СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ И ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЯМИ Российский патент 2005 года по МПК A61K31/185 A61K31/122 A61P39/06 A61P31/12 

Изобретение относится к биологически активным соединениям, используемым в медицине и фармацевтической промышленности, применимо в пищевой промышленности в косметических средствах. Изобретение основано на получении синтетического аналога убихинона, близкого по биологическому действию к природному соединению.

Синтезирован 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонат натрия, обладающий антиоксидантной и противовирусной активностями. Соединение не токсично. Наличие биологической активности позволяет рекомендовать его для расширения арсенала средств с противовирусным действием и средств, препятствующих окислительным процессам, которые протекают как в организме, так и в фармацевтических, пищевых, косметологических и иных композициях.

Полученное соединение было исследовано in vitro и in vivo. Оно может использоваться в лечебных и профилактических целях, т.к. в биохимических процессах ведет себя подобно природному убихинону. Соединение водорастворимо, благодаря чему широко может использоваться в биотехнологической, в химической, в фармацевтической промышленностz[.

Известны антиоксиданты: витамин Е, глютатион, N-ацетилцистеин, витамин С (аскорбиновая кислота), некоторые незаменимые аминокислоты, коэнзим Q (Машковский М.Д. Лекарственные средства. М. 2000. Т.2. С.182-188).

К важнейшим функциям этой группы препаратов следует отнести их взаимодействие с активными радикалами кислорода.

Их действие направлено на следующие физиологические и патологические процессы в организме.

1. Участие в основных метаболических процессах и, в частности, окислительно-восстановительных реакциях, определяющих интенсивность каталитических процессов в клетках.

2. Взаимодействие с активными формами (свободными радикалами) кислорода, формирующимися при провоспалительной активации макрофагов и тканевой гипоксии.

3. Участие в процессах транспорта электронов и окислительного фосфорилирования в митохондриях.

4. Взаимодействие с витаминами (окислительно-восстановительный переход у витаминов группы В), с аминокислотами (серосодержащими), с белками.

5. Взаимодействие с перекисями липидов клеточных мембран и липопротеидами.

Применяемые в медицине витамин Е и витамин С часто используют в пищевой промышленности и в фармкомпозициях в качестве антиоксидантов.

Известен препарат олифен (Ж. Высокомолекулярные соединения. 1975. Т.17(А), №3. С.557-563. Машковский М.Д. Лекарственные средства, Москва, “Новая Волна”, 2000, Т.2, С.187), представляющий собой

где n равняется от 1 до 5.

Препарат обладает антиоксидантной активностью, но состоит из смеси полимерных продуктов, которые варьируются от условий синтеза, из-за чего имеется большой разброс в единицах активности (Машковский М.Д. Лекарственные средства. Москва. “Новая Волна”, 2000. Т.2. С.187).

Известен препарат убихинон (Машковский М.Д. Лекарственные средства. Москва. “Новая Волна”, 2000. Т.2. С.187), представляющий собой следующую структуру:

6-декапренил-2,3-диметокси-5-метил-1,4-бензохинон, т.е. хиноидную структуру с длинным терпеноидным “хвостом”. Убихинон относится к жирорастворимым соединениям, но он плохо растворим в воде, что ограничивает его применение.

Высокоактивным аналогом убихинона является идебенон (Ж. Molecules, 2000. №5. С.1439-1460), представляющий собой 2,3-диметокси-5-метил-6-(10-гидроксидецил)-1,4-бензохинон:

Препарат этот новый и мало доступен в России. Не все его свойства известны, что затрудняет его широкое использование.

В ряду противовирусных препаратов широкое распространение в последнее время получил ремантадин:

α -метил-1-адамантилметиламинагидрохлорид.

(Машковский М.Д. Лекарственные средства. Москва. “Новая Волна”, 2000. Т.2. С.325).

Препарат этот дает хорошие результаты, но он является препаратом узкого спектра действия, в связи с чем постоянно ищут новые противовирусные средства.

Целью данного изобретения является создание доступного препарата с антиоксидантными свойствами, препарата с установленной структурой, обладающего противовирусной активностью.

Такое средство необходимо для увеличения арсенала как лекарственных препаратов (препаратов с биологической активностью), так и для увеличения арсенала антиоксидантов, применяемых в композициях разного назначения.

Задача была решена в результате синтеза производного гидрохинона, которое представляет собой 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонат натрия. Соединение было получено в результате реакции парабензохинона и тиосульфата натрия. Полученная соль является водорастворимой и жирорастворимой, обладает низкой токсичностью. Сходство химико-биологических свойств у синтезированного соединения с природным убихиноном, высокая биодоступность соединения позволяют использовать его в качестве антиоксиданта. Неожиданно при проверке выявилась его противовирусная активность.

Авторы выбрали в качестве цели синтеза хиноидную структуру нового соединения, близкую к природной. Исходя из того, что заместители типа SO₂ или SO₃ часто используются для того, чтобы повысить биодоступность фармакологических веществ (Хавинсон В.Х. с соавт. Свободнорадикальное окисление и старение. Санкт-Петербург, “Наука”, 2003), получено соединение следующей структуры:

которое за счет образования резонансных структур, включающих O=S=O, и за счет создания единой π -электронной структуры молекулы (причем сильно делокализованной π -системы) приобрело донорно-акепторные свойства и способность к взаимодействию с активными формами кислорода. Сочетание ароматического ядра с сульфатными группами привело к реакционной способности соединения взаимодействовать со свободными радикалами.

Синтез 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия осуществляли с полярных апротонных растворителях из парабензохинона с избытком тиосульфата натрия. Синтез проводили в присутствии серной кислоты при температуре 30-70° С. Молярное соотношение тиосульфата натрия и парабензохинона составляет 6:1, в ряде опытов количество тиосульфата натрия было более чем 6 молей на 1 моль парабензохинона. Выход конечного продукта от 70% до 80%. Продукт реакции является черным твердым порошкообразным веществом, растворимым в полярных растворителях.

Температура разложения 394° С. Токсичность препарата=LD₅₀=5100±135 мг/кг. Соединение не обладает способностью к кумуляции, не вызывает раздражающего действия на кожу и аллергических реакций.

На основании полученных данных можно сделать вывод о механизме реакции. Реакция идет по механизму электрофильного замещения водорода в ядре парабензохинона. Продукт реакции может сульфироваться до полного замещения водорода в ядре парабензохинона.

1. Образование сульфирующего агента

SO₃:Na₂S₂O₂→_SO3+Na2S

2Ar-SO₃H+Na₂S→ 2Ar-SO₃Na+H₂S↑

2. π -комплекс

3. σ -комплекс

4. Образование тетрасульфоната натрия

Соединение способно к полимеризации при нагревании в растворителях (при росте числа звеньев понижается растворимость, что приводит к образованию осадков). В растворах образует агрегаты. Медленно разлагается на свету. Вступает в окислительно-восстановительные реакции подобно бензохинонам. Способно к образованию солей и хелатных комплексных соединений с металлами и органическими аминами. Проявляет антиоксидантные свойства. Для анализа полученного соединения проведено 18 масс-спектрометрических анализов после синтеза (Nа₂S₂O₃+С₆Н₄O₂). Исследовали спектры ионов обоих зарядов. Результаты представлены на фиг.1 и 2.

Условия проведения измерений:

Прибор: времяпролетный масс-спектрометр с лазерной ионизацией Voyager DE.

Масса навески образца 1 мкг. Объем пробы 1 мкл.

Матрицы: синапиновая и альфа-цианокоричная кислоты в растворе 70% ацетонитрил, 29,9% бидистилированная вода, 0,1% трифторуксусная кислота. Интенсивность лазера 60-80% максимум.

Точность измерений составляла 0,2-1%.

Во всех представленных образцах при сетке в синапиновой кислоте проявляется набор пиков с шагом 22 а.е.м., начиная с 445, что подтверждает наличие 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия (с различным количеством ионов натрия) (см. фиг.1). Об этом косвенно свидетельствует и спектр отрицательно заряженных ионов, в котором виден шаг в 23 а.е.м., если предполагать, что образуются двухзарядные ионы.

Синтез 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия.

Синтез проводили в водно-ацетоновом растворе, где содержание воды в смеси вода-ацетон варьировали в диапазоне от 1:40 до 1:10. Данное соотношение влияет на скорость и управляемость реакции. При увеличении содержания воды скорость реакции понижается. Количество серной кислоты в реакционной смеси составляет 0,05% по объему.

К 1,8 л 2%-ного раствора парабензохинона в ацетоне прибавили 0,2 л насыщенного водного раствора тиосульфата натрия и 10 мл концентрированной серной кислоты. Молярное соотношение парабензохинона и тиосульфата натрия 1:6. Добавка серной кислоты к реакционной смеси увеличивает выход конечного продукта приблизительно на 15%.

Реакционную смесь перемешивают, нагревают ее первоначально до температуры +40° С, после чего реакция протекает с выделением тепла (энзотермически). Температуру реакции поддерживают в пределах +45-65° С, периодически охлаждая реактор.

Окончание реакции определяют по окончательному прекращению выделения тепла и охлаждению реакционной смеси.

Реакционную смесь через 12 часов после окончания реакции фильтруют через стерильный бязевый фильтр для удаления следов ацетона, и осадок высушивают при комнатной температуре в течение 24 часов. Измельченный осадок помещают в сокслет и промывают диэтиловым эфиром в течение 24 часов. Продукт высушивают в вакууме. Выход: 70% от взятого парабензохинона.

Хроматографию продуктов синтеза 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонат натрия проводили обращенофазовой жидкостной хроматографией на колонке Dynamax 60A с использованием жидкостного хроматографа фирмы Gilson, Франция. На хроматограмме (фиг.3) представлен основной пик материала с остаточными примесями, вероятно, димера (соединения 1 и 2, соответственно). Суммарное содержание примесей составляло от опыта к опыту не более 14%, в отдельных экспериментах оно было ниже 8%. Таким образом, 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонат натрия, получаемый при температуре 50-55° С, отличается достаточно высокой степенью гомогенности.

Пример осуществления синтеза 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия.

К раствору 7,5 кг парабензохинона в смеси растворителей ацетона и воды (20 л ацетона и 1,2 л воды) прибавили 1 л концентрированной серной кислоты и насыщенный водный раствор тиосульфата натрия (тиосульфата натрия 66 кг).

Раствор нагрели до 40° С, затем отключили подогрев и проводили реакцию, охлаждая раствор до +50-55° С (реакция идет с выделением тепла). Окончание процесса фиксировали по прекращению выделения тепла. Реакционную смесь выдерживали после прекращения процесса (отсутствие разогрева показывает, что весь парабензохинон прореагировал) в течение 12 часов без обработки. Затем полученную массу фильтровали через бязевый фильтр. Осадок сушили в течение 24 часов в сушильном шкафу. Массу осадка измельчали до гранул размером около 4 мм и помещали в фильтровальные патроны, которые устанавливали в сокслеты, где фильтровали диэтиловым эфиром в течение 24 часов. Затем осадок высушивали в сушильном шкафу и измельчали. Выход продукта 33,9 кг, что составляет 70% (по парабензохинону). Температура разложения равна +394° . Анализ с помощью масс-спектрометрии подтверждает получение с 95% чистотой 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия.

 C₆О₄S₄Na₄ Вычислено НайденоС 14,00% О 43,38% С 13,80% О 43,01% LD₅₀=5200 мг/кг 

Действие 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия на свободные радикалы кислорода.

Антиоксидантные свойства моно-, ди- и олигоциклогексасульфонатов исследовали с использованием метода, описанного Mohanti с соавт. (Моhanti J.G., Jaffe J.S., Schulman E.S., Raible D.G. A highly sensitive flujrescent micro-assay of H₂O₂ releasse from activivated human keucocytes using a dihydroxyphenoxazine derivative. J. Of Immunological methodds. 1997. Vol.202. P.133-1411).

Генерирование свободных радикалов кислорода и перекиси водорода явлется природной функцией активированных макрофагов. Лейкоциты получали из донорской крови центрифугированием в 6% декстране в присутствии ЭДТА. При необходимости получения обогащенной фракции нейтрофилов использовали градиент Перколла. В качестве стабилизатора клеток использовали альбумин человека. Опыты проводили в 96-луночных плашках с использованием Цитофлюориметра фирмы Appkied Biosystems. Регистрацию проводили для скополетина и дигидроксифеноксазина при длинах волн 360/460 и 590/645 соответственно. Активацию макрофагов осуществляли форболмиристил-ацетатом по методу, описанному Bozeman (Bozeman P.M., Learn D.B., Thomas E.I. Assay of a human leukocyte enzymes myelooperoxidase and eosinophil peroxidase. J. Immunol. Methods, 1990. Vol. 126. P. 125-132).

Определение антиоксидантной активности проводили в 96-луночных платах, в объеме 0,2 мл в культуральной среде, содержащей бычий сывороточный альбумин. Содержание клеток составляло 10× 10⁵ мл. Дигидроксифеноксазин растворяли в диметилсульфоксиде и добавляли в концентрации 1× 10^-4 M. Анализ флюоресценции проводили на Цитофлюориметре для 96-луночных плат при данных волн 360/460. Результаты учитывались по гашению флюоресценции.

Результаты исследования антиоксидантной активности предлагаемого соединения представлены на фиг.4.

По оси абсцисс - концентрация препаратов в μ М

По оси ординат - % гашения люминесценции

Кривая 1 - контроль.

Кривая 2 - 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонат натрия.

Как видно из данных, представленных на фиг.4, предлагаемое соединение обладает высокой активностью по действию на свободные радикалы кислорода, т.е. 83-84%.

Действие 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонат натрия на защиту клеток от оксидативного стресса, вызванного подавлением de novo синтеза глютатиона.

Известно, что устойчивость клеток животных и человека в значительной степени определяется синтезом de novo глютатиона. При нарушении синтеза глютатиона жизнеспособность клеток значительно снижается, так как они становятся чувствительными к эндогенному оксидативному стрессу, вызванному эндогенной продукцией свободных радикалов кислорода. Детально эти процессы исследованы в тестах на чувствительность мутантных фибробластов, выделенных у больных Атаксией Фридрейха. Особенность этой патологии состоит в том, что клетки этих больных высокочувствительны к воздействию свободных радикалов кислорода, что связано с мутацией в митохондриальном белке Фратаксине, кодирующемся ядерными генами (Badckock M., de Silva M., Oakss R., et al. Regulation ofmitochoondrial iron accumulation by Yfh Ip, a putative homolog of frataxin. S cience, 1997. Vol.276. P. 1709-1912). Блокада синтеза глютатиона обычно осуществляется с помощью ингибитора L - бутионина (S, R) - сульфоксимида. В присутствии этого ингибитора клетки активно реагируют на любое воздействие, способное вызвать оксидативный стресс. Этот подход на линии клеток MDCK был использован в тестах с соединением по изобретению. Для усиления генерирования свободных радикалов в культуральную среду добавляли ксантин, что приводило за счет индукции клеточной ксантиноксидазы к образованию синглетного кислорода. В данных экспериментах предстояло выяснить, возможна ли защита клеток в этих условиях с помощью 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия. Результаты этих исследований представлены на фиг.5.

По оси абсцисс - концентрация препаратов в мкг

По оси ординат - экстинкция при 550 нм

Кривая 1 - контроль.

Кривая 2 - каталаза.

Кривая 3 - 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонат натрия.

Как видно из полученных данных наиболее выраженной антиоксидантной активностью в условиях подавления синтеза глютатиона обладает заявляемое соединение. Его активность в защите клеток от оксидативного стресса была даже выше убихинона и приближалась к аналогу убихинона, известного под названием Идебенон (Lenaz G., Bovina С., D'Aurelio M., et al. Role of mitochondria in oxidative stress and aging, Ann. Of New York Acad. Of Sci, 2002.Vol.959. P. 199-213 Вalckock et al., 1997. Jauslin M.L., WirthTh., Meier Th., Schoumacher F. A cellular model for Friedreich Ataxia reveals small-molecule glutathione peroxidase mimetics as a novel treatment strategy. Human Mol. Gen., 2002. Vol.11. P.3055-3063).

Как видно из представленных данных (фиг.5), 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонат обладает выраженной способностью к защите клеток, как от эндогенного оксидативного стресса, так и от свободных радикалов, образующихся в культуральной среде, то есть вне клеток. Таким образом, предлагаемое соединение обеспечивает защиту клеток от оксидативного стресса даже при отсутствии синтеза глютатиона de novo, что свидетельствует о более сложном механизме действия этого препарата на клеточный метаболизм в условиях оксидативного стресса. Вероятной точкой приложения антиоксидантного действия соединения является участие в реакциях окисления-восстановления ФАД, аналогично убихинону. Причем данные процессы могут происходить как в плазме крови, так и на поверхности плазматических мембран клеток или в цитозоле (Morre D.J., Pogue R., Morre D.M. A multifunctional hydroquinone oxidase of the external cell surface and sera. Biofactors. 1999. Vol.9. P. 179-187).

Действие 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия на стабильность восстановленной формы рибофлавина.

Для получения данных об участии предлагаемого соединения в метаболизме клеток особый интерес представляли исследования их связи с метаболизмом жизненно важных витаминов, к каким относятся витамины группы В2, входящие в состав ферментов в качестве кофакторов, вовлеченных в транспорт электронов в митохондриальной цепи окислительного фосфорилирования на границе доноров восстановительных эквивалентов и электронов. Ключевое место в этой цепи занимают ФАД (флавинаденин-динуклеотид) и НАДФ (никотинамидаденин-динуклеотидфосфат) - зависимые ферменты и убихинон. Последний, в свою очередь, является донором электронов цитохрому b - первому в цепи митохондриальных цитохромов (схема 1). Поэтому были проведены спектрофотометрические исследования по изучению окисления и восстановления рибофлавина и влияние 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия на эти процессы. В результате проведенной работы был изучен механизм действия препарата на уровне рибофлавина и его стабилизации в восстановленном состоянии.

Рибофлавин является слабым основанием способным вступать в обратимые окислительно-восстановительные реакции с 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонатом натрия, являющимся слабой кислотой. Причем известен тот факт, что этому способствует свойство пиридиновых циклов, лежащих в основе рибофлавина, к образованию комплексных соединений значительной устойчивости с группами типа SO₃.

R=N - окисленная форма рибофлавина.

R=NH - восстановленная форма рибофлавина.

R=O - окисленная форма 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия.

R-OH - восстановленная форма 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия.

Создается своего рода окислительно-восстановительная емкость. Свободные радикалы и иные сильные окислители переводят рибофлавин в форму R=N, а 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонат натрия не только их поглощает, но и обладает способностью восстанавливать его исходную форму.

Восстановление рибофлавина значительно ускоряется в кислой среде в условиях избытка Н+. Конкретные механизмы окисления-восстановления могут быть описаны в рамках представленной ниже схемы.

Схема 1. Окислительно-восстановительный переход рибофлавина в присутствии соединений типа дигидрохинонов.

3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонат натрия (на рисунке представлен в виде модельного ядра дигидрохинона, слева) восстанавливает рибофлавин через промежуточный комплекс, который, как уже указывалось, активнее образуется в кислой среде. Возможно участие в этом процессе катализаторов или посредников - переносчиков (Baum E.Z., Ding W.D., Siegel M.M., et al. Flavins inhibit cytomegalovirus UL 80 protease via disulfide bond formation. Biochemistry, 1996. Vol.35. P.5847-5855).

Предлагаемое соединение является функциональным стабилизатором флавин-содержащих ферментов и витаминов.

Кроме этого, известно, что при большинстве патологических процессов и воспалении в условиях нарушения клеточного дыхания развивается ацидоз. Фармакологические препараты со свойствами 3,6-диоксоциклогекса натрия в этих условиях способны активно восстанавливать кофакторы клеточных и митохондриальных ферментов, обеспечивая тем самым поддержание их активности при развитии патологических процессов.

На основании антиоксидантных свойств 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонат натрия его применили для стабилизации витаминов в пищевых продуктах, так как при длительном хранении пищевых продуктов, безалкогольных напитков, соков или сиропов наблюдается как снижение буферной емкости, так и падение рН.

Проверяли добавки к пищевым продуктам 3,6-диоксоциклогексана-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия в количестве 0,025-50%. Этим добивались стабилизации витаминов, не боясь токсичности (низкая величина LD₅₀), не боясь вызвать аллергию. Органолептические свойства продуктов не изменялись. Добавки больших количеств заявляемого соединения помимо стабилизации витаминов придавали пищевым составам антиоксидантные свойства (по типу аскорбиновой кислоты).

Окислительно-восстановительные реакции лежат в основе большинства патологических процессов. При них и при воспалении в условиях нарушения клеточного дыхания развивается ацидоз.

На фиг.6 представлена энергетическая кривая, характеризующая потенциалы электронно-транспортной цепи митохондрий, где указано положение убихинона и ФАД-простетической группы сукцинатдегидрогеназы, имеющей ядро рибофлавина в активном центре. Эти данные позволяют осмыслить механизм происходящих процессов.

УХ - убихинон

ФМН - флавинмононуклеотид

в, С₁, а₂, а₃ - цитохромы

О₂ - кислород

В состав флавиновых дегидрогеназ входят флавиновые нуклеотиды, прочто связанные с апоферментом и не отщепляющиеся от него ни на одной стадии каталитического цикла. Окислительно-восстановительные свойства флавопротеинов обусловлены способностью изоаллоксазинового кольца рибофлавина к обратимому переходу из окисленного состояния в восстановленное, при котором происходит присоединение к кольцу двух электронов в составе атомов водорода (схема 1). При изучении дыхательных цепей особенно интересны два связанных с мембраной флавопротеина: сукцинатдегидрогеназа, катализирующая окисление сукцината и НАД(Ф)-Н₂-дегидрогеназа, катализирующая восстановление своей флавиновой простетической группы, сопряженное с окислением НАД(Ф)× Н₂.

Участие в электронном транспорте в дыхательной цепи принимают белки, содержащие железосеро-центры (подразумевается координационная связь атомов железа с сульфгидрильными группами цистеина). Они входят в состав некоторых флавопротеинов, например сукцинат- и НАД(Ф)-Н₂-дегидрогеназ, или же служат в качестве единственных простетических групп белков. Дыхательные цепи содержат большое число FeS-центров. В митохондриальной электронно-транспортной цепи функционирует, вероятно, порядка десяти таких белков, а ключевые ферменты цепи окислительного фосфорилирования указаны на фиг.6. В зависимости от строения FeS-центры могут осуществлять одновременный перенос 1 или 2 электронов(е), что связано с изменением валентности атомов железа.

Как уже указывалось, хиноны - жирорастворимые соединения, имеющие длинный терпеноидный “хвост”, связанный с хиноидным ядром, способным к обратимому окислению-восстановлению путем присоединения двух атомов водорода. Наиболее распространен убихинон, функционирующий в дыхательной цепи на участке между флавопротеинами и цитохромами.

В отличие от остальных электронных переносчиков хиноны не связаны со специфическими белками. Небольшой пул убихинона растворен в липидной фазе мембран и поэтому его оборот в условиях нарушения окислительно-восстановительных процессов играет критическую роль в нарушении тканевого дыхания (Северин Е.С. с соавт., Биохимия, М., Медицина, 2000, стр.78).

Цитохромы, принимающие участие на заключительном этапе цепи переноса электронов, представляют собой группу белков, содержащих железопорфириновые простетические группы (гемы). С помощью цитохромов осуществляется перенос электронов, в процессе которого меняется валентность железа:

Fe²⁺<<Fe³⁺+e^-

В митохондриях цепь транспорта электронов и окислительного фосфорилирования включает в себя пять цитохромов (b, с, c₁, а, а₃), различающихся между собой спектрами поглощения и окислительно-восстановительными потенциалами. Различия по этим параметрам обусловлены белковыми компонентами цитохромов, природой боковых цепей их порфиринов и способом присоединения гема к белкам. Терминальные цитохромы (а+а₃) передают электроны на молекулярный кислород, представляя собой собственно цитохромоксидазу, в реакционном центре которой содержатся помимо двух гемов два атома меди. Образование воды имеет место при переносе на молекулу кислорода четырех электронов. Цитохромоксидазы осуществляют перенос на O₂ только двух электронов, следствием чего является возникновение перекиси водорода. Перекись водорода далее разрушается каталазой или пероксидазой, что отражено на схеме строения и функционирования цепи транспорта электронов митохондрий клеток животных и человека (фиг.6).

ФАД - простетическая группа сукцинатдегидрогеназы; УХ - убихинон; b, с, c₁, а, а₃ - цитохромы.

Сплошными линиями обозначены процессы, протекающие в мембране; прерывистыми - в цитозоле клетки; зигзагообразной линией показаны места действия ингибиторов транспорта электронов.

Таким образом, дыхательная цепь переноса электронов в митохондриях состоит из большого числа промежуточных переносчиков - цитохромов, осуществляющих электронный транспорт с органических субстратов на О₂, а убихинон локализован в самом начале этой цепи.

Ключевое соединение 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонат натрия близко к природным хинонам, и в частности к убихинону по своей структуре. На фиг.7 приводятся структурная формула 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната и его модель, полученная с использованием программы “Alchemie”. На шариковой модели соединения видно, что атомы кислорода располагаясь по окружности молекулы легко доступны к взаимодействию с молекулами воды, катионов и окислительно-восстановительных ферментов.

На фиг.7:

Черные шарики в центре - атомы углерода (бензольные кольца). (1)

Серые - атомы серы. (2)

Черные - атомы кислорода. (3)

Темно-серые - атомы водорода. (4)

Представлен вид вдоль длинной оси.

Данный препарат проявляет высокую активность в качестве “скэвенджера” свободных радикалов и так же, как коэнзим Q₁₀, обеспечивает повышение эффективности транспорта электронов в дыхательной цепи и инактивацию свободных радикалов при нарушении клеточного дыхания и гипоксии. Именно эта функция 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия представляется наиболее важной для объяснения его антиоксидантных свойств.

Действие 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия на стабильность рекомбинантного интерферона альфа-2

Одна из проблем работы с рекомбинантными белковыми препаратами состоит в их невысокой стабильности. С одной стороны, рекомбинантные белки быстро подвергаются окислению кислородом воздуха, а, с другой стороны, в частично денатурированном состоянии быстро агрегируют. Как окисление, так и агрегация приводит к их инактивации.

Вместе с тем, многие рекомбинантные белки используются в настоящее время в составе так называемых наружных лекарственных формах: свечах, мазях, кремах, гелях. Это приводит к тому, что данные препараты непосредственно взаимодействуют с кислородом воздуха и достаточно быстро инактивируются при хранении. Окисление белков преимущественно осуществляется по сульфгидрильным группам цистеина и метионина. Окисление остатков цистеина приводит к частичной денатурации белка, что, в свою очередь, делает их более чувствительными к протеолизу. В связи с этим, для стабилизации рекомбинантного интерферона-альфа-2 применяется в составе свечей витамин Е. Ранее разработан состав вагинальных свечей с добавлением ε -аминокапроновой кислотой и рибофлавином (Айламазян Э.К., Киселев В.И., Юрьев М.З., Киселев О.И. Патент РФ №2180593). Эти компоненты имеют двойное назначение. С одной стороны, аминокапроновая кислота является ингибитором протеаз, а, с другой стороны, обладает слабыми антиоксидантными свойствами. Оба эти свойства направлены на защиту и стабилизацию основного действующего компонента свечей - интерферона-альфа-2.

Однако в равной степени активность дополнительных компонентов направлена на ингибирование вирусных и клеточных протеаз и инактивацию свободных радикалов, генерирующихся в очаге воспаления.

Вместе с тем, в отношении стабилизации рекомбинантных препаратов антиоксидантные свойства 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия особенно привлекательны. Соединение было испытано на влияние на стабилизацию рекомбинантных белков. Учитывая низкую токсичность соединения, такое соединение совместимо как с наружными лекарственными формами, так и инъекционными.

Проведенные исследования стабилизации рекомбинантного α -2-интерферона новым соединением показали хорошие результаты.

На фиг.8 представлены данные по изучению влияния 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия на стабильность препарата, содержащего рекомбинантный 1-2-интерферон в течение 2-х недель при температуре +5° С. Кривая 1 - хранение препарата с добавлением 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия. Кривая 2 - хранение препарата без каких-либо стабилизаторов. Ось абсцисс - дни, ось ординат - биологическая активность в ME.

Как видно на фиг.8 соединения 1 обладает значительной стабилизирующей способностью на препарат рекомбинантного α -2-интерферона. Это позволяет рекомендовать его для стабилизации рекомбинантных препаратов белков человека и, в частности, α -2-интерферона.

Пример проявления антиоксидантных свойств 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия (применение в пищевой композиции).

Сухой витаминизированный напиток - композиция, в состав которой входит рибофлавин (витамин В₂), проверяли на сохранение активности рибофлавина при хранении (влияние кислорода воздуха, ультрафиолетового облучения, дневного света, температуры воздуха. Один состав был без добавки 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия (контрольные образцы); другой состав содержал вещество по изобретению.

Количество рибофлавина в композиции - 0,025%

Количество 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия в композиции - 0,025%.

Условия хранения композиции: ускоренное старение - 7 дней, длительное старение - 180 дней, температура хранения - +38° С, использовали УФ-облучение и воздействие открытых солнечных лучей.

Определение количественного содержания рибофлавина в образах напитков проводили по ГОСТ 7047-55. Органолептические испытания по ГОСТ 66875-86.

В результате проведенных исследований было установлено, что при хранении образцов напитков с рибофлавином и 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонатом натрия, содержание рибофлавина снизилось на 1,65 мг, в контрольных образцах, не содержащих заявляемое соединение, - на 2,45 мг, что на 16% больше, чем в образцах с предлагаемым по изобретению средством (таблица 1).

   Содержание рибофлавина в образце, мг Режим хранения при:Наименование исследуемого образцаМасса образца, гВремя хранения, суткиИсходный образец В2 мгтемпературе 38° Сультрафиолетовом облученииоблучении солнечными лучами (световой день)Сухой витаминизированный напиток с рибофлавином и 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонат натрия20,075,04,353,904,55Сухой витаминизированный напиток с рибофлавином без 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия20,075,03,553,854,55

Хранение образцов напитков с рибофлавином более 90 дней приводило к частичным изменениям органолептических показателей: цвет и вкусовые качества (при хранении без предлагаемого по изобретению средства).

Хранение образцов напитков с добавлением 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия не приводило к изменениям как количественным - по рибофлавину, так и органолептических показателей в указанные сроки.

Пример. К сухим компонентам фруктовых соков для приготовления напитков прибавили сухой 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия в соотношении (в весовом):

сухие фруктовые экстракты: заявляемое средство - 1:0,5.

Проверка хранения по требованиям ГОСТа показала, что органолептические показатели (цвет, вкусовые качества) не изменились. 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия при хранении практически не изменился.

Из испытаний однозначно установлено, что новое соединение 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонат натрия является антиоксидантом (антиокислителем), приемлемым из-за низкой токсичности в пищевой промышленности.

Противовирусная активность 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия.

Противовирусную активность заявляемого соединения исследовали на модели гриппозной инфекции мышей. Мышей заражали 1-кратной смертельной дозой вируса. Препарат вводили перорально в дозе 30 мг/кг. Данные по определению противовирусной активности суммированы в таблице 2.

Таблица 2Активность 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия в отношении летальной гриппозной инфекции мышей, вызванной вирусом гриппаПрепаратСхемаДоза мг/кг разовая суммарнаяУчет при гибели животных   79%>70%   % павшихиндекс защиты% павшихиндекс защиты3,6-диоксо-цикло-гекса-Профилактическая30/6063,1±11,42584,2±8,610
-1,4-диен-1,2,4,5-Лечебная30/12065,0±10,92385,0±8,210
-тетрасульфонат натрияСтандартная
5 дней30/15025,0±9,970
+++80,0±9,216 Стандартная
5 дней30/15025,0±9,967
+++75,0±9,911 Стандартная
7 дней30/21025,0±9,964
+++60,0±10,933
+ Стандартная
5 дней60/3005,0± 5,098
++++35,0±10,963
+++

Таким образом, дополнительным свойством 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфоната натрия является противовирусная активность.

Противовирусную активность можно отнести за счет влияния на начальные стадии репликативного цикла вирусов гриппа и, в частности, на взаимодействие с клеточными рецепторами и (или) на лизосомальный этап декапсидации вирионов. Можно предположить, что в растворе идет образование многомерных структур. Тогда водные растворы будут более активны в отношении вирусной инфекции.

Уникальность данного соединения в первую очередь проявляется в его исключительных антиоксидантных свойствах. В связи с уникальной структурой систем π -связей данное соединение отличается тем, что проявляет более высокую по сравнению с убихиноном антиоксидантную активность, преимуществом синтезированного соединения является его водорастворимость. Полученный новый антиоксидант обладает высокой биодоступностью и активным влиянием на ферменты цитоплазмы клеток и межклеточной жидкости.

Противовирусная активность заявляемого средства позволяет рекомендовать его для защиты от вирусной гриппозной инфекции.

Изобретение относится к биологически активным соединениям. Средство представляет собой 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонат натрия. Новое средство обладает антиоксидантными свойствами, что делает его применимым в пищевой промышленности, в фармацевтических композициях, в косметической продукции. Также новое средство обладает противовирусной активностью, благодаря чему может использоваться как самостоятельное лекарственное средство, так и в композициях с другими препаратами для лечения вирусных инфекций. Технический результат заключается в расширении арсенала лекарственных средств и антиоксидантов, а также в реализации указанного назначения. 8 ил., 2 табл.

Средство, проявляющее антиоксидантную и противовирусную активности, представляющее собой 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфонат натрия.