СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ B И B В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ Российский патент 1997 года по МПК G01N27/48 

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к инверсионному вольтамперометрическому способу определения водорасторимых витаминов B₁ B₂ в пищевых продуктах.

Витамины B₁ /тиамин; 4-метил-5- β -оксиэтил-N-/2-метил-4-амино-5-метилпиримидил/-тиазолий бромид /или хлорид/ / и B₂ /рибофлавин; 6,7-диметил-9-/ D -1-рибитил/-изоаллоксазин/ необходимы для нормальной жизнедеятельности организма. Они входят в состав сложных биокатализаторов, выполняющих различные функции в процессе обмена веществ. Важнейшие вещества такого рода активны физиологически в малых дозах и поступают в организм человека вместе с пищей.

Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов характеризуют пищевую ценность большинства видов и групп продуктов детского питания различного назначения на содержание водорастворимых витаминов B₁ и B₂ в диапазоне 0,4- 1,3 и 0,6-2,7 мг соответственно на 100 г съедобной части продукта [1] В справочных таблицах [2, 3] величины показателей пищевой ценности продуктов колеблются в очень широких пределах и определяются по некоторым видам продуктов минимальным содержанием витаминов B₁ 0,01 мг/100 г и B₂ 0,02 мг/100 г.

С каждым годом расширяется ассортимент и увеличивается производство продуктов питания, совершенствуется рецептура детского питания. Это в свою очередь предъявляет повышенные требования к контролю за качеством выпускаемой продукции и совершенствованию методов определения витаминов.

Широкое распространение при определении водорастворимых витаминов получили различные варианты хроматографии [4, 5] В последнее время наибольшее применение для анализа тиамина и рибофлавина за рубежом получил метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Этим методом проанализировано содержанием витаминов B₁, B₂, B₆, B₁₂ в 248 образцах питьевых молочных продуктах [6] Для увеличения чувствительности определения витаминов используют спектрофотометрическое, флюориметрическое и электрохимическое детектирование. Для разделения витаминов применяют обращенно-фазный, ион-парный и ионообменный варианты ВЭЖХ. Несмотря на высокую чувствительность метода ВЭЖХ (до 10^-3-10^-4 мг/100 г), длительность анализа с учетом времени пробоподготовки, а также высокая стоимость приборов, существенно ограничивает его использование в контроле пищевых продуктов. В нашей стране исследованию витаминов этим методом посвящено небольшое число работ [7]
Используемые в настоящее время методики количественного определения витаминов B₁ и B₂ в продуктах питания, рекомендуемые нормативами документами, включают множество вариантов оптических методов. Для определения тиамина используют, как правило, флюорометрический метод [8] основанный на окислении тиамина в щелочной среде железосинеродистым калием с образованием сильнофлюоресцирующего в ультрафиолетовом свете соединения тиохрома (максимум возбуждения при 365 нм и максимум флюоресценции при 436 нм), интенсивность флюоресценции которого прямо пропорциональна содержанию тиамина. Свободный рибофлавин и продукт его фотолиза люмифлавин обладают характерной желто-зеленой флюоресценцией при облучении их растворов светом с длиной волны 440 500 нм. Метод применяется в двух вариантах. Один из них вариант прямой флюориметрии основан на определении интенсивности флюоресценции до и после восстановления рибофлавина гидросульфитом натрия. Второй вариант - люмифлавиновый основан на использовании свойства рибофлавина при облучении в щелочной среде переходить в люмифлавин, интенсивность флюоресценции которого измеряют после извлечения его хлороформом [8, 9]
Наиболее перспективным методом определения витаминов B₁ и B₂, на наш взгляд, является вольтамперометрический метод, и в первую очередь такие его высокочувствительные варианты, как инверсионная вольтамперометрия (ИВ). Преимущество ИВ благодаря высокой чувствительности (область определяемых содержаний витаминов на уровне 10^-3-10^-4 мг/100 г), состоит в возможности работы с малыми по массе и объему пробами с высокой экспрессностью, селективностью и разрешающей способностью. Большинство опубликованных работ по анализу пищевых продуктов этим методом посвящено определению тяжелых и токсичных металлов. Для определения витаминов B₁ и B₂ в пищевых продуктах он ранее не применялся. И как, совершенно справедливо отмечено [10] это, по-видимому, объясняется отставанием аналитической практики пищевых продуктов и недостатком аппаратурного оснащения лабораторий это отрасли.

Так как в пищевых продуктах тиамин и рибофлавин могут находится в свободном состоянии и в виде фосфорных эфиров, связанных с белком (тиаминпирофосфата ТПФ), являющимся коферментной формой тиамина, или в виде флавиновых коферментов рибофлавина: флавинадениндинуклеотида (ФАД) и флавинмононуклеотида (ФМН), то для количественного химического анализа (КХА) таких веществ необходимо разрушение этих связей и выделение определяемых компонентов из матрицы. Поэтому одной из основных проблем применения любого из вышеперечисленных инструментальных методов анализа является установление условий выделения витаминов из матрицы до проведения собственно физико-химического анализа.

Наиболее близким способом освобождения тиамина и рибофлавина из связанного состояния является гидролиз [9] (прототип). Сущность метода основана на кислотном и ферментативном гидролизе связанных форм витаминов. Гидролиз проводят сначала 0,1 M HCl при кипячении пробы на водяной бане в течение 40 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры и проводят ферментативный гидролиз при длительном (более 16 часов) воздействии протеолитических и фосфатазных ферментов, установив предварительно величину pH 4,2-4,5. Анализ затрудняется наличием в ряде объектов веществ, обладающих флюоресценцией. Маскируя флюоресценцию, эти вещества искажают результаты КХА и делают невозможным проведение определения без специальных обработок проб. Удаляют мешающие соединения, пропуская гидролизат через колонки с ионнообменными смолами. Для удаления мешающего влияния пигментов проводят их окисление марганцевоксилым калием. После очистки гидролизата ведут окисление тиамина в тиохром с последующим измерением интенсивности флюоресценции при длинах волн 320-390 нм возбуждающего и 400-580 нм излучаемого света. Для перевода рибофлавина в люмифлавин, очищенный от пигментов гидролизат облучают светом, затем проводят экстракцию люмифлавина хлороформом и только потом проводят измерение интенсивности флюоресценции при длинах волн 360-480 нм возбуждающего и 510-650 нм излучаемого света.

Как видно из условий, приведенных в прототипе, определение тиамина и рибофлавина по ГОСТ 25999-83 требует больших трудозатрат: большого числа операций КХА, реактивов (более 20 наименования) и дорогостоящих ферментов. Методики чрезвычайно длительны (полное определение одного витамина занимает по времени более 2 3 суток). Результаты анализа плохо воспроизводимы.

В данных условиях экспрессное количественное определение водорастворимых витаминов B₁ и B₂ на уровне требований, определяемых нормативными документами 10^-1-10^-2 мг/100 г невозможно.

Для вольтамперометрического анализа часто допустимы более простые методики предварительного выделения соединений, чем флуориметрические или хроматографические. Предварительная подготовка проб также может быть существенно уменьшена из-за возможности проведения вольтамперометрических измерений в мутных и окрашенных растворах как в водных, так и в неводных средах.

Задачей заявляемого изобретения является повышение экспрессности, селективности и точности определения витаминов B₁ (тиамина) и B₂ (рибофлавина) в пищевых продуктах методом инверсионной вольтамперометрии.

Поставленная задача достигается тем, что проводят гидролиз связанных форм витаминов и белка, осаждение водорастворимого белка из гидролизата с последующим инверсионно-вольтамперометрическим определением витаминов. Новым в способе является то, что проводят кислотный гидролиз (0,15-0,20) M раствором H₂SO₄ или HCl на кипящей водяной бане в течение 30 40 минут, после охлаждения гидролизата проводят осаждение водорастворимого белка (0,4-0,5) г хлорида марганца 4-водным, затем 2-3 г хлорида калия с последующим инверсионно-вольтамперометрическим определением витаминов в безбелковом гидролизате путем регистрации катодных пиков витамина B₁ при потенциалах (0,35-0,48)B (E_э -0,15 B), анодных пиков витамина B₂ в диапазоне потенциалов (0,15-0,20)B и E_э -(0,50-0,60)B в режиме дробного дифференцирования.

В прототипе описано проведение гидролиза сначала 0,10M раствором HCl, затем протеолитическими и фосфатазными ферментами в течение более 16 20 часов. Для определения витаминов ИВ способом использование ферментов значительно снижает экспрессность анализа и делает невозможным проведение вольтамперометрического определения. Предлагаемые в заявляемом изобретении условия гидролиза (0,15-0,20) M H₂SO₄ или HCl при кипячении в течение 30 40 минут позволяют селективно и экспрессно определять водорастворимые витамина B₁ и В₂ с хорошей воспроизводимостью. Относительное стандартное отклонение Sr не превышает 0,2 для концентрации определяемых веществ 0,1 мг/100 г. Тиамин и рибофлавин, вероятно, можно было бы определять методом ИВ и без их выделения из основы в отсутствии больших количеств белковых примесей. Присутствие значительных количеств белка в пищевых продуктах мешает ИВ определению витаминов, т.к. белки являются электрохимически активными, хорошо адсорбируются на электродных материалах и могут участвовать в редокс-превращениях [11] что затрудняет ИВ анализ и приводит к завышенным показателям содержания витаминов в пробах. Для устранения мешающего влияния белков, разрушения связанных форм витаминов и распада белков на более простые составные части в предлагаемом способе гидролиз проводят (0,15-0,20) М H₂SO₄ или HCl. Концентрации кислот и время гидролиза /t/ (равное 30-40 минутам) подобраны экспериментально. Абсолютной новизной является экспериментально подобранный реагент H₂SO₄. Использование кислот с молярной концентрацией C<0,15 М ухудшает условия гидролиза, а при C>0,20 М ухудшаются условия ИВ определения из-за большого значения остаточного тока, связанные с выделением водорода на индикаторном стеклоуглеродном электроде. Оптимальным временем гидролиза является 30-40 минут. При t>40 минут снижается экспрессность анализа, а при t<30 минут ухудшаются условия проведения гидролиза.

Другим отличительным признаком являются установленные условия осаждения остаточных количеств растворимого белка из гидролизата (в прототипе осаждение не применяли). Необратимое осаждение белка проводили солями тяжелых металлов (Pb²⁺, Cu²⁺, Ag⁺, Fe²⁺, Mn²⁺ и др.). При этом вместе с белками выделялись и их комплексные соединения с фенольными веществами и сахаридами, что обеспечивало оптимальные условия проведения электродного процесса. В предлагаемом способе впервые в качестве осадителя выбрана соль MnCl₂• 4H₂O в количестве 0,40-0,50 г. Ранее для отделения белка соль MnCl₂-4H₂O не применялась. Использование больших количеств соли />0,5 г/ повышает растворимость белка, по-видимому, за счет протекания адсорбционной пептизации, и ухудшаются условия проведения электродного процесса, особенно при определении тиамина. При массе соли <0,45 г ухудшаются условия осаждения органических примесей. После отделения осадка центрифугированием проводили вторичное осаждение следов белка из центрифугата с помощью нейтральных солей KCl и (NH₄)₂SO₄ (высаливание следов белковых примесей). Хлорид калия осаждал белки слабее, чем сульфат аммония, вследствие меньшей дегидратирующей способности, которая характеризуется положением ионов в ряду Гофмейстера. Однако применение сульфата аммония ухудшало воспроизводимость и точность электроанализа. Использование KCl способствовало стабилизации условий проведения электродного процесса, повышало точность и воспроизводимость КХА методом ИВ. Масса используемой соли KCl также установлена экспериментально. Использование больших количеств соли KCl />3 г/ понижало электрическую проводимость раствора и ухудшало условия проведения электродного процесса. Уменьшение концентрации соли /<2 г/ ухудшало условия осаждения. Осадок белка мог вновь частично раствориться при стоянии пробы или после разведения пробы водой.

Важным для определения водорастворимых витаминов методом ИВ является выбор фонового электролита. В предлагаемом способе применение дополнительного электролита в качестве фона не требуется. Анализируемый раствор после осаждения белков имеет оптимальное значение pH для ИВ определения, обладает хорошей электропроводностью и поэтому сразу подвергается вольтамперметрированию. Определение тиамина проводят методом катодной ИВ с использованием ртутно-пленочного индикаторного электрода, рибофлавина - адсорбционной ИВ на стеклоуглеродном электроде в режиме дробного дифференцирования. Вольтамперограммы регистрируют при максимальных значениях потенциала -(0,35-0,48)В и -(0,15-0,20)В соответственно для витаминов B₁ и B₂. Метод ИВ для определения водорастворимых витаминов B₁ и B₂ в пищевых продуктах ранее не применялся. Массовую долю витамина в пробе вычисляют в мг/100 г по формуле:

где X₁ содержание данного компонента в анализируемой пробе, мг/100 г;
C_д концентрация аттестованной смеси /АС/ витамина, из которой делается добавка к анализируемой пробе, мг/см³;
V_д объем добавки АС витамина, см³;
J₁ величина максимального тока компонента в анализируемой пробе, А;
J₂ величина максимального тока компонента в пробе с добавкой АС, А;
V_ал объем аликвоты пробы, взятой для анализа, см³;
V_к объем анализируемого раствора после гидролиза, см₃;
m_пр. масса анализируемого вещества, г.

Установленные условия анализа в предлагаемом способе впервые позволили экспрессно (за 1,5-2 часа) количественно определять витамины B₁ и B₂ в пищевых продуктах (таблица 1,2) на уровне 0,01-0,02 мг/100 г в присутствии пигментов, в окрашенных средах без предварительного отделения других водорастворимых витаминов группы B, PP, аскорбиновой, фолиевой, никотиновой, лимонной кислот, триптофана, мочевины, цистина, цистеина, ионов PO3-4

Пример 1.

Определение витамина B₁ (тиамина) в детской молочной смеси "Семилко".

Навеску пробы массой 10 г переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³ добавляют 92 см₃ 0,15 М HCl и нагревают с воздушным холодильником на кипящей водяной бане в течение 30 минут.

Затем охлаждают до температуры -30^oC и добавляют 0,5 г MnCl₂•4H₂O, центрифугируют на лабораторной медицинской центрифуге в течение 20 минут со скоростью 3000 оборотов в минуту. Центрифугат сливают в стакан и добавляют 3 г KCl. Полученный осадок отфильтровывают через бумажный фильтр. Аликвоту фильтрата объемом 10 см³ помещают в электролизер и проводят вольтамперометрические измерения при условии: потенциал электролиза E_э=-0,10 В, время электролиза τ_э= 180 с, скорость развертки потенциала W=20 мВ/с. Катодный пик витамина регистрируют с использованием ртутно-пленочного электрода в диапазоне потенциалов -(0,45-0,48) B при чувствительности прибора 2•10^-9 A/мм. Содержание вещества оценивают методом добавок аттестованных смесей. Время анализа одной пробы не превышает 2 часа.

Пример 2.

Определение витамина B₁ (тиамина) в рябиновом соке.

Навеску пробы массой 50 г переносят в мерную колбу вместимостью 250 см², добавляют 50 см³ обессоленной воды, 0,15 см³ концентрированной H₂SO₄ и нагревают с воздушным холодильником на кипящей водяной бане. Затем охлаждают до температуры 30^oC, добавляют 0,5 г MnCl₂•4H₂O и центрифугируют в течение 20 минут со скоростью 3000 оборотов в минуту. Центрифугат сливают в стакан и добавляют 3 г KCl. Выпавший осадок отфильтровывают через бумажный фильтр. Аликвоту фильтрата объемом 10 см³ помещают в электролизер и проводят вольтамперометрические измерения при условии: E_э -0,10 B, τ_э= 180 с W 20 мВ/с. Катодный пик витамина регистрируют при потенциале -(0,35-0,40)В и чувствительности прибора 1•10^-9 А/мм. С одержание вещества оценивают методом добавок аттестованных смесей. Время анализа одной пробы менее двух часов.

Пример 3.

Определение витамина B₂ (рибофлавина) в пюре из яблок, вишни, моркови.

Навеску пробы массой 25 г переносят в колбу вместимостью 500 мл, добавляют 75 см³ 0,15 M HCl и осторожно кипятят с обратным холодильником на плитке (температура плитки 140 150^oC) в течение 30 40 минут. Затем в охлажденную до комнатной температуры смесь вносят 0,45-0,50 г MnCl₂•4H₂O и центрифугируют на лабораторной медицинской центрифуге со скоростью3000 оборотов в минуту в течение 15 минут. В собранный центрифугат вносят 2,5 г HCl и оставляют на 5-10 минут, после чего осадок отфильтровывают. В полярографически чистый кварцевый стаканчик объемом 20 см³ вносят 1 см³ фильтрата, доводят объем обессоленной водой до 10 см³. Стаканчик с раствором для анализа помещают в электролитическую ячейку и проводят съемку вольтамперограмм при условии: E_э -0,6 B, τ_э= 120 с использованием игольчатого стеклоуглеродного индикаторного электрода. Анодный пик витамина регистрируют при потенциале -(0,15-0,17)В. Содержание вещества оценивают методом добавок аттестованных смесей. Время анализа одной пробы не превышает 1,5 часа.

По предлагаемому способу проведена метрологическая аттестация способа количественного химического анализа (КХА) проб овощей и фруктов, продуктов их переработки, продуктов детского питания, включая молочные смеси и крупы, на содержание массовых концентраций витамина B₁ (тиамина) и витамина B₂ (рибофлавина) методом инверсной вольтамперометрии.

Метрологическая аттестация проведена с целью установления приписанных характеристик погрешности результатов анализа, а также для назначения нормативов контроля точности.

В качестве приписанной характеристики погрешности результата анализа приняты границы интервала (нижняя Δ_н верхняя Δ_в), в которых погрешность результата анализа находится с принятой вероятностью P, то есть Δ_н, Δ_в, P. Значение характеристики погрешности результатов анализа устанавливается расчетным способом по полученным значениям характеристик случайной и систематической составляющих погрешности результатов методики анализа.

В качестве характеристики случайности составляющей погрешности результата анализа принимают наибольшее возможное значение среднего квадратного отклонения случайной составляющей погрешности (показатель воспроизводимости - ).

В качестве характеристики систематической составляюей принимают границы интервала ( Δ_с,н; Δ_с,в ), в которых не исключенная систематическая составляющая погрешности находится с принятой вероятностью P.

При симметричности оцениваемых параметров (Δ_н, Δ_в) используют следующую форму представления результатов анализа:
(x± Δ)•P)
Для доказательства правильности результатов анализа по предлагаемому способу и оценки показателя правильности, т.е. характеристики систематической составляющей погрешности, использованы следующие методы:
а) метод "введено-найдено" в варианте сравнения со стандартным образцом или аттестованной смесью;
б) метод "введено-найдено" в варианте метода добавок АС в пробу.

Методы "введено-найдено" использованы правомерно, поскольку в процессе разработки методики установлено, что влияющие факторы пробы не оказывают значительного вклада в погрешность способа.

Значение характеристики общей погрешности установлено расчетным путем по значениям характеристик случайной и систематической составляющих погрешности.

Установлены виды зависимостей характеристик общей погрешности и ее составляющих (показатели, сходимости, воспроизводимости и правильности) от содержания компонента в пробе для всего диапазона определяемых содержаний (таблицы 3, 4).

Указанные уравнения могут быть рекомендованы для внесения в пропись методик и в свидетельства об аттестации для расчета приписанных характеристик погрешности и ее составляющих в различных диапазонах определяемых содержаний в виде таблиц, приведенных ниже (таблицы 3 6).

Все вычисления и обработка результатов анализа проводились с помощью ЭВМ по программам, составленным согласно программе аттестации МКХА и защищенным Российским агентством по правовой охране программ для ЭВМ, без данных и технологий интегральных микросхем (РосАПО) свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ N 950112 от 24.03.95 г.

Таким образом, сравнение характеристик КХА определения витаминов B₁ И B₂ в пищевых продуктах (таблицы 7, 8) по предлагаемому способу и прототипу позволил сделать вывод, что ИВ способ существенно улучшил метрологические характеристики анализа. Значительно повысилась экспрессивность и точность. Время проведения анализа по предлагаемому способу сократилось практически в 36-40 раз и составляет менее двух часов (против 2-3 суток). Предложенный способ прост, не требует больших трудозатрат, большого количества реактивов (см. таблицы 7, 8) по сравнению с прототипом и может быть применен в любой химической лаборатории, особенно в настоящее время, когда налажен выпуск отечественных полярографов. Предлагаемый способ может быть использован для определения других водорастворимых витаминов и органических веществ в пищевых продуктах различного назначения, кормах для животных, а также может служить основой для создания диагностической системы витаминного метаболизма.

Источники информации.

1. Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов. -М. Минздрав СССР, 1989.

2. Химический состав пищевых продуктов. -М. Агропромиздат, 1987.

3. Химический состав пищевых продуктов. //Стандарты и качество,1994,N 8.

4. Sam K.C.Patricia Rayas-Duarte, Edna Holm, and Clarence MeDonald. Food.//Anal.Chem.-1993.-Vol.65,p.334-363.

5. Favell Derek. Natritional analysis-vitamins and minerals //Food Sci and Technol.-1988, v.2, N 3, p. 199-200. Today.

6. LauKkanen Marjukka, Antila Pirkko, Antila Veijo Salminen Kari// Meijeritieteell aikak. 1988.Vol 46, N 1, p.7-24.Цит. по РЖХим. 1989.-5P1299.

7. Ульянова С.В. Шавлинский А.Н. Морев С.Н. Дмитриенко Т.М, Финкельштейн Е. И. Анализ водорастворимых витаминов B₁, B₂, B₆ и никотинамида в драже "Гексавит" методом ВЭЖХ//Фармация. 1993, т. 42, N 3, с. 50-51.

8. Химический состав пищевых продуктов. -М. Легкая промышленность. 1984, с.320.

9. ГОСТ 25999-83. Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витаминов B₁ и B₂. -М.Госкомитет СССР по стандартам, 1984, с.11.

10. Трубицына Е.А, Власова Е.Г. Клячко Ю.А Современные методы определения белка в соках, молоке и других пищевых продуктах//Проблемы аналитической химии. Методы анализа пищевых продуктов. -М. Наука, 1988, с.216-226.

11. Тарасевич М.Р. Радюшкина К.А, Богдановская В.А. Электрохимия порфиринов.-М.Наука, 1991, с.312.

Использование: в пищевой промышленности при определении витаминов B₁ и B₂. Сущность изобретения: проводят кислотный гидролиз связанных форм витаминов и белка (0,15-0,20) М раствором серной или соляной кислоты на кипящей водяной бане в течение 30 - 40 минут, гидролизат охлаждают. Осаждают водорасторимый белок (0,40-0,50) г 4-х водного хлорида марганца, затем 2 - 3 г хлорида калия. Концентрацию витаминов определяют относительно хлорсеребряного электрода по высоте регистрируемых катодных пиков в диапазоне потенциалов (0,35-0,48) В для витаминов B₁ и анодных пиков в диапазоне потенциалов (0,15-0,20) В для витаминов B₂. 8 табл.

Способ количественного определения витаминов В₁ и В₂ в пищевых продуктах, предусматривающий кислотный гидролиз связанных форм витаминов и белка и определение концентрации витаминов, отличающийся тем, что кислотный гидролиз проводят (0,15 0,20) М раствором H₂SO₄ или HCl на кипящей водяной бане в течение 30 40 мин, гидролизат охлаждают, проводят осаждение водорастворимого белка 0,4 0,5 г 4-водного хлорида марганца, затем 2 3 г хлорида калия, а концентрацию витаминов определяют относительно хлорсеребряного электрода по высоте регистрируемых катодных пиков в диапазоне потенциалов 0,35 0,48 В для витамина В₁ и анодных пиков в диапазоне потенциалов 0,15 0,20 В для витамина В₂.