости из воздушных пространств легкого (Zemans и др., Critical Care 8, 2004, cc.469-477). Третий механизм, который может участвовать в данном случае, заключается в регулировании гемодинамики, поэтому, например, поскольку чрезмерное удерживание натрия в почках является основной причиной, лежащей в основе всех форм системного отека, то посредством улучшения почечной гемодинамики и/или скорости клубочковой фильтрации (GFR), релаксин может способствовать экскреции натрия через почки, облегчая тем самым системный отек. Кроме того, релаксин может оказывать натрийуретическое действие, по меньшей мере кратковременно, что может способствовать экскреции натрия через почки при развитии системного отека (Jeyabalan и Conrad, Renal Physiology and Pathophysiology in Pregnancy, в: Renal and Electrolyte Disorders, 4-е изд., под ред. R.W.Schrier, изд-во Little Brown and Company, 2010).

В целом, при создании изобретения было продемонстрировано, что релаксин обладает способностью модулировать экспрессию аквапорина в различных тканях. Следовательно, можно ожидать, что релаксин может обладать эффективностью в отношении лечения вазогенного отека, поскольку он повышает уровень экспрессии аквапоринов и стимулирует перемещение воды из отечных тканей или органов, уменьшая тем самым накопление воды и опухание. В альтернативном варианте релаксин может снижать экспрессию аквапоринов и уменьшать дополнительное перемещение воды в ткани или органы, препятствуя тем самым обострению цитотоксического отека. Кроме того, релаксин может регулировать транспорт растворенных веществ между тканями и кровью, тем самым оказывая воздействие на перемещение воды в ткани и из тканей и уменьшая отек в тканях и органах. Кроме того, в этом случае может иметь место гемодинамическое воздействие релаксина на сосудистую сеть в различных органах, улучшающее транспорт воды от пораженного органа.

При создании изобретения был разработан способ лечения отека у пациентов, предусматривающий введение релаксина. Согласно этому способу пациентов лечат с применением суточной дозы фармацевтически активного релаксина (например, синтетического, рекомбинантного, аналога, агониста и т.д.), составляющей примерно от 1 до 1000 мкг/кг веса тела индивидуума в день. В контексте настоящего изобретения понятие «примерно» применительно к указанной величине включает диапазон, охватывающий вплоть до 10% выше или нижеуказанной величины (например, 90-110% от указанной величины). Например, скорость внутривенной (IV) инфузии, составляющая примерно 30 мкг/кг/день, включает скорости IV-инфузии, составляющие от 27 до 33 мкг/кг/день. В одном из вариантов осуществления изобретения дозы релаксина составляют 10, 30, 100 и 250 мкг/кг/день. Эти дозы обеспечивают концентрации релаксина в сыворотке, составляющие примерно 1, 3, 10, 30, 75 или 100 нг/мл. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения фармацевтически эффективный релаксин или его агонист вводят в дозе, составляющей примерно 30 мкг/кг/день. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтически эффективный релаксин или его агонист вводят в дозе, составляющей от примерно 10 до примерно 250 мкг/кг/день. В другом варианте осуществления изобретения введение релаксина продолжают таким образом, чтобы поддерживать концентрацию релаксина в сыворотке на уровне от примерно 0,5 до примерно 500 нг/мл, более предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 300 нг/мл и наиболее предпочтительно от примерно 1 до примерно 10 нг/мл. Наиболее предпочтительно введение релаксина продолжают таким образом, чтобы поддерживать концентрацию релаксина в сыворотке на уровне, составляющем 10 нг/мл или выше. Такие концентрации релаксина могут ослаблять или уменьшать накопление жидкости, с которым ассоциирован отек, включая (но не ограничиваясь только ими) церебральный отек, отек глаза, отек легких, асциты, наследственный ангионевротический отек, периферический отек и системный отек.

Лечение нефрогенного несахарного диабета (ННД) с помощью релаксина

Нефрогенный несахарный диабет (ННД) представляет собой состояние, возникающее в том случае, когда почечные протоки не реагируют на антидиуретический гормон (АДГ), который называют также вазопрессином. В результате этого нарушается механизм концентрирования мочи, что приводит к избыточному производству разбавленной мочи в организме пораженного заболеванием индивидуума. Помимо основного симптома, заключающегося в экскреции в больших количествах разбавленной мочи (т.е. полиурии), для пораженного заболеванием индивидуума характерна потребность в питье воды в больших количествах (т.е. полидипсия), для восполнения потери воды, выводимой с мочой. Дополнительными осложнениями являются быстрая дегидратация, избыточная жажда, раздражимость, апатичность, лихорадочное состояние, рвота, запор или диарея, судороги и неспособность набирать вес.

ННД, по-видимому, вызывается частичной инактивирующей мутацией или SNP (полиморфизм единичного нуклеотида) в рецепторе V2 (вазопрессин 2). Авторы настоящего изобретения предположили, что релаксин облегчает ННД посредством механизма, повышающего уровень цАМФ в основных клетках. Если существует перекрывание пулов цАМФ, обусловленных релаксином и AVP (аргинин-вазопрессин), то релаксин может увеличивать встраивание AQP2 и AQP3 в апикальные и базолатеральные мембраны соответственно, а также повышать их экспрессию посредством осуществления частичной инактивирующей мутации или SNP в рецепторе V2. При этом по меньшей мере один из двух дополнительных механизмов могут вносить вклад по меньшей мере частично в облегчение ННД. Так, второй механизм заключается в повышении уровня цАМФ в основных клетках концевой области собирающего протока. Передача цАМФ-сигнала приводит, как указано выше, к встраиванию UT-A1 и UT-A3 в мембрану, способствуя тем самым отложению мочи во внутреннем мозговом слое, что обусловливает до 60% кортико-папиллярного (C-P) градиента осмотического давления. Третий механизм заключается в повышении экспрессии котранспортера Na/K/2Cl в медуллярном толстом отделе восходящей петли Генла (ALH), активность которого создает «уникальное действие», имеющее кардинальное значение для формирования C-P-градиента осмотического давления, концентрирования и разбавления мочи (Hebert и Andreoli, American Journal of Physiology 246, 1984, сс.745-756).

В настоящем изобретении предложен способ лечения ННД у пациентов, предусматривающий введение релаксина. Пациентов с ННД лечат с использованием подкожного насоса, обеспечивающего введение фармацевтически активного релаксина (например, синтетического, рекомбинантного, аналога, агониста и т.д.) в количестве, составляющем примерно от 1 до 1000 мкг/кг веса тела индивидуума в день. В одном из вариантов осуществления изобретения дозы релаксина составляют 10, 30, 100 и 250 мкг/кг/день. Указанные дозы обеспечивают концентрации релаксина в сыворотке, составляющие примерно 1, 3, 10, 30, 75 или 100 нг/мл. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения фармацевтически эффективный релаксин или его агонист вводят в дозе примерно 30 мкг/кг/день. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтически эффективный релаксин или его агонист вводят в дозе, составляющей от примерно 10 до примерно 250 мкг/кг/день. В другом варианте осуществления изобретения введение релаксина продолжают таким образом, чтобы поддерживать концентрацию релаксина в сыворотке на уровне от примерно 0,5 до примерно 500 нг/мл, более предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 300 нг/мл и наиболее предпочтительно от примерно 1 до примерно 10 нг/мл. Наиболее предпочтительно введение релаксина продолжают таким образом, чтобы поддерживать концентрацию релаксина в сыворотке на уровне 10 нг/мл или выше. Релаксин в указанных концентрациях может ослаблять или снижать избыточное производство разбавленной мочи и сопровождающие осложнения, ассоциированные с ННД.

Композиции и препаративные формы релаксина

Релаксин, агонисты релаксина и/или аналоги релаксина включают в состав фармацевтических лекарственных средств, предназначенных для применения согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении. Согласно настоящему изобретению в качестве фармацевтического лекарственного средства можно использовать любую композицию или соединение, которое обладает способностью стимулировать биологический ответ, ассоциированный со связыванием биологически или фармацевтически активного релаксина (например, синтетического релаксин, рекомбинантного релаксина) или агониста релаксина (например, аналога релаксина или релаксин-подобного модулятора) с рецептором релаксина. Общие сведения о методах приготовления препаративной формы и введения подробно описаны в научной литературе (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, изд-во Maack Publishing Co, Easton Pa.). Фармацевтические препаративные формы, содержащие фармацевтически активный релаксин, можно приготавливать согласно любым методам, известным в области изготовления фармацевтических лекарственных средств. Для применения в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, можно приготавливать препаративные формы, которые содержат фармацевтически активный релаксин или агонисты релаксина, предназначенные для введения любым обычным пригодным путем, включая (но не ограничиваясь только ими) внутривенное, подкожное, внутримышечное, подъязычное, интраназальное, интрацеребральное, интрацеребровентрикулярное введение, местное применение, оральное введение, введение в стекловидное тело или посредством ингаляции. Репрезентативные примеры приведены ниже. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения релаксин вводят внутривенно или подкожно.

Когда релаксин вводят путем внутривенной или подкожной инъекции (например, посредством инфузии, болюсного введения, введения с помощью насоса), то препаративные формы, содержащие фармацевтически активный релаксин или фармацевтически эффективный агонист релаксина, могут представлять собой стерильный инъекционный препарат, такой как стерильная инъекционная водная или масляная суспензия. Такую суспензию можно приготавливать согласно известным в данной области методам с использованием пригодных диспергирующих или смачивающих веществ и суспендирующих средств, которые были указаны выше. Стерильный инъекционный препарат может представлять собой также стерильный инъекционный раствор или суспензию в нетоксичном приемлемом для парентерального введения разбавителе или растворителе. К приемлемым наполнителям и растворителям, которые можно применять для этой цели, относятся вода и раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды можно, как правило, применять стерильные нелетучие масла. Для этой цели можно применять любое нераздражающее нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, для приготовления инъекционных препаратов можно использовать жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.

Водные суспензии, предлагаемые в изобретении, содержат релаксин в смеси с эксципиентами, пригодными для приготовления водных суспензий. К таким эксципиентам относятся суспендирующее средство, такое как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и аравийская камедь, и диспергирующие или смачивающие вещества, такие как встречающийся в естественных условиях фосфатид (например, лецитин), продукт конденсации алкиленоксида с жирной кислотой (например, полиоксиэтиленстеарат), продукт конденсации этиленоксида с алифатическим спиртом с длинной цепью (например, гептадекаэтиленоксицетанол), продукт конденсации этиленоксида с частичным эфиром жирной кислоты и гекситола (например, полиоксиэтиленсорбитолмоноолеат) или продукт конденсации этиленоксида с частичным эфиром жирной кислоты и ангидрида гекситола (например, полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат). Водная суспензия может содержать также один или несколько консервантов, таких как этил- или н-пропил-пара-гидроксибензоат, один или несколько красителей, один или несколько корригентов и одно или несколько подслащивающих веществ, таких как сахароза, аспартам или сахарин. Можно осуществлять регулирование осмоляльности препаративных форм.

Масляные суспензии можно приготавливать путем суспендирования релаксина в растительном масла, таком как арахисовое масло, оливковое масло, кунжутное масло или кокосовое масло, или в минеральном масле, таком как вазелиновое масло. Масляные суспензии могут содержать загуститель, такой как пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Для получения имеющего приятный вкус орального препарата можно добавлять подслащивающие вещества. В указанные препараты можно добавлять консерванты, например, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота.

Диспергируемые порошки и гранулы, предлагаемые в изобретении, которые можно применять для приготовления водной суспензии путем добавления воды, можно приготавливать с использованием смеси релаксина с диспергирующими, суспендирующими и/или смачивающими веществами и одним или несколькими консервантами. Примерами пригодных диспергирующих или смачивающих веществ и суспендирующих веществ могут служить указанные выше вещества. Могут присутствовать также дополнительные эксципиенты, например, подслащивающие вещества, корригенты и красители.

Фармацевтические препараты, предлагаемые в изобретении, могут находиться также в форме эмульсий типа масло-в-воде. Масляная фаза может представлять собой растительное масло, такое как оливковое масло или арахисовое масло, минеральное масло, такое как вазелиновое масло, или их смеси. Пригодными эмульгаторами могут служить встречающиеся в естественных условиях камеди, такие как аравийская камедь и трагакантовая камедь, встречающиеся в естественных условиях фосфатиды, такие как лецитин из сои, эфиры или частичные эфиры жирных кислот и ангидридов гекситола, такие как сорбитанмоноолеат, и продукты конденсации указанных частичных эфиров с этиленоксидами, такие как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат.

Введение и схемы дозирования препаративных форм релаксина

Препаративные формы, содержащие фармацевтически активный релаксин или фармацевтически эффективный агонист релаксина, которые применяют в способах, предлагаемых в изобретении, можно вводить любым обычным пригодным путем, включая (но не ограничиваясь только ими) внутривенное, подкожное, внутримышечное, подъязычное, интраназальное, интрацеребральное, интрацеребровентрикулярное введение, местное применение, оральное введение, введение в стекловидное тело или посредством ингаляции. Введение может варьироваться в зависимости от фармакокинетических и других характеристик лекарственных средств и состояния здоровья пациента. Ниже представлены общие руководства.

Способы, предлагаемые в настоящем изобретении, позволяют снижать накопление жидкости, ассоциированное с отеком. Кроме того, способы, предлагаемые в изобретении, позволяют уменьшать хроническую экскрецию разбавленной мочи у пациентов, страдающих нефрогенным несахарным диабетом (ННД). Количество релаксина индивидуально или в комбинации с другим агентом или лекарственным средством, которое достаточно для осуществления этого, рассматривается как терапевтически эффективная доза. График введения доз и их количества, эффективные для указанной цели, т.е. «схема дозирования лекарственного средства», может зависеть от различных факторов, включая стадию заболевания или состояния, серьезность заболевания или состояния, серьезность побочных действий, общее состояние здоровья пациента, физический статус пациента, возраст и т.п. При составлении схемы дозирования для пациента принимают во внимание также путь введения. Схема дозирования должна быть составлена также с учетом фармакокинетических характеристик, а именно, скорости абсорбции, биологической доступности, метаболизма, клиренса и т.п. На основе указанных принципов релаксин можно применять для лечения отека и/или ННД у индивидуумов, пораженных указанными нарушениями.

В изобретении предложено также применение релаксина для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения отека и/или ННД, где лекарственное средство приготавливают специально для лечения пораженных заболеванием индивидуумов. Кроме того, предложено применение релаксина для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения отека и/или ННД, в том случае, когда пациент уже подвергался ранее (например, несколько часов назад, один или несколько дней назад и т.д.) лечению другим лекарственным средством. В одном из вариантов осуществления изобретения другое лекарственное средство в этом случае все еще сохраняет активность в организме пациента (in vivo). В другом варианте осуществления изобретения другое лекарственное средство в этом случае уже не обладает активностью в организме пациента (in vivo).

Сведения, известные из существующего уровня техники, позволяют практикующему врачу определять схему дозирования лекарственного средства для каждого индивидуального пациента. В качестве репрезентативного примера ниже представлены общие руководства для определения схемы дозирования лекарственного средства, т.е. графика введения доз и уровней доз препаратов, содержащих фармацевтически активный релаксин, предназначенных для введения при осуществлении на практике способов, предлагаемых в настоящем изобретении. В качестве общего руководства можно считать, что суточная доза фармацевтически активного человеческого релаксина H1, Н2 и/или Н3 (например, синтетического, рекомбинантного, аналога, агониста и т.д.), как правило, составляет примерно от 1 до 1000 мкг/кг веса тела индивидуума в день. В одном из вариантов осуществления изобретения дозы релаксина составляют 10, 30, 100 и 250 мкг/кг/день. В другом варианте осуществления изобретения указанные дозы обеспечивают концентрации релаксина в сыворотке, составляющие примерно 1, 3, 10, 30, 75 или 100 нг/мл. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения фармацевтически эффективный релаксин или его агонист вводят в дозе, составляющей примерно 30 мкг/кг/день. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтически эффективный релаксин или его агонист вводят в дозе от примерно 10 до примерно 250 мкг/кг/день. В другом варианте осуществления изобретения релаксин продолжают вводить таким образом, чтобы поддерживать концентрацию релаксина в сыворотке на уровне, составляющем от примерно 0,5 до примерно 500 нг/мл, более предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 300 нг/мл, и наиболее предпочтительно от примерно 1 до примерно 10 нг/мл. Наиболее предпочтительно введение релаксина продолжают таким образом, чтобы поддерживать концентрацию релаксина в сыворотке на уровне 10 нг/мл или выше. Таким образом, способы, предлагаемые в настоящем изобретении, предусматривают такие варианты введения, которые обеспечивают указанные концентрации релаксина в сыворотке. Эти концентрации релаксина позволяют ослаблять или снижать накопление жидкости, с которым ассоциирован отек, включая (но не ограничиваясь только ими) церебральный отек, отек глаза, отек легких, асциты, наследственный ангионевротический отек, периферический отек и системный отек. Кроме того, указанные концентрации релаксина позволяют ослаблять или снижать хроническую экскрецию разбавленной мочи при ННД. В зависимости от индивидуума, введение релаксина продолжают либо в течение определенного периода времени, либо в течение того времени, которое требуется для достижения стабильного состояния индивидуума. Например, продолжительность лечения релаксином предпочтительно составляет от примерно 4 до примерно 96 ч, более предпочтительно от 8 до примерно 72 ч, в зависимости от пациента, и при необходимости необязательно осуществляют один или несколько повторных курсов лечения.

В зависимости от требуемой и переносимой страдающим отеком и/или ННД пациентом дозы и частоты введения можно осуществлять однократное или многократное введение препаративных форм релаксина. Препаративные формы должны содержать релаксин в количестве, достаточном для эффективного облегчения состояния. Как правило, фармацевтическая препаративная форма, предназначенная для внутривенного или подкожного введения релаксина, должна зависеть от конкретной терапии. Например, релаксин можно вводить пациенту в режиме монотерапии (т.е. без других совместно применяемых лекарственных средств) или в режиме комбинированной терапии в сочетании с другим лекарственным средством. В одном из вариантов осуществления изобретения релаксин вводят пациенту ежедневно в режиме монотерапии. В другом варианте осуществления изобретения релаксин вводят пациенту ежедневно в режиме комбинированной терапии в сочетании с другим лекарственным средством. Следует иметь в виду, что дозы и частота введения релаксина пациенту могут варьироваться в зависимости от возраста, серьезности заболевания, переносимости лекарственного средства и совместно применяемых лекарственных средств, а также от состояний.

В некоторых вариантах осуществления изобретения релаксин приготавливают в форме раствора с концентрацией 1 мг/мл (3,5 мл в стеклянном пузырьках вместимостью 5 мл). Плацебо, представляющее собой вещество, идентичное разбавителю для релаксина, приготавливают в идентичных пузырьках. Релаксин или плацебо можно вводить пациенту внутривенно или подкожно в небольших объемах с использованием шприцевого насоса в комбинации с обычным физиологическим раствором, вводимым с использованием конфигурации «piggyback». Для введения препаративной формы релаксина используют совместимые трубки и трехходовой запорный кран, протестированные и сертифицированные для применения с использованием релаксина. Введение доз, которые рассчитывают с учетом веса пациента и регулируют для каждого индивидуального пациента посредством регулирования скорости введения лекарственного средства, осуществляют, например, с помощью инфузионного насоса.

Примеры

Представленные ниже конкретные примеры предназначены для иллюстрации изобретения и не направлены на ограничение его объема, определяемого формулой изобретения.

Пример 1

Релаксин модулирует уровни аквапорина-3 и аквапорина-5 в шейке матки

Релаксин повышает содержание воды в шейке матки и рассасывание коллагеновых волокон посредством регулирования уровней аквапоринов (AQP). Установлено, что уровень экспрессии гена aqp3 значительно снижался в шейке матки мышей с «выключенным» геном релаксина (Rln^-/-) в конце периода беременности (фиг.1). Установлено, что белок AQP3 был локализован в базолатеральном эпителии шейки матки мышей и выявлено снижение уровня иммунореактивного AQP3 в рассматриваемой области у Rln^-/--мышей (фиг.2). Во втором исследовании беременных Rln^-/--мышей обрабатывали релаксином. Это приводило к значительному повышению уровня экспрессии aqp3 и снижению уровня экспрессии aqp5 в шейке матки по сравнению с обработанными плацебо контролями (фиг.3). У беременных Rln^-/--мышей, обработанных релаксином, был выявлен более высокий уровень иммунореактивного AQP3 в базолатеральном эпителии и меньший уровень иммунореактивного AQP5 в апикальных слоях эпителия по сравнению с обработанными плацебо контролями (фиг.4). Кроме того, обработка релаксином приводила к значительному увеличению влажной массы шейки матки и рассасывания коллагена в стромальном ЕСМ. Эти данные свидетельствуют о том, что релаксин модулирует экспрессию генов и белков аквапоринов и обладает способностью модулировать водный баланс в репродуктивных тканях.

Таблица 1 Экспрессия гена и белка Обработка релаксином Обработка физиологическим раствором Функциональная роль aqp3 и AQP3 повышает не оказывает влияния способствует оттоку воды из эпителиальных
клеток шейки матки в строму aqp5 и AQP5 снижает не оказывает влияния Способствует притоку воды из
полости в эпителиальные клетки шейки матки

Более конкретно, установлено, что у мышей с «выключенным» геном релаксина имели место более высокие плотности коллагена в шейке матки, но это не было обусловлено снижением уровня матричных металлопротеиназ (ММР). Поэтому авторы изобретения выдвинули предположение о наличии альтернативного механизма действия релаксина, обеспечивающего поступление воды в строму шейки матки, которое повышает гидратацию шейки матки и рассасывание коллагеновых волокон. В указанном выше исследовании была проверена гипотеза о том, что релаксин регулирует аквапорины (AQP). Более конкретно, метод заключался в следующем: изымали шейки матки из мышей с геном релаксина дикого типа и с «выключенным» геном релаксина в моменты времени, соответствующие 14,5, 16,5, 18,5 и 19 дню их беременности (рс), и в день 1 после родов для сравнения уровней экспрессии генов aqpl и aqp5, которые определяли путем анализа методом количественной ПЦР, и уровней экспрессии белков, которые оценивали иммуногистохимическим методом, у особей указанных генотипов. Во втором исследовании, указанном выше, мышам с «выключенным» геном релаксина имплантировали в день 12,5 рс осмотический мининасос фирмы Alzet для осуществления инфузии либо рекомбинантного человеческого релаксина Н2 (0,05 мкг/ч; фирма Corthera, Inc), либо 0,9%-ного физиологического раствора. После осуществления инфузии в течение 4 или 6 дней изымали шейки матки. Было установлено, что обработка релаксином значительно повышала уровень экспрессии гена aqp3 и снижала уровень экспрессии гена aqp5 в шейке матки по сравнению с обработанными плацебо контролями. Кроме того, обработка релаксином приводила к 6-кратному увеличению влажной массы шейки матки и к снижению уровня экспрессии рецептора релаксина RXFP1. Эти новые данные позволяют предположить, что релаксин осуществляет повышающую регуляцию AQP3 в базолатеральной области эпителия, поддерживая приток воды в строму из полости (фиг.4). Релаксин может осуществлять также понижающую регуляцию AQP5, предупреждая потерю воды, вызываемую ее оттоком из апикальной области в полость (фиг.4). Эти данные позволяют предположить, что релаксин усиливает гидратацию шейки матки посредством модулирования AQP. Это может способствовать созреванию шейки матки благодаря рассасыванию коллагеновых волокон в ЕСМ.

Пример 2

Релаксин модулирует уровни аквапорина-2 и аквапорина-4 в почке

Известно, что мыши с дефицитом гена релаксина характеризуются аномально высокой осмоляльностью плазмы, которая представляет собой меру концентрации электролитов, мочевины и других ионов в крови. Наличие высокой осмоляльности плазмы у этих животных позволяет предположить, что у них могут быть нарушены механизмы концентрирования мочи в почечном протоке. Однако, после обработки животных релаксином наблюдалась реверсия и снижение осмоляльности плазмы. Авторы изобретения выдвинули предположение о том, что релаксин изменяет центр («распознавания») жажды в головном мозге, стимулируя высвобождение вазопрессина (AVP), который воздействует на его V2-рецепторы в собирающем протоке, в результате чего повышается проницаемость для воды, обеспечиваемая AQP2. При создании изобретения было установлено, что рецептор релаксина RXFP1 действительно экспрессируется в почках мышей и крыс (фиг.7). Эта экспрессия RXFP1 была выявлена в областях почек, ответственных за проницаемость для воды, а именно, в сосочках у мышей и во внутреннем мозговом слое у крыс (фиг.7). Полученные данные позволяют сделать предположение о том, что релаксин может действовать независимо от AVP и оказывает непосредственное осморегулирующее действие на саму почку. Другая возможность заключается в том, что релаксин может обладать синергетическим действием с AVP, повышая его способность сохранять воду.

Таблица 2 Экспрессия гена Обработка релаксином Обработка физиологическим раствором Функциональная роль aqp2 повышает не оказывает влияния способствует перемещению воды из фильтрата
почечного канальца в клетки собирающего протока aqp4 повышает не оказывает влияния способствует перемещению воды из клеток собирающего протока в кровь,
снижая осмоляльность плазмы

Обработка релаксином мышей и крыс повышала экспрессию AQP2 в почке (фиг.8). На фиг.8А проиллюстрировано повышение уровня экспрессии гена aqp1 в почке самцов Rln^+/+-мышей, которых обрабатывали релаксином в течение 14 дней, по сравнению с обработанными физиологическим раствором (VEH) контрольными животными, в этом случае применяемый в качестве стандарта контроль представлял собой β-актин. На фиг.8Б проиллюстрировано повышение уровня экспрессии гена aqp2 у самцов Rln^-/--мышей, которых обрабатывали релаксином в течение пяти дней. Эти данные демонстрируют наличие регулирующей связи между релаксином и аквапоринами в почке. С учетом полученных результатов авторы изобретения выдвинули предположение о том, что сохраняющие воду механизмы в почке могут быть основаны на непосредственном модулирующем воздействии релаксина на аквапорины (AQP), а также на опосредованном воздействии, обусловленном высвобождением AVP из головного мозга.

Обработка крыс релаксином в течение пяти дней приводила к повышению уровня экспрессии гена aqp2 в области мозгового слоя (которая включает сосочки) почки самцов крысы (фиг.8В). Эти данные подтверждают гипотезу о том, что действие релаксина в почке может приводить к повышению уровня экспрессии AQP2 и регулировать перемещение молекул воды из фильтрата почечного канальца назад в кровь млекопитающих.

Обработка моноклональным антителом к крысиному релаксину (МСА1) беременных крыс снижала экспрессию гена aqp2 в области мозгового слоя почки (фиг.9). Эти данные подтверждают предположение о том, что эндогенный релаксин играет роль в регулировании аквапоринов в почке. На основании полученных результатов авторы изобретения выдвинули предположение о том, что связанные с беременностью механизмы сохранения воды в почке могут базироваться на непосредственном модулирующем действии релаксина на аквапорины.

Релаксин повышает уровень AQP4 в почке. При создании изобретения впервые было установлено, что уровень экспрессии гена aqp4 существенно снижен в области сосочков почки у Rln^-/--мышей, что проиллюстрировано на фиг.10А. На фиг.10Б и фиг.10В продемонстрировано, что обработка релаксином в течение пяти дней или 14 дней самцов Rln^-/--мышей приводила к повышению уровня экспрессии гена aqp4 в сосочках. Эти результаты подтверждают новую гипотезу о том, что действие релаксина в почке приводит к повышению уровня экспрессии AQP4 и регулирует перемещение молекул воды из фильтрата почечного канальца назад в кровь млекопитающих.

Обработка релаксином в течение пяти дней самцов крыс повышала уровень экспрессии гена aqp4 в области мозгового слоя (которая включает сосочки) почки (фиг.11). Эти результаты подтверждают новую гипотезу о том, что действие релаксина в почке приводит к повышению уровня экспрессии AQP4 у различных видов млекопитающих.

Пример 3

Действие релаксина на клетки собирающего протока в почке

Механизмы сохранения воды в почке могут базироваться на опосредуемом релаксином взаимодействии с аквапоринами (AQP), а также с AVP. Оценку вклада релаксина по сравнению с AVP в регулирование функции AQP2 в почечном собирающем протоке можно проводить на модели с использованием крыс линии Браттлеборо (Brattleboro) с дефицитом AVP.

При использовании этой модели ежедневно осуществляли регистрацию веса тела, поглощение воды и корма, выделение фекалий и мочи. Осуществляли анализ мочи на электролиты и мочевину с помощью спектрофотометрии (устройство Synchron СХ5СЕ Delta; фирма Beckman Coulter). Осмоляльность измеряли по понижению (депрессии) точки замерзания (с помощью осмометра).

Для проведения анализа уровней гена и белка расчленяли девять пар почек, выделяя корковый и внутренний мозговой слой. Три пары почек разрезали пополам и фиксировали в PLP (параформальдегид / лизин / перйодат) для заливки полиэфирным воском с целью проведения иммуногистохимического анализа. Для оценки экспрессии гена применяли количественную ПЦР (q-ПЦР) и проводили сравнение результатов, полученных для различных областей почки и двух видов мышей. Уровень экспрессии белка оценивали с помощью анализа методом Вестерн-блоттинга и иммуногистохимического анализа. Осмоляльность плазмы и концентрации AVP измеряли с помощью осмометра и РИА соответственно.

Предполагается, что релаксин повышает проницаемость собирающего протока для воды и это дает возможность крысам концентрировать мочу и тем самым снижать излишнюю потерю воды. Сделанное при создании изобретения открытие того факта, что обработка релаксином повышает уровень экспрессии AQP2 в почке (см. выше), позволяет предположить, что аномально высокая осмоляльность плазмы у животных с дефицитом гена релаксина может быть связана с нарушениями экспрессии AQP2 или транслокации несущих AQP2 везикул в собирающем протоке.

Клетки собирающего протока внутреннего мозгового слоя (IMCD) могут служить моделью для демонстрации роли релаксина в AVP-независимом модулировании AQP2. IMCD-клетки высевали на покрытые коллагеном типа IV чашки Петри, содержащие среду DMEM/F12, дополненную 10% БСА. Клетки выращивали в течение четырех дней до достижения конфлюентности и проводили обработку в день 5 после посева. Для измерения уровней цАМФ и РКА-активности в ответ на обработку релаксином IMCD-клетки инкубировали в течение 45 мин в среде, содержащей человеческий релаксин Н2 (концентрации 0,1пМ-1 мкМ). Клетки, предназначенные для ингибирования РКА, предварительно инкубировали с 10мкМ Н-89 (ингибитор РКА) в течение 60 мин перед осуществлением инкубации с релаксином Н2. Известно, что Н-89 в указанной концентрации ингибирует фосфорилирование AQP2 в IMCD-клетках. После обработки клетки быстро замораживали в буфере для лизиса. Содержание цАМФ и РКА-активность измеряли с использованием поступающих в продажу наборов (фирма Cayman Chemical, США). Для измерения уровней экспрессии генов Rxfp1 и aqp2 в IMCD-клетках можно применять стандартные подходы молекулярной биологии. Для выявления внутриклеточной локализации AQP2 после осуществления обработки IMCD-клетки фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) и затем инкубировали с антителом к AQP2 и вторичным антителом, представлявшим собой козье антитело к кроличьему IgG, меченное с помощью Alexa Fluor 488, с целью визуализации белка AQP2. Каждый эксперимента повторяли трижды в трех повторностях для каждого индивидуального образца (n=9). Транслокацию содержащих AQP2 везикул к месту их действия в апикальной клеточной мембране можно обнаруживать по более высокому уровню флуоресценции в периферической области клетки.

Пример 4

Релаксин, вазопрессин и регулирование АОР2 в почке

Релаксин может оказывать свое действие на почку независимо от вазопрессина, регулируя AQP2 и производство концентрированной мочи. Описание методов и процедуры анализа приведено в примере 2 (выше). Гомозиготные (di/di) крысы линии Браттлеборо характеризуются серьезным нефрогенным несахарным диабетом (ННД), обусловленным неспособностью продуцировать A VP. Они экскретируют в больших количествах разбавленную мочу и вынуждены много пить для возмещения потери воды. Поскольку у них отсутствует AVP, то уровень AQP2 в собирающем протоке значительно снижен. Обработка указанных животных AVP приводила к тому, что они приобретали способность концентрировать мочу благодаря увеличению транслокации AQP2 в апикальную мембрану. Однако на основе имеющихся в литературе данных можно предположить, что крысы линии Браттлеборо могут концентрировать свою мочу без участия AVP, прежде всего после выдерживания в условиях голодания (без корма). Если релаксин может регулировать AQP2 независимо от AVP, то можно ожидать, что обработка релаксином крыс линии Браттлеборо будет приводить к повышению уровня экспрессии AQP2 и может давать им возможность концентрировать свою мочу. Для проверки этой гипотезы при создании изобретения применяли протокол эксперимента, проиллюстрированный на фиг.5, на котором указан период, в течение которого осуществляли инфузию релаксина и контроля (физиологический раствор). Более конкретно, крысам линии Браттлеборо (6 самок и 6 самцов возрастом 3-4 месяца) давали адаптироваться к приспособленным для крыс метаболическим клеткам в течение двух 24-часовых периодов времени, в течение которых им давали корм и воду. Животным имплантировали осмотические мининасосы фирмы Alzet для введения либо человеческого релаксина Н2, либо физиологического раствора со скоростью 4 мкг/ч в течение 72 ч. Указанная скорость инфузии обеспечивала повышение GFR и ERPF и снижение осмоляльности плазмы у крыс линии Лонг-Эванс (Long-Evans). В этом опыте контрольными животными служили крысы линии Лонг-Эванс такого же возраста. В моменты времени, указанные на фиг.5, осуществляли измерения веса тела, потребления корма и воды, выделения фекалий и мочи. Образцы мочи анализировали на содержание электролитов и мочевины с помощью спектрофотометрии. Осмоляльность измеряли на основе понижения точки замерзания. Снижение выделения мочи и осмоляльности плазмы в ответ на обработку релаксином должно свидетельствовать об улучшении механизмов концентрирования мочи в почке. Повышение уровня экспрессии AQP2 позволяет сделать предположение о том, что действие релаксина на аквапорины является независимым от вазопрессина.

Пример 5

Релаксин уменьшает церебральный отек у мышей

Вазогенный отек головного мозга имеет место в том случае, когда происходит нарушение плотных стыков сосудистых эндотелиальных клеток, обеспечивающих гематоэнцефалический барьер. Это приводит к поступлению в больших количествах белков плазмы и жидкости во внеклеточные пространства нервных тканей и избыточному накоплению воды в головном мозге. Опосредуемое AQP4 трансклеточное перемещение воды имеет решающее значение для клиренса жидкости при вазогенном отеке головного мозга (Papadopoulos и др., FASEB Journal 18, 2004, cc. 1291-1293). Следовательно усиление повышающей регуляции AQP4 в головном мозге может представлять собой новый терапевтический подход для лечения вазогенного отека головного мозга. На основе полученных данных о повышении уровня экспрессии AQP4 в почке обработанных релаксином млекопитающих (см. пример 2, выше) авторы настоящего изобретения выдвинули предположение о том, что обработка релаксином может приводить также к повышению уровня экспрессии AQP4 в головном мозге. Для проверки этой гипотезы самцам крыс имплантировали осмотические мининасосы фирмы Alzet и канюлю для инфузии в головной мозг для введения 50-500 нг человеческого релаксина Н2 или физиологического раствора в течение 24 или 72 ч. Указанные дозы релаксина и выбранная скорость инфузии приводили к повышению желания пить и уровня вазопрессина в плазме крыс. Выделяли ткани головного мозга из коры головного мозга, ствола головного мозга и мозжечка и анализировали уровни экспрессии гена и белка AQP4 с помощью количественной ПЦР, иммуногистохимии и анализа методом Вестерн-блоттинга.

Обработка релаксином мышей и крыс приводила к повышению уровня экспрессии AQP4 в области мозгового слоя (которая включает сосочки) почки (фиг.10 и фиг.11). Поэтому авторы настоящего изобретения сделали предположение о том, что действие релаксина в головном мозге может приводить к повышению уровня экспрессии AQP4 и благодаря этому уменьшать церебральный отек. У мышей с дефицитом AQP4 (Aqp4^-/-), имело место уменьшение опухания головного мозга после водной интоксикации и очаговой церебральной ишемии по сравнению с мышами дикого типа (Manley и др., Nature Medicine 6, 2000, сс.159-163). Если релаксин осуществляет повышающую регуляцию AQP4 таким же образом, как это продемонстрировано на почках, то можно предсказать, что обработка релаксином в случае вазогенного отека, смоделированного на животных, должна приводить к повышению уровня экспрессии AQP4 в головном мозге и ускоренной элиминации вызывающей отек жидкости из паренхимы головного мозга (Papadopoulos и др. (выше)). Для проверки этой гипотезы при создании изобретения осуществляли инфузию изотонической жидкости в паренхиму головного мозга с целью вызывания вазогенного отека. Более конкретно, подвергнутых анестезии крыс фиксировали в стереотаксическом каркасе и вводили в паренхиму головного мозга микроиглу из боросиликатного стекла (диаметр кончика ~100 мкм), присоединенную к газонепроницаемому шприцу объемом 250 мкл. Осуществляли инфузию изотонической жидкости, содержащей 0,9% физиологического раствора или релаксин, со скоростью 0,5 мкл/мин в течение 1-6 ч. YAqp4^-/--мышей было выявлено значительное увеличение содержания воды в паренхиме головного мозга в течение 1 ч (Papadopoulos и др., (выше)). По окончании периода инфузии крыс умерщвляли и изымали головной мозг для анализа содержания воды и уровня экспрессии AQP4 в коре головного мозга, стволе головного мозга и мозжечке. Было установлено, что релаксин приводил к повышению уровня экспрессии AQP4 у обработанных крыс, по-видимому, он также предупреждал накопление воды в паренхиме и уменьшал вазогенный отек.

Специалистам в данной области должны быть очевидны модификации и варианты настоящего изобретения, которые можно осуществлять без отклонения от объема и сущности изобретения. Хотя изобретение было описано со ссылкой на конкретные предпочтительные варианты осуществления изобретения, следует понимать, что объем формулы изобретения не ограничен указанными конкретными вариантами осуществления изобретения. Фактически предполагается, что различные модификации описанных вариантов осуществления изобретения, очевидные специалистам в данной области, подпадают под объем формулы изобретения.

Группа изобретений относится к медицине и касается применения фармацевтически активного релаксина Н2 для получения лекарственного средства для лечения нефрогенного несахарного диабета у субъекта, нуждающегося в этом. Группа изобретений также касается применения фармацевтически активного релаксина Н2 для лечения нефрогенного несахарного диабета у субъекта, нуждающегося в этом. Группа изобретений обеспечивает ослабление или снижение избыточного производства разбавленной мочи и сопровождающих осложнений, ассоциированных с нефрогенным несахарным диабетом. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 5 пр., 11 ил., 2 табл.

1. Применение фармацевтически активного релаксина Н2 для получения лекарственного средства для лечения нефрогенного несахарного диабета у субъекта, нуждающегося в этом.

2. Применение фармацевтически активного релаксина Н2 для лечения нефрогенного несахарного диабета у субъекта, нуждающегося в этом.

3. Применение по п. 2, где релаксин Н2 вводят субъекту-человеку в количестве, эффективном для снижения хронической экскреции разбавленной мочи у субъекта-человека.

4. Применение по п. 2 или 3, где введение релаксина Н2 приводит к снижению частоты мочеиспускания, уменьшению 24-часового объема мочи, снижению осмоляльности мочи при последующем измерении и/или ослаблению интенсивной жажды у пациента.

5. Применение по п. 2 или 3, где указанный релаксин Н2 вводят для поддержания его концентрации в сыворотке от 1 до 100 нг/мл у субъекта-человека.

6. Применение по п. 2 или 3, где релаксин Н2 вводят для поддержания его концентрации в сыворотке 10 нг/мл у субъекта-человека.

7. Применение по п. 2 или 3, где релаксин Н2 вводят путем подкожной инфузии со скоростью, составляющей от 3 до 150 мкг/кг/день.

8. Применение по п. 2 или 3, где релаксин Н2 вводят путем подкожной инфузии со скоростью, составляющей примерно 30 мкг/кг/день.

9. Применение по п. 2 или 3, где релаксин Н2 можно вводить в течение длительного времени посредством прерывистого введения путем подкожной инъекции или с помощью насоса.

10. Применение по п. 2 или 3, где релаксин Н2 можно вводить непрерывно в течение по меньшей мере 24 ч.

11. Применение по п. 10, где снижение экскреции разбавленной мочи, ассоциированной с ННД, может быть измерено в течение примерно 24 ч после начала лечения релаксином Н2 по сравнению с результатами обработки с использованием плацебо.

12. Применение по п. 10, где снижение экскреции разбавленной мочи, ассоциированной с ННД, может быть измерено у субъекта-человека в период времени, составляющий от 4 до 6 ч, после начала лечения релаксином Н2 по сравнению с результатами обработки с использованием плацебо.

13. Применение по п. 2, где релаксин Н2 вводят субъекту-человеку в количестве, эффективном для модификации экспрессии аквапорина и его клеточной локализации в ткани почек у субъекта-человека.

14. Применение по п. 13, где аквапорин представляет собой аквапорин-2 (AQP2), аквапорин-3 (AQP3) и/или аквапорин-4 (AQP4).