СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПАТОЛОГИИ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/483 

Изобретение относится к медицине (педиатрии и дерматологии), к диагностике патологии клеточного иммунитета при хронических вирусных инфекциях.

Уровень техники
Центральным звеном клеточного иммунитета является система мононуклеарных фагоцитов, в которой наиболее зрелыми в отношении фагоцитарной активности и, в целом, функционального состояния являются тканевые макрофаги. Известно, что развитие хронического инфекционного воспалительного процесса обусловлено иммунопатологией с повреждением тропного органа или системы органов, в которых развивается хроническое воспаление по мононуклеарно-инфильтративному или деструктивно-экссудативному вариантам.

Центральной фигурой трехчленного иммунного реагирования в ответ на антигенемию и патологический процесс являются макрофаги.

Актуальным является поиск достаточно информативных и щадящих способов оценки функционального состояния макрофагов с целью прогнозирования исходов патологического процесса и эффективности терапии при таких хронических вирусных инфекциях, как вирусные гепатиты В, Д и С и герпетической инфекции.

Целью изобретения является повышение точности способа диагностики.

Известен способ (1 аналог) оценки функционального состояния клеток СМФ по показателю фагоцитарного индекса (ПФИ) моноцитов периферической крови, в котором стандартным методом выделяют моноциты венозной крови в градиенте фиколл-верографин путем центрфугирования в течение 15 мин при t^o-4^oC. К осадку добавляют среду 199 или RPM1 на буфере NaHCО₃ рН 7,3 до V=210мл. 50 мкл моноцитов в среде 199 с 40% эмбриональной телячьей сывороткой, инактивированной при t =56^oC в течение 30 мин с гентамицином (40 мг/мл), наслаивают на предметное стекло, которое инкубируют 30 мин при t - 37^oС. После промывки стекла в р-ре Хэнкса(37^oС) для удаления неприлипших клеток наслаивают 50 мкл зимозана, опсонизированного плазмой донора "О (1)" группы. Зимозан служит при этом объектом фагоцитоза. После промывки препарат окрашивают по Романовскому, микроскопируют с подсчетом количества клеток, захвативших зимозан. ПФИ равен отношению числа клеток, захвативших зимозан, к общему числу исследованных клеток, умноженному на 100%. По данным модифицированного метода В.А. Извековой (1996) ПФИ у здоровых равен, в среднем, 94,8±4,7%.

Библиография аналога
1) Извекова В. А., Чередниченко Т.К. Клинико-патогенетическое значение оценки фагоцитарной активности моноцитов при вирусных гепатитах у детей - ЖМЭИ, 1996, с. 60-64.

2) Bjerknes R. and Bassoe C.F.-Human leykocytic phagocytosis of zymozan particles measured by flow cytometry.-Acta path. Microbiology, immunology Scand. Sect.C 91:341-348, 1983.

3) Myhrvold V. and Моrland В.-The use of frosen monocytes in phagocytosis stadies - Acta path. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. С 93: 43-48. 1985.

Критика аналога
Недостатком указанного способа является необходимость забора крови, ограничение оценки функционального состояния (фагоцитарной активности) только лишь моноцитов периферической крови, при отсутствии таковой оценки у тканевых макрофагов.

2 аналог
Одним из наиболее доступных способов получения и оценки функционального состояния тканевых макрофагов является тест "кожного окна" по Rebuc J.W. (1955). С помощью данного теста получают отпечаток клеточного экссудата кожной асептической воспалительной реакции (АВР), в котором содержатся тканевые макрофаги.

Способ основан на проведении скарификации кожи до капиллярного слоя (без повреждения сосудов и кровотечения) на передней поверхности предплечья в верхней его трети. Скарифицированный участок кожи покрывают стерильным стеклом, которое фиксируют лейкопластырем. Через 6 часов стекло заменяется. Повторно отпечаток снимают через сутки от начала реакции, фиксируют этанолом и окрашивают по Романовскому. Микроскопируют с иммерсией и определяют % нейтрофилов, макрофагов, лимфоцитов и фибробластов от общего числа сосчитанных клеток инфильтрата зоны АВР. В норме накопления экссудата и коллагеновых волокон в зоне АВР не должно быть (фиг.1).

Клеточный состав АВР во 2-й (макрофагальной) фазе у детей от 5-15 лет и у взрослых в норме:
макрофаги- - 78-92% (в среднем 75±1,1%)
нейтрофилы - 4-22%
лимфоциты - 4-6%
фибробласты - единичные
В течении АВР оцениваются миграционная активность макрофагов, их морфологическая структура, целостность мембраны, наличие вакуолей и псевдоподий, свидетельствующих об их активности и зрелости.

С помощью гистохимических методов возможна также оценка их ферментативной активности, маркерами которой для макрофагов служат неспецифическая α-нафтилацетат-эстераза лизосомального аппарата и 5-нуклеотидаза мембран и т.д.

Библиография аналога
1) М. А. Капелько, Е.И. Цветкова, Н.А. Коровина и др. - Использование метода "кожного окна" для характеристики асептической воспалительной реакции у детей - Педиатрия, 1980, с. 26-30.

2) Т. В. Чередниченко. Ф.С. Харламова - Способ оценки функционального состояния печени у детей, больных хроническим гепатитом. - Бюлл. открытий и изобретений от 30.11.1985.

3) Rebuck J. W.. Crowley J.A. - Leukocytic functions in vivo.-Ann.N.Y. Acad.Sci., 1955, v.59, p.757-794.

Критика аналога
К недостаткам данного способа следует отнести недостаток информации в тех случаях, когда в течении АВР происходит накопление значительного количества экссудата и коллагена, что связано, с одной стороны, с повышением проницаемости сосудистой стенки, а с другой - служит косвенным признаком неполноценной функциональной активности макрофагов. В подобных вариантах исследования оценка морфологических особенностей и ферментативной активности макрофагов невозможна.

Прототип
Доступным и более эффективным для оценки функционального состояния макрофагов (в сравнении с аналогами), при аномальном течении АВР, является исследование уровня ядерной РНК макрофагов с помощью флюоресцентной микроскопии, позволяющей получить четкое изображение ядер макрофагов, погруженных в экссудат или опутанных коллагеновыми волокнами.

Способ заключается в том, что в тесте "кожного окна" на скарифицированный участок кожи накладывают одновременно 2 стекла, которые снимают через 24 часа от начала АВР. После высушивания один из отпечатков после фиксации этанолом обрабатывают РНК-азой в течение 1,5 часов при t^o- 37^oС, затем оба отпечатка фиксируют в смеси абсолютного этилового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1 в течение 11-12 мин. Для удаления следов уксусной кислоты и предотвращения кислотного гидролиза нуклеиновых кислот препараты переносят в этанол на 5-6 мин. Затем доводят до воды через серию спиртов понижающейся концентрации 96, 75, 50, 25^o, после чего помещают в 0,2 М в фосфатно-цитратный буфер рН 4,2 на 2-3 мин. Препараты в дальнейшем окрашивают в рабочем растворе акридинового оранжевого 1:20000 в 0,2М растворе фосфатно-цитратного буфера рН 4,2 в течение 5 мин. Время окрашивания 5 мин с последующей отмывкой в фосфатно-цитратном буфере рН 4,2. Окрашенные препараты микроскопируют в люминесцентном микроскопе и флюориметрируют с помощью насадки ФМЭЛ-1 на основе ФЭУ с фотокатодом. С помощью зондов, которыми снабжена ФМЭЛ, с целью измерения интенсивности люминесценции, выделяется и проецируется на фотокатод изображение ядра макрофага. Подлежащая измерению область спектра выделяется при помощи интерференционных светофильтров, которые входят в состав ФМЭЛ. В зеленой области применяют фильтры с максимумом пропускания λ=530 нμ, которая соответствует флюоресценции ДНК, а в красной области светофильтр λ=640 hμ, соответствующий флюоресценции РНК. С ФЭУ показания снимаются в условных единицах.

С целью определения функционального состояния хроматина ядер макрофагов используется показатель α=отношению I 640 /I 530 (индекс Риглера Р., 1966). I - интенсивность флюоресценции.

Для каждого препарата отпечатка АВР проводится измерение I 640 и I 530 ядер от 15-20 макрофагов до и после обработки РНК-азой. Препарат исследуемого характеризуется средним значением "α-среднего", рассчитанного по ранее указанной формуле. Разница средних значений "α-ср." до и после обработки РНК-азой соответствует содержанию РНК в макрофагах.

В норме этот показатель у здоровых от 1 года- 15 лет колеблется от 0,30-0,45±0,05 усл. ед., а у детей до 1 года = 0,23±0,02 усл. ед.

Известно, что макрофаги ответственны за синтез цитокинов, интерферона и переработку антигенного материала, при этом образующийся комплекс агРНК-"суперантиген", обладая иммуногенностью, индуцирует синтез специфических антител В-лимфоцитами (Ляшенко В.А. с соавт, 1988).

Для оценки состояния хроматина макрофагов, их готовности к апоптозу в случаях патологии, указанный способ наиболее информативен в сравнении с аналогами, т. к. исследования проводятся in vivo, в условиях стереотипной иммунной воспалительной реакции в маленьком участке кожи, но в то же время синхронной с иммунологическими воспалительныими реакциями в поврежденных органах и, следовательно, являющейся "окном" в иммунопатологический процесс при хроническом инфекционном заболевании.

Доказано, что уровень ядерной РНК макрофагов зоны АВР коррелирует с глубиной патологического процесса при хронической вирусной инфекции (Ф.С.Харламова с соавт., 1988).

Библиография прототипа
1) Ляшенко В. А., Дроженников В.А., Молотковская И. М. - Механизмы активации иммунокомпетентных клеток. - М., Медицина, 1988.

2) Харламова Ф.С., Корн М.Я.. Чередниченко Т. В. - Клиническое значение нарушений СМФ при вирусном гепатите В у детей. - ВОМД, 1986, N11, с. 20-25.

3) Харламова Ф.С., Чередниченко Т. В., Корн М.Я., Учайкин В.Ф. - Способ дифференциальной диагностики хронического гепатита у детей. - Бюллетень открытий и изобретений от 23.01.1988, 3.

4) Rigler R. - Acta physiologica Scandinavica. - Stockholm. - 1966. - Suppl. - v.267, p.67-87.

Критика прототипа
Недостатком прототипа является трудоемкая и длительная обработка информации, снимаемой исследователем с ФЭУ при одновременной микроскопии препаратов, что может являться субъективным фактором допускаемых ошибок в процессе измерений и математической обработке результатов флюориметрии.

Сущность изобретения
Цель заявленного способа достигается тем, что впервые в диагностике патологии клеточного иммунитета при хроническом вирусном гепатите и герпетической инфекции использован модифицированый метод определения уровня РНК ядер макрофагов (см. прототип) с помощью компьютеризированной телевизионной фотометрии, что позволяет повысить точность диагностики указанной патологии.

Для определения интенсивности свечения используется растровое регистрирующее устройство на основе прибора с зарядовой связью (ПЗС-матрицы). Эффективность использования устройств для подобных измерений доказана опытом применения аппаратно-программного комплекса (АПК) "Диа-Морф". Доказана высокая степень корреляции измерений оптической плотности на стандартном приборе (цитоспектрофотометр) и АПК "Диа-Морф".

Поскольку оптическая плотность вычисляется как логарифм отношения интенсивностей света, это может служить обоснованием возможности измерения флюоресценции телевизионными фотометрами.

Установка АПК "Диа-Морф" включает в себя (фиг.2):
1) Флюоресцентный микроскоп, допускающий наблюдение в фазовом контрасте в белом свете (в нашем случае использовался микроскоп "Люмам").

2) Устройство смены светофильтров.

3) Измерительное ПЗС-матричное устройство (черно-белая видеокамера высокого разрешения и плата оцифровки сигнала).

4) Компьютер с программой анализа изображения.

Техника метода и материалы исследования
Основные этапы работы
1. Обработка препаратов раствором акридинового оранжевого (см. описание в прототипе)
2. Выбор участка изображения с целью определения размеров и контуров клетки проводится в фазовом контрасте с желтым светофильтром в проходящем свете для предотвращения выцветания акридинового оранжевого.

3. Ввод изображения в компьютер с ПЗС-матрицы телекамеры.

4. Перекрытие источника белого света.

5. Введение красного фильтра для выделения в выбранном участке препарата области с максимумом люминесценции РНК (I max=640 нм).

6. Открытие перекрывающей свет заслонки, возбуждающее люминесценцию.

7. Установка зеленого фильтра для выделения в выбранном участке препарата спектральной области с максимумом люминесценции ДНК (I max=530 нм).

8. Перекрытие возбуждающего люминесценцию света.

9. Математическая обработка изображения в компьютере по программе.

10. Далее цикл повторяется, начиная либо с 1-го, либо со 2-го пункта.

Основные этапы обработки изображения
Программа обработки изображения оперирует тремя исходными изображениями.

1. Изображение, полученное в фазовом контрасте.

2. Интенсивность флюоресценции изображения клеток, полученных через красный фильтр.

3. Интенсивность флюоресценции изображения клеток, полученных через зеленый фильтр.

Вначале выделяется контур ядра. Ядро методами цифровой обработки изображения отделяется от окружающего фона. Погрешности выделения (если такие есть) устраняются ручным редактированием результирующего бинарного изображения. Результатом обработки является изображение, разделенное на зоны: белые зоны соответствуют ядрам, черная зона - окружающий фон и цитоплазма клеток. Это бинарное изображение ядер используется для вычисления морфометрических характеристик ядер (площади, минимального и максимального диаметров, фактора формы), а также как основание для измерения оптических характеристик (среднего свечения и неравномерности свечения) на двух других исходных изображениях. Другими словами, измерение свечения ДНК и РНК проводится только в пределах контура ядра, полученного как результат обработки изображения в фазовом контрасте. После получения параметров по программе свечения ДНК и РНК вычисляется коэффициент α, равный отношению значений интенсивности люминесценции в красной области относительно люминесценции в зеленой.

Данным способом обследовано 67 больных. Из них 54 - в возрасте от 1 года до 15 лет с хроническим гепатитом С (ХГС) и 13 взрослых с хронической герпетической инфекцией кожи и урогенитальной системы.

У всех больных инфекционный процесс характеризовался стадией активной вирусной репликации, что документировалось данными исследования сыворотки крови методом ПЦР и ИФА.

Согласно современной классификации хронического гепатита (Desmet V. et. al, 1995) среди детей с ХГС у 3 гепатит протекал на фоне нормальной активности трансаминаз (без активности), у 28 - была минимальная, у 20 - умеренная и у 3 - высокая степень активности гепатита.

Среди 13 больных с рецидивирующей герпетической инфекцией у 4 была легкая форма, у 5 - среднетяжелая и у 4 тяжелая форма болезни.

В результате проведенных исследований мы выявили достоверные различия в значениях РНК макрофагов, соответствующих определенной степени активности ХГС и форме тяжести рецидивирующей герпетической инфекции. В таблице представлены средние значения РНК ядер макрофагов в зависимости от степени активности ХГС и формы тяжести рецидивирующей герпетической инфекции (М±m), а также даны различия в значениях РНК ядер макрофагов при сравнении между собой разных степеней активности гепатита и форм тяжести герпетической инфекции, что может служить основанием для предлагаемого иммунологического критерия выявляемой степени депрессии функционального состояния клеток системы мононуклеарных фагоцитов при указанных заболеваниях.

Изобретение относится к медицине (педиатрии и дерматологии), к диагностике патологии клеточного иммунитета при хронических вирусных инфекциях. Технический результат - повышение точности способа диагностики, снижение трудоемкости и длительности обработки информации при математической обработке результатов. При хроническом вирусном гепатите и рецидивирующей герпетической инфекции путем бескровной скарификации эпидермиса кожи получают препарат макрофагов из экссудата кожной асептической воспалительной реакции, окрашивают акридиновым оранжевым для выявления РНК ядер макрофагов и по их содержанию, определяемому с помощью компьютерной телевизионной флюориметрии, оценивают характер патологии клеточного иммунитета с учетом степени активности хронического вирусного гепатита и формы тяжести рецидивирующей герпетической инфекции. 2 ил., 1 табл.

Способ диагностики патологии клеточного иммунитета при хронических вирусных инфекциях путем измерения уровня РНК ядер макрофагов, полученных из отпечатка экссудата кожной асептической воспалительной реакции, заключающийся в том, что скарифицированный участок кожи покрывают стеклом, получают отпечаток клеточного экссудата кожной асептической воспалительной реакции, высушивают, фиксируют, окрашивают акридиновым оранжевым, помещают в люминесцентный микроскоп, выбирают участок изображения контура ядер, переводят изображение в телевидеокамеру, с помощью цифровой обработки изображение отделяют от окружающего фона, выделяют белую зону ядер, черную зону цитоплазмы и окружающего фона, вычисляют морфометрические характеристики ядер, в свете люминесценции выделяют спектральные области с максимумами люминесценции РНК и ДНК, вычисляют коэффициент α, равный отношению значений интенсивности люминесценции в красной и зеленой спектральных областях и при значении α= 0,34±0,07 ед. диагностируют хронический гепатит при нормальных показателях трансаминаз; при α=0,21±0,05 ед. - минимальную активность хронического гепатита; при α=0,09±0,05 ед. - умеренную активность хронического гепатита; при α= 0,076±0,04 ед. - высокую активность хронического гепатита, а при рецидивирующей герпетической инфекции диагностируют легкую форму болезни при α= 0,43±ед., среднетяжелую форму - при α=0,30±0,02 ед. и тяжелую форму - при α= 0,13±0,01 ед.