СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2002 года по МПК C08B37/08 C12S3/02 

Изобретение относится к птицеперерабатывающей и химико-фармацевтической промышленности и касается способов получения препаратов гиалуроновой кислоты (ГК), которые вырабатывают из вторичного сырья птицеперерабатывающей промышленности и применяют в различных областях медицины, в том числе в дерматологии, гинекологии, офтальмологии, в косметической практике и в ветеринарии.

Известен способ получения ГК, согласно которому ее получают из измельченных петушиных гребней экстракцией раствором гидрохлорида натрия с последующей нейтрализацией раствором трихлоруксусной кислоты, вакуумной фильтрацией, стерилизацией фильтрата при 70^oС в течение 30 мин и выпариванием в среде Р₂О₅ [Игнатова Е.Ю., Гуров А.И. Принципы извлечения и очистки гиалуроновой кислоты // Хим-фарм. Журнал. - 1990. - 3. - С. 42-46].

К недостаткам способа следует отнести и малую степень очистки препарата от белков и нуклеиновых кислот, недостаточно высокие органолептические показатели, а также выход полимера.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения гиалуроновой кислоты, предусматривающий обескровливание сырья этиловым спиртом в соотношении 1:2, измельчение до 2-3 мм сырья и обработку ультразвуком с частотой 16-20 кГц в течение 10 мин с последующей экстракцией водой с температурой 45-50^oС в течение 20-25 мин, при этом отделение водной фракции осуществляется вакуумным фильтрованием, после чего проводится осаждение этиловым спиртом в соотношении 1:3, фильтрование и вакуумная или сублимационная сушка препарата. [Патент РФ 2114802. Способ получения гиалуроновой кислоты/ Л.В. Антипова, С.В.Полянских, М.П.Алексюк (РФ). - Приоритет от 31.05.96].

Недостатком описанного способа является недостаточный выход и чистота целевого продукта, а также высокая энергоемкость процесса за счет применения ультразвуковой установки.

Технической задачей изобретения является увеличение выхода и степени чистоты препарата ГК, снижение уровня токсичности, энергоемкости и повышение безопасности производства.

Поставленная задача достигается тем, что в способе получения гиалуроновой кислоты, включающем обескровливание сырья этиловым спиртом в соотношении 1: 2, измельчение, водную экстракцию, отделение водной фракции, осаждение целевого продукта этиловым спиртом в соотношении 1:3 с последующим фильтрованием и сушкой продукта, новым является то, что проводят обработку сырья на стадии водной экстракции продукта раствором ферментного препарата коллагеназы с содержанием 0,035-0,040% к массе сырья в течение 45-50 мин при температуре 45-50^oС и рН 6,8-7,0.

Технический результат выражается не только в достижении поставленной задачи, но и в увеличении степени извлечения ГК, повышении качества целевого продукта, повышении экологичности производства, разработке и внедрении комплексной технологии.

ГК - типичный мукополисахарид. Важным структурным признаком его является наличие чередующихся остатков аминосахаров и остатков уроновых кислот.

В тканях и жидкостях ГК существует в свободном состоянии или ассоциирована с белками, образуя вязкие растворы.

Биополимер входит в состав основного вещества многих видов соединительной ткани до 5% к массе (петушиные гребни, стекловидное тело глаза, синовиальная жидкость, кожа). В тканях петушиного гребня ГК распределена в мукоидных волокнах подкожного слоя, наиболее широкого у основания, где ее массовая доля - до 7500 мкг/мг.

Гиалуроновая кислота - белое, твердое аморфное вещество, растворимое в воде и нерастворимое в органических растворителях. Характерным ее свойством является высокая вязкость. Молекулярная масса составляет от 5•10⁴-8•10⁶, что зависит от происхождения препарата, способа и метода определения.

По своей конформации молекулы ГК представляют собой беспорядочно свернутые клубочки. Применение кислотного гидролиза, метилирования, использование нескольких видов ферментативного гидролиза гиалуронидазами различного происхождения и ряда других методов позволило предложить для ГК формулу, в которой чередуются остатки глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина. Эти дисахаридные фрагменты связаны в молекулы гиалуроновой кислоты - 1,4 - связями (см. формулу 1, приведенную в конце описания).

Биологическое значение ГК состоит прежде всего в том, что она является цементирующим, как бы склеивающим веществом соединительно-тканных систем организма. Она является основой функционирования муколитической системы, определяющей, в частности, проницаемость тканей и сосудов. Вследствие высокого значения молекулярной массы кислота выполняет роль структурообразователя, "связывателя" воды в промежуточных полостях, гелеобразных матрицах, что определяет тургор тканей и повышает их сопротивление действию сжимающих нагрузок. Способствует стойкости организма к проникновению инфекции.

Антифрикционные и демпферные свойства тканевых жидкостей, в частности синовиальной, определяются наличием в них биополимера.

Биологические свойства кислоты определили широкое ее использование при изготовлении лекарственных, фармацевтических препаратов и косметических изделий. Например, обоснована целесообразность использования ГК как заменителя стекловидного тела. Использование ее растворов в качестве операционной среды, предохраняющей внутренние ткани глаза от механических воздействий, резко повышает эффективность операций на глазе человека. На основе ГК создаются вязкоэластические материалы.

Кроме офтальмологии кислота используется в ревматологии (для замещения синовиальной жидкости), при лечении артрозов, в артопластике и остеомии для защиты хрящевых поверхностей и периферийного нерва, в дерматологии - для защиты кожных ран при экземах и трофических расстройствах кожи; в производстве косметических препаратов (гели, кремы, лосьоны).

При определении общего химического состава коллагенсодержащего сырья пользовались методиками определения: массовой доли влаги [ГОСТ 9793-74. Продукты мясные. Методы определения влаги.]; жира - методом Сокслета [Журавская И. К. и др. Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов, 1985]; белка [Журавская И.К. и др. Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов, 1985] . Фракционный состав белков определяли последовательным экстрагированием водо-, соле- и щелочерастворимых белковых фракций соответственно дистиллированной водой, раствором хлористого калия с массовой долей 5% и раствором гидроксида натрия с массовой долей 10% с последующим количественным определением белка с биуретовым реактивом, определение протеолитиче-ской активности проводили в соответствии с [ГОСТ 20264.2-88. Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности].

В качестве объекта для получения ГК используют петушиные гребни. Сравнительный анализ химического состава гребня по отношению к другим коллагенсодержащим продуктам убоя птицы показал преобладание в нем массовой доли белка (19,8% к массе сырья) при массовом превалировании протеиноидной фракции (14,4% к массе сырья).

Высокая доля коллагеновых волокон в структуре ткани с низкой массовой долей жиров подтверждает целесообразность получения интересующего биополимера с применением методов биотехнологии.

Для разрушения упроченных белковых структур соединительной ткани гребня целесообразно применение ферментных препаратов, комплексы которых характеризуются высокими уровнями протеолитической и коллагеназной активностями.

Требования к ферментным системам для направленной модификации химического состава и биотрансформации структурно-механических свойств коллагенсодержащего сырья птицеперерабатывающей промышленности обусловлены преобладанием различных фракций белков в составе сырья и связаны прежде всего высокой субстратной специфичностью к гидролизу белковых фракций, максимумом активности в нейтральной зоне рН и умеренном интервале температур.

Ассортимент протеиназ составлен из промышленных ферментных препаратов животного и микробного происхождения.

Первоначальный отбор ферментных препаратов осуществляли путем оценки уровня общего и специфического протеолиза на соответствующих белковых субстратах в нейтральной зоне рН.

Требованиям удовлетворяют ферментные препараты протосубтилин Г20х, мегатерии, коллагеназа, обладающие требуемой специфичностью и высокими уровнями специфической активности.

Протосубтилин Г20х (СТП 100-02-88, введ. 23.03.88) и мегатерин (ТУоп 00479942-002-94, введ. 01.01.94) выпускаются в промышленном масштабе Вышневолоцким заводом ферментных препаратов (пос. Зеленогорский Тверской области).

Коллагеназа получена экстракцией из печени дальневосточного краба и произведена на АО "Биопрогресс" г. Щелково.

Результаты исследований показали, что максимальной протеолитической активностью обладает фермент коллагеназа (252,9 ед/г), обладающий еще и специфическим действием на коллаген, что положительно влияет на увеличение выхода целевого продукта.

В то же время следует подчеркнуть, что головы птицы с гребнем находят очень ограниченное применение на пищевые цели, а отдельный гребень не используется как исходное сырье совсем. Его выход составляет 1,5-2,0% к массе тушки. Таким образом, птицеперерабатывающая промышленность имеет реальные и достаточные резервы в получении важнейшего биополимера за счет увеличения доли полезного использования вторичных малоценных продуктов.

Необходимым условием при производстве гиалуроновой кислоты является, прежде всего, возможность выделения ее в нативном высокополимеризованном состоянии в виде высоко очищенных препаратов, свободных от белка.

Способ получения ГК осуществляется следующим образом.

Свежие петушиные гребни подвергают предварительной обработке промывкой проточной водопроводной водой с последующим обескровливанием этиловым спиртом в соотношении 1:2. Отмытые от крови во избежание окислительной деструкции ткани могут быть "законсервированы" на длительное (до 24 мес.) время при температуре 4-22^oС в 95%-ном этаноле.

Для дальнейшей обработки гребни измельчают на гомогенизаторе (дезинтеграторе, шаровой мельнице). С целью отделения белка и высвобождения кислоты из ее комплексов с белками и другими мукополисахаридами подготовленные гребни подвергают водной экстракции с обработкой раствором коллагеназы с содержанием от 0,035 до 0,050% к массе сырья при температуре 45-50^oС, рН 6,8-7,0 и продолжительности 45-50 мин.

Водный раствор ГК отделяли от остатка ткани путем вакуумного фильтрования. Из отфильтрованных растворов ГК осаждали 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1: 3 и снова фильтровали. С целью увеличения продолжительности сроков хранения и удобства применения ГК подвергают вакуумной или сублимационной сушке. Далее в зависимости от назначения ГК хранят в высушенном виде при температуре - 18^oС или растворяют в физиологическом буферном растворе и упаковывают в удобную тару, например в шприцы.

Полученный таким способом биопрепарат представляет собой сплетение тончайших нитей большой жесткости. Он легко растворим в воде, давая совершенно прозрачные неопалесцирующие растворы.

Применение ферментов позволяет повысить степень высвобождения ГК из комплексов с белками и мукополисахаридами, что положительно сказывается на выходе и чистоте готового продукта.

Для каждого фермента характерна определенная область оптимальных значений рН, при которых его активность максимальна. На фиг.1 приведена зависимость активности коллагеназы от изменения рН среды.

Для коллагеназы оптимум рН равен 7. При смещении рН в область щелочных или кислых значений протеолитическая активность резко снижается, что отрицательно сказывается на степени гидролиза и выходе препарата ГК.

Активность фермента зависит от температуры, эта зависимость приведена на фиг.2. В данном случае активность фермента до температуры в 37^oС повышается, что обусловлено повышением скорости теплового движения молекул. Затем начинает снижаться и при 60^oС достигает минимума, что происходит вследствие денатурационных и коагуляционных изменений в структуре фермента. Экстракцию целесообразно проводить при температуре 45-50^oС, причем при 45^oС активность фермента достаточно высока, то есть оптимальной температурой водной экстракции, совмещенной с ферментативной обработкой, является температура 45^oС.

При температуре, меньшей 45^oС, активность фермента больше, следовательно, степень гидролиза выше, но при оптимальной для фермента температуре в 37^oС снижается скорость экстракции ГК, что приводит к увеличению продолжительности всего технологического цикла.

Температура выше 50^oС связана с невысокой степенью гидролиза белка и с началом развития коагуляционных и денатурационных процессов, что отрицательно влияет на качество и чистоту препарата.

Изучение влияния концентрации фермента на выход препарата показало, что максимальный выход ГК наблюдается при концентрации фермента равной 0,037% к массе сырья, дальнейшее ее увеличение вызывает глубокий распад структуры коллагена и, следовательно, невозможность полного выделения ГК из комплекса с белками. Зависимость степени гидролиза и выхода продукта от концентрации фермента изображена на фиг.3.

При концентрации фермента менее 0,035% к массе сырья не достигается необходимая степень гидролиза, что снижает выход ГК и увеличивает продолжительность всего процесса производства.

Необходимым условием для достижения максимальной степени гидролиза является подбор оптимальной продолжительности ферментации. Продолжительность ферментной обработки влияет не только на степень гидролиза, но и на выход конечного продукта. Из фиг.4 видно, что оптимальная продолжительность ферментативной обработки 45 мин, при уменьшении времени ферментации не достигается максимальный распад субстрата, а увеличение - не целесообразно, так как не повышает выхода целевого продукта.

Осадок не растворившихся после выделения ГК тканей целесообразно использовать на кормовые цели.

ГК извлекают из водной среды путем осаждения ее 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:3.

Способ получения ГК поясняется конкретными примерами.

Пример 1. Свежие петушиные гребни подвергают предварительной промывке проточной водопроводной водой и обескровливают этиловым спиртом в соотношении 1:2. К 100 г измельченных гребней до размера кусочков 2-3^- мм прибавляют воду в соотношении 1:3 и 0,037 г коллагеназы и экстрагируют ГК при рН 7 в течение 45 мин при температуре 45^oС. Экстракт отделяют вакуумным фильтрованием. Из водной среды ГК выделяют путем осаждения 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:3. Отфильтрованный осадок упаривают над пятиокисью фосфора в вакууме или с применением сублимационной сушки. Полученный препарат хранят в высушенном виде или в растворе спирта при температуре -18^oС.

Пример 2. Способ получения препарата ГК проводят аналогично примеру 1. рН среды при ферментации и водной экстракции равно 6.

Пример 3. Способ получения препарата ГК проводят аналогично примеру 1. рН среды при ферментации и водной экстракции равно 8.

Пример 4. Способ получения препарата ГК проводят аналогично примеру 1. Ферментацию и водную экстракцию проводят при температуре 3-5^oС.

Пример 5. Способ получения препарата ГК проводят аналогично примеру 1. Ферментацию и водную экстракцию проводят при температуре 55^oС.

Пример 6. Способ получения препарата ГК проводят аналогично примеру 1. Ферментацию и водную экстракцию проводят раствором коллагеназы с содержанием 0,041% к массе сырья.

Пример 7. Способ получения препарата ГК проводят аналогично примеру 1. Ферментацию и водную экстракцию проводят раствором коллагеназы с содержанием 0,030% к массе сырья.

Пример 8. Способ получения препарата ГК проводят аналогично примеру 1. Продолжительность ферментации и водной экстракции 30 мин.

Пример 9. Способ получения препарата ГК проводят аналогично примеру 1. Продолжительность ферментации и водной экстракции 60 мин.

Данные по примерам 1-9 представлены в таблице 1.

Данные таблицы 1 показывают, что способ получения ГК по режимам, приведенным в примерах 4, 8, приводит к недостаточно высокому выходу продукта, по примерам 2, 3, 5 еще и к недостаточной чистоте препарата (массовая доля белка до 4-5%, препарат желтого цвета).

Производство ГК по примерам 6, 7 приводит к неоправданно высокому или недостаточно высокому расходу ферментного препарата для обеспечения необходимой степени гидролиза сырья, что существенно влияет на выход препарата и его чистоту.

Максимальный выход ГК достигается при режимах по примерам 1, 9, но процесс по примеру 1 менее продолжителен и позволяет получить полимер высокой степени очистки.

Преимущества предлагаемого технического решения по сравнению с прототипом представлены в таблице 2.

Предложенный способ позволяет сократить сырьевые расходы, увеличить степень извлечения, чистоту и выход препарата ГК, снизить энергоемкость процесса, улучшить безопасность и экологичность производства.

Изобретение относится к способу получения гиалуроновой кислоты из петушиных гребней. Сырье обескровливают этиловым спиртом в соотношении 1:2, измельчают, проводят водную экстракцию и отделяют водную фракцию. Затем осаждают продукт этиловым спиртом в соотношении 1:3, фильтруют и сушат. На стадии водной экстракции сырье обрабатывают раствором ферментного препарата коллагеназы с содержанием 0,035-0,040% к массе сырья в течение 45-50 мин при температуре 45-50^oС и рН 6,8-7,0. Технический результат - повышение выхода и улучшение качества целевого продукта. 4 ил., 2 табл.

Способ получения гиалуроновой кислоты, включающий обескровливание петушиных гребней этиловым спиртом в соотношении 1: 2, измельчение, водную экстракцию, отделение водной фракции, осаждение целевого продукта этиловым спиртом в соотношении 1: 3 с последующим фильтрованием и сушкой продукта, отличающийся тем, что на стадии водной экстракции проводят обработку сырья раствором ферментного препарата коллагеназы с содержанием 0,035-0,040% к массе сырья в течение 45-50 мин при температуре 45-50^oС и рН 6,8-7,0.