СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЕСПЕЧЕННОСТИ ОРГАНИЗМА РИБОФЛАВИНОМ (ВИТАМИНОМ B) Российский патент 2002 года по МПК G01N33/68 G01N33/82 

Способ может быть использован в медицине, а именно в диагностике обеспечиности организма витамином В₂.

Витамин В₂ (синонимы: рибофлавин, лактофлавин, витамин G, овофлавин, люминофлавин, урофлавин, гепатофлавин) - 7,8-диметил-10-N-(L-D-рибитил)-изоаллоксазин, C₁₇H₂₀O₆N₄, водорастворимый витамин комплекса В [1].

В природе рибофлавин встречается в трех формах: свободный рибофлавин и его коферментные формы - флавинмононуклеотид (ФМН, рибофлавин-5-фосфата) и флавинадениндинуклеотид (ФАД).

Рибофлавин, поступающий с пищей, всасываеся в тонком кишечнике, где частично фосфорилируется в ФМН и ФАД [17]. В основном, образование коферментных форм рибофлавина происходит в печени и почках. Образование коферментных форм рибофлавина происходит с участием АТФ и двух ферментов - флавокиназы (КФ 2.7.1.26), катализирующей синтез ФМН, и флавиннуклеотидфосфорилазы, катализирующей синтез ФАД из ФМН и АТФ по следующей схеме:
Рибофлавин + АТФ - рибофлавин-5-фосфат (ФМН) + АДФ
ФМН + АТФ - ФАД + пирофосфат
Биологическое значение рибофлавина обусловлено его окислительно-восстановительными свойствами и участием в связи с этим во многих реакциях обмена веществ в организме. Флавиновые коферменты входят в состав каталитических центров важнейших окислительно-восстановительных ферментов - флавиновых оксидоредуктаз или флавопротеидов.

Флавиновые ферменты занимают одно из центральных мест в процессах энергетического обмена, принимая участие в окислении жирных кислот, окислительном декарбоксилировании пировиноградной кислоты и α-кетоглутаровой кислоты, в цикле трикарбоновых кислот, в окислительном фосфорилировании. ФАД-зависимые ферменты участвуют также в синтезе коферментных форм витамина В₆ (пиридоксальфосфата) и фолацина (тетрагидрофолиевой кислоты) [4; 11].

В крови рибофлавин и его коферметные формы связываются с белками плазмы, преимущественно с альбуминами, и транспортируются в различные органы. При белково-калорийной недостаточности наблюдаются нарушения всасывания рибофлавина, его фосфорилирования в слизистой оболочке кишечника, а также нарушение его транспорта из-за низкого содержания альбумина в плазме крови, в результате чего существенно усиливается выведение рибофлавина с мочой [19].

Недостаток рибофлавина снижает образование гликогена из глюкозы в печени. Существует известная количественная взаимообусловленность между углеводами и витамином В₂. Это подтверждается увеличением потребности в этом витамине при диете, богатой углеводами [10].

Многие патологические состояния характеризуются недостаточной обеспеченностью организма рибофлавином [14; 16; 22]. Арибофлавиноз характеризуется поражением кожи, слизистой оболочки рта, глаз.

Выраженная недостаточность рибофлавина вызывает глубокие функциональные и структурные изменения в коре надпочечников, нарушение процессов гемопоэза вследствие снижения активности костного мозга (развитие анемии), обмена железа, а также гликонеогенеза.

Гиповитаминоз рибофлавина неблагоприятно отражается на состоянии естественного иммунитета.

При недостаточности в организме рибофлавина отмечают снижение цветовой и световой чувствительности сетчатки глаза.

Потребность в рибофлавине особенно велика в центральной нервной системе и рецепторном аппарате в силу наличия здесь особенно интенсивных процессов тканевого дыхания. Показано, что содержание рибофлавина в различных отделах мозга прямо пропорционально их дыхательному коэффициенту.

В организм человека рибофлавин поступает только с пищей, синтез его микрофлорой толстой кишки имеет значение лишь у некоторых видов животных [14].

Введенный парентерально витамин В₂ фосфорилируется в тонком отделе кишечника, затем всасывается и накапливается в отдельных органах: главным образом в мозговой ткани, печени, почках, сердце. Однако подобное накопление рибофлавин-ферментов в упомянутых органах, по-видимому, не может рассматриваться как проявление "депонирования" этого витамина [20; 21].

Суточная потребность человека в рибофлавине составляет 2-3 мг [7; 18]. Она возрастает во время физической нагрузки, психоэмоционального стресса), при повышении калорийности пищи с увеличением в ней белков, при употреблении больших количеств никотиновой кислоты.

Для оценки обеспеченности организма рибофлавином используют анкетно-опросные методы расчета фактического потребления витамина в суточном рационе и биохимические показатели - концентрации рибофлавина или его коферментных форм в плазме крови и эритроцитах, а также величины экскреции их метаболитов с мочой [6; 8]. Известны флуоресцентный метод определения рибофлавина в плазме (сыворотке) крови с использованием рибофлавинсвязывающего апобелка, люмифлавиновый метод определения общего рибофлавина в эритроцитах, способы определения обеспеченности организма рибофлавином в суточной или часовой моче титрованием рибофлавинсвязывающим апобелком [13; 15].

В качестве прототипа взят способ определения обеспеченности организма витамином В₂ [5].

Задачей предложенного способа является повышение точности оценки обеспеченности организма человека рибофлавином (витамином В₂).

Указанная задача достигается тем, что при оценке обеспеченности организма человека рибофлавином (витамином В₂) наряду с использованием показателей активности рибофлавинзависимого фермента - глутатионредуктазы (ГР) и ФАД-эффекта дополнительно определяют рибофлавиновый индекс (РИ).

Способ осуществляется следующим образом.

В сыворотке крови определяют показатели ГР и ФАД-эффекта. После этого - РИ по формуле:

Показатели РИ выражают в условных единицах (у.е.).

При обследовании лиц, относящихся к категории практически здоровых, полученные нами значения ТИ колебались в пределах от 35,30 до 41,12 у.е., что для использованной методологии расчета можно считать близкими к оптимальным. Известные данные литературы о показателях активности ГР и ФАД-эффекта в норме [2; 9] в целом сопоставимы с полученными в нашем исследовании. Таким образом, выявленные лимиты варьирования РИ могут использоваться в качестве ориентира данного параметра у взрослых - практически здоровых лиц.

На основе этих данных и с учетом необходимого "запаса надежности" [3] определены: минимальный коэффициент РИ, отражающий адекватную обеспеченность организма рибофлавином, а также РИ, свидетельствующие о сниженной степени обеспеченности этим витамином и о состоянии явного гиповитаминоза В₂.

Учитывая принятое в литературе максимальное значение ФАД-эффекта для нормальной обеспеченности организма человека витамином В₂, равное 1,2, минимальный показатель РИ, отражающий нижнюю границу адекватной обеспеченности организма рибофлавином, составляет:
35,30:1,2=29,41 у.е.

Таким образом, при значении РИ>29,41 у.е. делают вывод о достаточной обеспеченности организма человека витамином В₂.

Значение РИ, отражающее состояние глубокого дефицита витамина В₂, с учетом общепринятого при этом ФАД-эффекта в 1,3, составляет:
(35,30-1σ):1,3=26,15 у.е.

Таким образом, при значении ТИ<26,15 у.е. делают вывод о явном гиповитаминозе В₂.

Значения РИ в интервале от 26,16 до 29,40 свидетельствуют о сниженной обеспеченности организма человека витамином В₂ - состоянии "риска" по развитию гиповитаминоза В₂.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Обследуемый А., профосмотр:
Активность ГР составила 41,75 мкмоль НАДФН₂/мл эритр./ч;
ФАД-эффект - 1,03 у.е.;
РИ=40,53 у.е.

Вывод: состояние адекватной обеспеченности организма витамином В₂.

Степень снижения РИ отражает уровень дефицита обеспеченности организма рибофлавином и соответствует динамике патологического процесса, что видно на примерах исследований состояния больных хроническим алкоголизмом - одного из заболеваний в развитии гиповитаминоза витаминов группы В.

Пример 2. Больной Б. Диагноз - хронический алкоголизм, II стадия, ремиссия заболевания.

Активность ГР - 30,55 мкмоль НАДФН₂/мл эритр./ч;
ФАД-эффект - 1,05 у.е.;
РИ=30,55:1,05=29,09 у.е.

Вывод: сниженная обеспеченность организма витамином В₂ - состояние "риска" по развитию гиповитаминоза рибофлавина.

Пример 3. Больной В. Диагноз - хронический алкоголизм, II стадия, острое психотическое состояние.

Активность ГР - 30,12 мкмоль НАДФН₂/мл эритр./ч;
ФАД-эффект - 1,50 у.е.;
РИ=30,12:1,50=20,08 у.е.

Вывод: состояние явного гиповитаминоза по витамину В₂.

Таким образом, способ оценки обеспеченности организма рибофлавином с использованием РИ позволяет более точно и объективно оценить проявления недостаточности витамина В₂ в организме.

Положительный эффект.

РИ позволяет описать реальный уровень насыщения организма рибофлавином по одному результирующему показателю вместо двух, характеризующихся собственными особенностями динамики в процессе изменения состояния организма, имеет высокую степень информативности по оценке эффективности витаминотерапии, необходимости ее коррекции и прогнозирования течения заболеваний, характеризующихся снижением обеспеченности организма рибофлавином.

ЛИТЕРАТУРА
1. Большая медицинская энциклопедия, 1984, т. 22, стр. 287-289.

2. Бондарев Г.И., Мартинчик А.Н., Хотимченко С.А. и соавт. Коррелятивная взаимосвязь фактического потребления витаминов В1, В2 и В6 с биохимическими показателями обеспеченности ими организма. //Вопр. Питания. - 1986 - 2. - С. 34-37.

3. Бондарев Г.И., Мартинчик А.Н., Хотимченко С.А. Подходы к определению потребности в витаминах на основании анализа взаимосвязи уровней фактического потребления и биохимических параметров обеспеченности //Вестник АМН СССР. - 1986. - 11. - С. 60-65.

4. Витамины. /Под ред. Смирнова М.И. - М., 1974. - С. 214-233.

5. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Алексеева И.А., Спиричев В.Б. Сравнение биохимических критериев обеспеченности организма человека рибофлавином. //Вопр. Мед. химии. - 1991. - 5. - С. 76-79.

6. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Спиричев В.Б. Об использовании величин экскреции витаминов и их метаболитов в качестве показателей обеспеченности витаминами В₂, В6 и PP. //Вопр. Мед. химии. - 1992. - 1. -С. 22-24.

7. Руководство по медицине. Диагностика и терапия. /Под ред. Р.Беркоу, М., 1997. - T. 1. - C. 660-661.

8. Спиричев В. Б., Блажеевич Н.Б., Коденцова В.М. и др. Обеспеченность витаминами взрослого населения Российской Федерации и ее изменение в 1983-1993 г.г. Сообщение II. Витамины группы В //Вопросы питания. - 1995. - 6. - С. 3-8.

9. Теоретические и клинические аспекты науки о питании. Методы оценки обеспеченности населения витаминами. /Под ред. Волгарева М.Н., 1987 - Т.8. - 210 с.

10. Amoresano A. , Brancaccio A., Andolfo A. The carbohydrates of the isoforms of three avian riboflavin-binding proteins. //Eur J Biochem. - 1999. - V 263, N 3. - P.849-858.

11. Becker К. , Schirmer М., Kanzok S., Schirmer R. Flavins and flavoenzymes in diagnosis and therapy. //Methods Mol Biol. - 1999. - V 131. - P. 229-245.

12. Eberhardt S. , Korn S., Lottspeich F., Bacher A. Biosynthesis of riboflavin: an unusual riboflavin synthase of Methanobacterium thermoautotrophicum. //J Bacteriol.- 1997. - V. 179, N 9. - Р.2938-2943.

13. Hewavitharana A. , Method for the extraction of riboflavin for high-performance liquid chromatography and application to casein. //Analyst. - 1996. - V. 121, N 11. - Р.1671-1676.

14. Jamieson С. , Obeid О., Powell-Tuck J. The thiamin, riboflavin and pyridoxine status of patients on emergency admission to hospital. //Clin Nutr.-1999. - V 18, N 2. - P.87-91.

15. Kodentsova V., Vrzhesinskaya О., Spirichev V. Fluorometric riboflavin titration in plasma by riboflavin-binding apoprotein as a method for vitamin B2 status assessment. //Ann Nutr Metab. - 1995. - V.39, N 6. - P. 355-60.

16. Mulherin D., Thurnham D., Situnayake R. Glutathione reductase activity, riboflavin status, and disease activity in rheumatoid arthritis. //Ann Rheum Dis. - 1996. - V55, N 11, - P.837-844.

17. Pueyo J. , Curley G., Mayhew S. Kinetics and thermodynamics of the binding of riboflavin, riboflavin 5'-phosphate and riboflavin 3',5'-bisphosphate by apoflavodoxins. //Biochem J. - 1996. - 313 (Pt 3). - P.855-861.

18. Recommended Dietary Allowances, 9 th Revised Ed. (National Academy of Sciences). - Washington, 1980.

19. Wangensteen О., Bartlett M., James J., et al., Riboflavin-enhanced transport of serum albumin across the distal pulmonary epithelium. //Pharm Res. - 1996. - N 13-12. - P.1861-1864.

20. Yasuda К. Hiraoka M., Vitamin B2 (riboflavin). //Nippon Rinsho. - 1999. - V 57. - Р.128-301.

21. Zempleni J. , Galloway J., McCormick D. Pharmacokinetics of orally and intravenously administered riboflavin in healthy humans. //Am J Clin Nutr. - 1996. - V.63, N 1, - P.54-66.

22. Zempleni J., Galloway J., McCormick D. The metabolism of riboflavin in female patients with liver cirrhosis. //Int J Vitam Nutr Res. - 1996. - V 66, N 3, - P.237-243.

Изобретение относится к медицине. Способ заключается в определении рибофлавинового индекса (РИ), определяемого путем деления показателей активности рибофлавинзависимого фермента глутатионредуктазы, выраженного в мкмоль НАДФН₂/мл эритр. /ч на значение ФАД-эффекта в у. е., и при значении РИ 26,16-29,40 у. е. определяют снижение обеспеченности витамином В₂, при РИ, меньшем или равном 26,15, - явный гиповитаминоз, а большем или равном 29,41 - адекватную обеспеченность организма рибофлавином. Способ обеспечивает повышение точности определения.

Способ определения обеспеченности организма рибофлавином (витамином В₂), отличающийся тем, что определяют показатели активности рибофлавинзависимого фермента глутатионредуктазы (ГР) и флавинадениндинуклеотид-эффекта (ФАД-эффекта), как количественной меры ненасыщенности ГР коферментом, вычисляют отношение первого показателя ко второму - рибофлавиновый индекс (РИ) - и при значениях его в интервале от 26,16 до 29,40 у.е. определяют снижение обеспеченности организма человека витамином В₂, при РИ меньшем или равном 26,15 у. е. - явный гиповитаминоз, а большем или равном 29,41 у.е. - адекватную обеспеченность организма рибофлавином.