ШТАММ ГРИБА CLAVICEPS PURPUREA (FR.) TUL. BKM-F-3662D -ПРОДУЦЕНТ ЭРГОКОРНАМА Российский патент 2002 года по МПК C12N1/14 C12P17/18 C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к медицинской микологии, в частности к паразитарному штамму спорыньи, продуцирующему преимущественно эргокорнам. Эргокорнам относится к алкалоидам лактамного ряда, перспективным для применения в качестве предшественников в полусинтезе ряда лекарственных средств.

В настоящее время данных о существовании прототипа подобного штамма в доступной литературе не найдено. Известен ряд штаммов эрготоксиновой спорыньи, продуцирующих этот тип соединений в минорных количествах, как сопутствующие вещества [1-6], образующиеся в процессе конкурентной эпимеризации эрготоксиновых алкалоидов в процессе их биосинтеза.

Целью настоящего изобретения является выведение селекционным путем нового высокопродуктивного штамма спорыньи, перспективного для получения полусинтетическими методами биологически активных веществ на основе эргоалкалоидов.

Указанный результат был достигнут при использовании метода проведения конкурсных испытаний эргокриптиновых штаммов спорыньи (метод половинок). Для выполнения этих задач проводится полное исследование химического состава каждой индивидуальной склероции экспериментальных штаммов Cl. purpurea [7-9], определяется содержание суммы алкалоидов, компонентного состава эргоалкалоидов и содержание каждого компонента в смеси. На основании полученных данных производится отбор наиболее перспективных склероциев для воспроизводства нового штамма спорыньи и отбраковываются низкопродуктивные и нетипичные склероции, присутствие которых может привести к дегенерации штамма. Далее идет получение маточной культуры из наиболее перспективных склероциев и воспроизводство штамма спорыньи осуществляется выращиванием полевым способом, путем искусственного инфицирования ржи [8].

Последующий индивидуальный отбор склероциев с испытанием их потомств на воспроизводимость нового химического состава штамма позволил к 1999 году получить принципиально новый штамм спорыньи, в котором был закреплен процесс биосинтеза лактамного алкалоида, эргокорнама, как целевого соединения (таблица). Биологическая урожайность нового штамма составила 80 кг/га, при использовании гаметоцидов - около 278 кг/га. Новый селекционный штамм спорыньи содержит около 0,5-0,8% суммы алкалоидов, в составе которой эргокорнам составляет около 0,2-0,4%, и около 0,2-0,5% составляет продукт деструкции эргокорнама - валинамид. Наряду с основными алкалоидами присутствует эргометрин и ряд простых производных лизергиновой кислоты в минорных количествах (таблица).

Новый эргокорнамовый штамм спорыньи депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР под номером ВКМ-F-3662D и характеризуется следующими признаками.

1. КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ.

При сапрофитном выращивании штамма ВКМ - F-3662D использовали искусственную среду Т-2 следующего состава, г/л: сахароза - 100, аспарагин - 10, дрожжевой экстракт - 0,1, калия хлорид - 0,12, MgSO₄ • 7Н₂O - 0,25, FeSO₄ • 7H₂O - 0,02, ZnSO₄ • 7H₂O - 0,015, Ca(NO₃)₂ - 1,0, KH₂PO₄ - 0,25, агар-агар - 15-16, дистиллированная вода - 1000 мл. При высеве половинок склероциев заметный рост штамма появляется на 5-6 сутки и сопровождается образованием сначала ватообразного белого мицелия, который затем приобретает серовато-фиолетовый цвет, окрашивающий питательную среду. В дальнейшем мицелий и среда приобретают грязно-фиолетовый цвет. Через 18-23 дня образуются конидионосцы и наступает стадия спороношения. Заявленный штамм в сапрофитной культуре на искусственной среде дает обильное спороношение. Размеры спор при выращивании штамма на среде Т2 составляют: длина - 3,4-8,8 мкм, ширина - 2,5-5,3 мкм.

Хранение штамма на питательной среде нецелесообразно, так как гриб теряет свою вирулентность.

2. ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ.

Штамм Claviceps purpurea BKM-F-3662D - строгий аэроб, для которого оптимальной температурой его роста на искусственной среде Т-2 служит интервал от 24-26^oС.

Искусственное инфицирование растений ржи проводится в фазу выколашивания с помощью техники накалывания колосьев и одномоментного внесения заранее приготовленной водной суспензии конидиоспор Cl. purpurea BKM-F-3662D, полученной при сапрофитном выращивании штамма на среде Т-2.

Новым штаммом BKM-F-3662D инокулируют в асептических условиях стерильную среду из распаренного зерна ржи в колбах-матрацах емкостью 1,5-2,0 л, посевы гриба термостатируют при 24±1^oС в течение 30 дней, затем колбы переносят в сухое затемненное помещение с температурой 7-9^oС и хранят до заражения ржи, но не более 2-х месяцев. Водную инфекционную суспензию готовят непосредственно перед заражением путем смыва водой спор гриба с мицелия из распаренных зерновок ржи и последующей фильтрацией полученной суспензии через слой марли. Количество конидиоспор в одной колбе матраце достаточно для приготовления около 6 л инфекционной жидкости.

Концентрация спор в инфекционной суспензии должна составлять не менее 5 тыс. в 1 мм³. Суспензия используется не позднее, чем через 24 часа после ее приготовления.

Заражение озимой ржи осуществляли на опытных изолированных делянках площадью 3 и 5 м² в четырехкратной повторности с помощью игольчатых планшетов, смоченных инфекционной суспензией конидиоспор.

В течение вегетационного периода проводили наблюдение за развитием и ростом спорыньи на ржи, определяя степень заражения колосьев и растений.

Попадая внутрь цветка, конидиоспоры прорастают и превращаются в мицелий, постепенно разрастающийся в завязи цветка с образованием гиф. Через 8-14 суток (в зависимости от погодных условий) на гифах формируются конидиоспоры, которые выделяются с так называемой "медвяной росой". При наличии насекомых и благоприятной погоды в фазу цветения ржи происходит частичное вторичное перезаражение цветущих растений за счет конидиального спороношения. Спустя 40-45 дней с момента искусственного инфицирования цветка растения ржи образуются склероции, содержащие сумму эргоалкалоидов. Склероции собирали вручную и высушивали на воздухе в затемненном месте до воздушно-сухого состояния, когда рожки становятся ломкими на излом.

Зрелые склероции штамма эргокорнамовой спорыньи BKM-F-3662D - продолговатые, почти трехгранные, несколько изогнутые, суживающиеся к обоим концам, обычно с тремя продольными бороздками, черно- или коричнево-фиолетовые, длиной 5-50 мм, толщиной 1,5-8,0 мм, средняя масса рожков 95 мг.

Химический состав рожков спорыньи штамма BKM-F-3662D был изучен в течение с 1995 по 2000 гг., в процессе селекции нового штамма на опытных делянках с озимой рожью. Данные таблицы показывают изменение химического состава спонтанного штамма спорыньи, который к 1999 г. становится однородным по химическому составу, с самостоятельной хроматографичесой характеристикой штамма спорыньи. О прототипе подобного штамма в доступной нам литературе ничего не известно.

По химическому составу заявленный нами штамм является трехкомпонентным: основной алкалоид - эргокорнам (лактамного ряда), валинамид (продукт деструкции эргокорнама) и сопутствующий им эргометрин. Алкалоиды лактамного ряда (эргопептамы) относятся к крайне лабильным соединениям, вероятности существования прямой зависимости от строения пептидной части молекулы соединений этого типа среди алкалоидов эрготаминовой и эргоксиновой групп найдено не было. Алкалоиды лактамного ряда до настоящего времени обнаружены только в минорных количествах алкалоидного спектра в штаммах спорыньи, содержащих алкалоиды эрготоксиновой группы, а также в продуктах жизнедеятельности сапрофитной культуры спорыньи - группа эргоаннамов [1]. Ранее считалось, что эргопептамы являются сопутствующими веществами, образующимися в результате конкурентной эпимеризации в процессе биосинтеза эргопептидов [1-4]. Нами впервые выделен природный штамм спорыньи, в котором в результате произошедших спонтанных мутаций был закреплен процесс биосинтеза эргоалкалоида лактамного ряда, как основного продукта. Данная группа алкалоидов, исходя из своих химических характеристик, является перспективной для использования в медицине, как продуцент прекурсоров в полусинтезе ряда лекарственных препаратов.

Заявленный нами штамм Claviceps purpurea BKM-F-3662D не имеет известных прототипов и является новым штаммом с закрепленной биохимической функцией синтеза лактамного алкалоида - эргокорнама.

Источники информации
1. Beran M., Krepelka J.// Cesk.Fann. 1985. V. 34. 5. Р. 194-198. V. 34. 6. Р.232-236.

2. Floss H. G. , Tcheng-Lin Marie, Kobel H., Stadler P.// Experientia. 1974. V. 30. Р. 1369-1271.

3. Trtik B., Kudrnac S.//Cesk.Farm. 1982. V.31. 2. Р. 48-50.

4. Kudrnac S., Kakac В.// Cesk.Fann. 1982. V.31. 2. Р. 44-47.

5. Cerny A., Krajicek A.. Spacil J. Beran M., Kakac В., Semonsky M. // Collection Czech.Chem.Commun. 1976. V. 41. 11. P. 3415-3419.

6. Stutz P., Brunner R., Stadler P.A. // Experientia. 1973. V. 29, 8. Р. 936-937.

7. Шаин С.С.// Прикл.биохимия и микробиология. 1996. Т.32. 3. С.275-279.

8. Шаин С. С. Возделывание спорыньи на ржи. // Лекарственное растениеводство. M: ЦБНТИ-медбиопром. 1987. Вып. 4. 50 с.

9. Комарова Е.Л. Шаин С.С. // Хим.-фармацевт. журн. 1998. Т.32. С.34-37.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к новому штамму спорыньи. Эргокорнамовый штамм паразитарной культуры спорыньи Claviceps purpurea выведен при использовании высокожизненного исходного материала, полученного из аскоспор в процессе генеративного развития гриба, с последующим индивидуальным отбором склероциев в процессе конкурсного испытания их потомств по химическому составу эргоалкалоидов. Штамм гриба Claviceps purpurea (Fr.) Tul. депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР под номером ВКМ-F-3662D. При сапрофитном выращивании полученного штамма на синтетической среде Т-2 заметный рост штамма появляется на 5-6 сутки и сопровождается сначала образованием ватообразного белого мицелия, который затем приобретает серо-фиолетовый цвет, окрашивающий питательную среду. Через 18-23 дня образуются конидиеносцы и наступает стадия плодоношения. Размеры спор при выращивании штамма на среде Т-2 составляют: длина 3,4-8,8 мкм, ширина 2,5-5,3 мкм. При инфицировании ржи конидиоспорами гриба спустя 1-1,5 месяца с момента заражения цветка на колосе образуются склероции, содержащие целевой алкалоид. Штамм гриба Claviceps purpurea (Fr.) Tul. ВКМ-F-3662D обеспечивает биологический урожай рожков спорыньи в среднем 80 кг/га; с использованием геметоцидов - 278 кг/га, при сумме алкалоидов 0,5-0,8%, в составе которой эргокорнам составляет 0,2-0,4%. Данный штамм не имеет известных прототипов и является новым штаммом с закрепленной биохимической функцией синтеза алкалоида лактамного ряда - эргокорнама. 1 табл.

Штамм гриба Claviceps purpurea (Fr.) Tul. BKM-F-3662D - продуцент эргокорнама.