ШТАММ ГРИБА CLAVICEPS PURPUREA (FR.) TUL. - ПРОДУЦЕНТ ЭРГОКРИПТИНОВ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/14 C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к созданию улучшенного штамма эргокриптиновой спорыньи, склероции которого перспективны в качестве сырья для производства эргокриптиновых алкалоидов.

Предлагаемый штамм Claviceps purpurea BKM F-3602 по сравнению с прототипом (а. с. РФ N. 1551731 "Штамм спорыньи BKM F-2642D - продуцент эргокриптиновых алкалоидов"/Шаин С. С., Волошина Д.А., Колесникова Л.И. и др. - заявлено от 12.02.86) обеспечивает повышение выхода эргокриптинов с единицы площади ржи, инфицированной известным способом спорами этого штамма, за счет высокого содержания суммы эргокриптинов в склероциях и в сумме эргоалкалоидов, и более значительного уровня урожайности сырья.

Задачей данного изобретения является селекция улучшенного штамма спорыньи Claviceps purpurea (Fr.)Tul. с повышенной продуктивностью биологически активных алкалоидов: альфа- и бета-эргокриптинов.

Целью данного изобретения являлось создание нового отечественного высокопродуктивного штамма спорыньи с хорошей способностью к образованию жизнеспособных и вирулентных конидиоспор, который при паразитарной культуре на озимой ржи давал бы повышенный выход эргокриптинов с искусственно инфицированных конидиоспорами гриба растений за счет накопления высокого содержания эргокриптинов при минимальном количестве сопутствующих алкалоидов в склероциях и большого урожая сырья (рожков).

Указанные выше задачу и цель удалось реализовать благодаря отселектированному эргокриптиновому штамму спорыньи, зарегистрированному 13 июня 1996 года под номером BKM F-3602 во Всероссийской коллекции микроорганизмов при институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН РФ.

Алкалоиды альфа- и бета-эргокриптины являются известными лекарственными веществами, которые в настоящее время за рубежом применяются в медицине в форме комплексных препаратов, а также служат для получения на их основе фармакологически активных полусинтетических производных, широко используемых в медицинской практике. В Российской Федерации эти алкалоиды используются для промышленного производства оригинального отечественного лекарственного препарата противоопухолевого и нейрогормонального действия - абергин.

Создание штамма BKM F-3602, селектированного методом индивидуального отбора из склероций отечественного промышленного производственного эргокриптинового штамма BKM F-2642D, обеспечило высококачественным сырьем производство препарат абергин.

Качество склероциев предлагаемого штамма BKM F-3602 позволяет при промышленной переработке сырья получать из них целевой продукт - абергин экономичным способом.

Основным достоинством штамма BKM F-3602 является высокая продуктивность эргокриптинов за счет повышенного содержания целевых веществ в сырье и преобладания их в сумме эргоалкалоидов в сочетании с высокой урожайностью склероциев.

Таким образом, создан новый отечественный эргокриптиновый штамм Claviceps purpurea, обеспечивающий в биотехнологической системе гриб - растение повышенный (по сравнению с промышленным штаммом в среднем в 3,3 раза) сбор эргокриптиновых алкалоидов с единицы площади возделывания ржи на спорынью.

Культурально-морфологические признаки
При сапрофитном выращивании штамма BKM F-3602 на среде из распаренного зерна ржи на 6 - 7-й день появляется белый мицелий гриба, который постепенно разрастается по поверхности зерновок. Через 15 - 20 дней мицелий переходит в фазу конидиального спороношения, приобретая сероватый оттенок.

При культивировании штамма на агаризованном пивном сусле рост мицелия становится заметным через 7 - 10 дней после высева. При этом на поверхности среды образуется сначала белый, а затем сероватый ватообразный мицелий, плотно срастающийся со средой. Через 18 - 23 дней образуются конидионосцы и наступает стадия спороношения.

При выращивании гриба на среде Т-2, следующего состава (г/л): сахароза 100; аспарагин 10; дрожжевой экстракт 0,1; KCl 0,12; MgSO₄ • 7H₂O 0,25; FeSO₄ • 7H₂O 0,02; ZnSO₄ • 7H₂O 0,015; Ca(NO₃)₂ 1,0; KH₂PO₄ 0,25; агар-агар 15; дистиллированная вода 1000 мл.

Мицелий появляется на 5-6 сутки после посева и наблюдается окрашивание питательной среды в фиолетовый цвет. В дальнейшем мицелий гриба приобретает фиолетовый оттенок.

Предлагаемый штамм на изученных средах характеризуется достаточно обильной стадией конидиального спороношения.

Размеры конидиоспор при сапрофитном выращивании штамма на указанных питательных средах одинаковые и составляют (3,4 - 8,8) и (2,5 - 5,3) мкм.

Физиологические признаки
Штамм Claviceps purpurea BKM F-3602 является строгим аэробом, для которого оптимальной температурой его роста и спороношения служит интервал 24+1^oC. Искусственное инфицирование ржи производится в фазе выколашивания с помощью специальной техники путем одномоментного накалывания колосьев и опрыскивания растений заранее приготовленной водной суспензией конидиоспор Claviceps purpurea BKM F-3602, полученных при сапрофитном выращивании гриба на питательной среде из распаренных зерновок ржи.

Через 8 - 14 (в зависимости от погодных условий) суток после заражения в инфицированных цветках ржи проходит сфацелиальная стадия гриба, сопровождающаяся образованием конидиоспор, которые выделяются на поверхности колосьев в составе, так называемой "медвяной росы". Новая генерация конидий обеспечивает заражение грибом других цветущих на плантации растений. При растянутом цветении ржи эпифитотия на плантации может развиваться за счет последующих генераций конидиоспор в спонтанно заражаемых грибом цветках. Через 40 - 45 дней с момента искусственного инфицирования ржи на колосьях образуются склероции (рожки), содержащие значительное количество суммы эргоалкалоидов с преобладанием в ней эргокриптинов.

Зрелые склероции улучшенного эргокриптинового штамма спорыньи - продолговатые, почти трехгранные, несколько изогнутые, суживающиеся к обоим концам, обычно с тремя продольными бороздками, черно- или коричневато-фиолетовые, длиной 5 - 50 мм, толщиной 1,5 - 8,0 мм; средняя масса рожков 95 мг.

Новым штаммом BKM F-3602 инокулируют в асептических условиях стерильную среду из распаренного зерна ржи в колбах-матрацах емкостью 1,5 - 2,0 л. Посевы гриба термостатируют при 24+1^oC в течение 30 дней, затем колбы переносят в сухое затемненное помещение с температурой 7 - 9^oC и хранят до заражения ржи, но не более 2-х месяцев. Заражение грибом ржи производят в фазе начала колошения растения по известной технологии.

С этой целью инфекционный материал (водную суспензию конидиоспор) готовят непосредственно перед заражением путем смыва водопроводной водой спор гриба с мицелия на распаренных зерновках ржи и последующей фильтрацией полученной суспензии через слой марли.

Концентрация спор в инфекционной жидкости должна составлять не менее 5 тыс. в 1 мм³.

Количество конидиоспор в одной колбе-матраце достаточно для приготовления около 6 л инфекционной жидкости.

Суспензию конидиоспор в воде используют не позднее, чем через 24 часа после ее приготовления, предварительно взмучив жидкость. Заражение озимой ржи осуществляли на опытных изолированных делянках площадью 10 м² в четырехкратной биологической повторности вручную с помощью игольчатых планшетов, смоченных суспензией конидиоспор гриба. На инфицирование одной делянки расходуют инфекционный материал в среднем из двух колб-матрацев.

В течение вегетационного периода проводили наблюдения за развитием и ростом спорыньи на ржи (учитывались сроки появления "медвяной росы", характер цветения растений), определяли степень заражения колосьев и растений. Через 6 недель со времени заражения ржи склероции спорыньи собирали вручную. Рожки высушивали на воздухе в затененном помещении до воздушно-сухого состояния, когда рожки становились ломкими на излом.

Содержание суммы эргоалкалоидов и ее компонентный состав определяли известными методами анализа. Содержание эргокриптинов и сопутствующих им алкалоидов в сырье контролировали хромато-флуориметрическим методом, а также методом ВЭЖХ.

Результаты биологической урожайности склероциев по итогам трехлетних полевых испытаний предлагаемого штамма спорыньи представлены в таблице.

За период с 1994 по 1996 гг. урожайность склероций в среднем составила 682,7 кг/га при содержании в сырье суммы эргоалкалоидов 0,81% и эргокриптинов 0,70%. Выход целевого продукта - эргокриптиновых алкалоидов с 1 га составлял в среднем за три года 4,80 кг.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству эргокриптиновых алкалоидов. Штамм Claviceps purpurea (Fr) Tul ВКМ F - 3602 - продуцент эргокриптинов получен методом индивидуального отбора из склероциев отечественного штамма спорыньи ВКМ F - 2642 Д - продуцента эргокриптиновых алкалоидов с испытанием потомств суперэлитных линий гриба по химическому составу эргоалкалоидов и по урожайности. Штамм характеризуется увеличением более чем в 3 раза сбора эргокриптинов с единицы площади за счет сочетания повышенного содержания целевых эргоалкалоидов в сырье и высокой урожайности склероциев. При возделывании штамма в биотехнологической системе гриб-растение сбор эргокриптинов составляет в среднем 4,8 кг/га. 1 табл.

Штамм гриба Claviceps purpurea (Fr.) Tub. ВКМ F-3602 - продуцент эргокриптинов.