Способ получения ноурзеотрицина Советский патент 1988 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/57 

4 К

о: Сл

а а

Изобретение относится к новому способу ферментативного получения ноурзеотрицина

Ноурзеотрицин является антибиотиком стрептотрициновой группы, который после его назначения в эрготропных дозах вместе с кормовыми рационами сельскохозяйствен- но-полезным животным обуславливает ускоренный прирост живой массы, а также одновременно у.сньшение затрат корма. Ноурзеотрицин используют для животноводческого производства, а также для фармацевтиче- ской и комбикормовой промышленности.

Антибиотик Ноурзеотрицин, изолированный из культуры варианта штамма Strepto- myces noursei АТСС 11455, активен in vitro в отношении грамположительных и грамот- рицательных бактерий, а также в отношении микобактерий.

Образующий антибиотик Ноурзеотрицин штамм стрептомицетов под названием Strep- tomyces.noursei ZIMET JA 3890b депонирован в музее ;;-i O:,--.K.:J lUilTpajlblU;: ;; ЛНСТИТу-

та микробиологии и экспериментальной терапии Академии наук ГДР.

По известным из литературы способам культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях. Для этого лиофилизи- рованный на земле споровый материал этого штамма стрептомицетов переносят на соответствующие агаризованные питательные среды. После 6-10-дневного инкубирования при 28-30°С проросший спорулирующий мицелиальный газон используют для засева жидких стерильных питательных сред, засев можно осуществлять также непосредственно при помощи консервированного лиофилиза- цией на желатине глубинного мицелия ноур- зеотрицинообразующего штамма стрептомицетов.

Жидкие питательные среды для глубинного выращивания посевного материала содержат в качестве субстратов источники углерода и азота, а также неорганические соли. В качестве источника yi-лерода используют глюкозу и/или глицерин. В качест- ве источника азота применяют, в частности, соевую муку, различные аминокислоты и/или аммонийные соли. Наиболее благоприятная для выращивания посевного материала кислотность имеется в начале культивирования в пределах рН 6,0-6,7. Инкубирование проводят при 28-30°С в течение 24-48 ч. Получаемый таким образом посевной материал служит для засева жидких стерильных питательных сред для питания основной культуры. Такие питательные среды состоят из источников углерода и азота, а также из неорганических солей. В качестве источника углерода, используют кукурузный экстракт и/или глюкозу. В качестве источника азота при.меняют, в частности, соевую муку, различные аминокислоты и/или ам- мойийные соли. Наиболее благоприятная для образования антибиотика кислотность составляет в начале ферментации рН 6,0-

s

0

0 5

0

5

5

0

7,5. Культивирование осуществ чяют при 26--32°С, предпочтителыю 28 -30°С, в течение 150 ч.

Глубинное культивирсг.акие штамма Streptomyces noursei ZIMET JA 3890 b осуществляют известным образом на хачалке или в ферментаторах с перемеи иванием к аэрацией без прибавления субстратов или регулирования значения рН.

При этом известно, что сравнительно незначительное ноурзеотрицинообразование на первоначальной ферментационной среде может увеличиваться в 5-10 раз в известных технических условиях, если в начале выращивания основной культуры прибавляют амин.оарилкарбоновые кислоты, в частности 5-10 ммо. о-а.минобензойной кислоты (Becker Н. und Thrum Н.: Stimulation of nourseothricin production by aminoben- zoic acids, in: Herold M und Gabriel Z.: Antibiotics-Advances in reseatch,- production and clinical use. London, 96u, p. 564, bis 587).

Однако ферментативное производство ноурзеотрицина с использованием амино- арилкарбоновых кислот, которое, ка известно, хотя и позволяет значительно увеличивать выход ферментации, но, в частности, в отношении затрат, стерилизации и пробле.м. связанных со сточными водами, имеет недо- статки, которые мешают внедрению способа в промышленное производство.

Известно также, что на биосинтез большинства вторичных метаболитов отрицательно влияет избыточный фосфат (.Martin J. F., und Demain А. L.: Control of antibiotic biosynthesis.-Microbioi. Rev. 44, 230 bis 251 (1980). Поэтому микробиолог -гче- ские процессы ферментации для получения вторичных метаболитов, например антибиотиков, проводят при концентраци5:х фосфата субоптимальных для роста образователя.

Для ферментации в технических масштабах в целях получения вторичных метаболитов используют, как правило, комплексные компоненты питательной среды растительного и животного происхождения, такие, как крахмал, соевая мука, кукурузный экстракт, меласса, мясной экстра.кт и ;,р. Такие комплексные питатгльиой среды имеют по мере происхождения и предварительной обработки различное со.аержание общего фосфата с различной биологической доступностью. Часть .аоступкого фосфата имеется в ферментационной среде а форме растворимого фосфата. Это обстоятельстве принципиально затрудняет стандартизацию питательных сред.

Однако начальные концентрации растворимого или доступного фосфата имеют ре- ц:ающее значение для фермектат1-:зного выхода ожидаемого вторичкого ;етаболита, поскольку определенное КОЛИЧССТЕО фосфата необходимо для роста микроорганизма- продуцента, а слишком высокие начальные

концентрации фосфата подавляют образование вторичного метаболита.

При улучшении микробиальных способов получения вторичных метаболитов питательную среду и микроорганизм - продуцент приспосабливают друг к другу путем взаимного модифицирования так, чтобы между обоими гфотиводействуюш,ими регулирующими факторами воздействия фосфата установился KOMnpOjVinCC.

Однако путь постепенного повышения продуктивности связан с затратами времени и расходами.

Кроме того, известно, что наряду с регулирующим воздействием на процесс путе.м изменения состава питательной среды выход ферментации можно улучщать также путем управления ферментационным процессом, предпочтительно управления в реальном мае штабе времени (Sukatsch D. А. и. Neserriann G.: Automatische Parametererfassung bei in- dustrielien Fermentationen.-Chemie-Technik 6, 261 (1977).

В случае использования режима управления в реальном масштабе времени, необходимого для эффективного ведения процесса фермеггтации, трудность заключается в то.м, что вместо концентраций субстратов, чаще всего определяемых только дополнительно трудоемким химическим анализом, приходится прибегать к измерению принятых в ферментационной технике- непрерывно определяемых общих параметров процесса - рН, рОг, количества дозируемых добавок, состав отходящих газов, теплообразование - как первичных регулируемых параметров процесса.

Цель изобретения - повышение производительности способа.

Сущность изобретения сводится к следу юп1е;11 у.

В основу изобретения положена задача представить технически, удобный способ, который путем ведения лроцесса с лимитированием по предельным значениям и увеличения времени продуктообразования позволял бы осуществить промышленное производство ноурзеотрицина с высоким объемно- времень:ым выходом ф-ерментации.

Регулируемая в задаиньЕх ус;1овмях зна- .чений рМ в пределах 7,2-8,2 термостерилизация культура; ьной среды, раздельная стерилизация компонентов (глюкоза и сульфат аммония); лимитированное по скорости дозированное прибавление субстрата (прибавление извне или высвобождение субстратов из компонентов питательных веществ), регу. ирование заданного значения рН в пределах 5,0-6,5 во врелш ферментации особенно эффективно влияют на метаболические активности нoypзeoтpицинooбpaзyюп иx культур (дыхание, глюкозный обмен, азотный об.мен. антибиотикообразование).

При этом особое значение имеет, что на протяжении всего периода ферментации

отно1пение концентраций углерода к азоту

составляет не менее 5-15 г глюкозы/л к

0,,2 г аммонийного азота/л среды.

За счгт заданного режима стерилизации

с начала ферментации обеспечивается лимитированное по скорости высвобождение фосфатного буфера в пределах 0,1 -10 мг/л предпочтительно из комплексных азотных компонентов питательной среды. Этот предел концентрации особенно выгодно влияет на

необходимый для биосинтеза антибиотика ход обмена веществ (C:N) в указанном соотношении концентраций.

В тесной связи с эффективной метаболической активностью в процессе ферментации

5 следует рассматривать регулирование рН в пределах 5.0-6,5. Необходимый н выгодный для биосинтеза антибиотика ход обмена веществ особенно активируется в этих пределах.

Для сохранения требуемого соотнощенця

0 концентраций глюкозы/азота необходимо дозировать сульфат аммония до достижения физиологически оптимального диапазона рН. Неожиданно было найдено, что соответствующий интервал заданных значений регу5 лирования рН ку.чс-туральной жидкости устанавливается в пределах эффективных с точки зрения физиологического регулирования рН 5,0-6,5 при прибавлении раствора гидроокиси аммония соответствующей концентрации, а вместе с тем гарантируется

0 концентрация азота для соотнощения концентрации глюкозы/азота.

Способ ведения процесса обеспечивает лимитированное по скорости высвобождение фосфатного буфера.

Такой способ регулирования процесса

5 позволяет через 120-140 ч ферментации при парц1 альном давлении кислорода рО2 в пределах 30-80%, предпочтительно 40%, обеспечить биологическую активность, даю- длую 8-11 кг поурзеотрицина на тонну куль- тургльной жидкости.

Пример. Суспензия лиофилизированного консервного мицелия в физиологическом растворе поваренной соли, полученного от шта.1. а - продуцента Streptomyces noursei, служит в качестве инокулюма для первого

0

5

глуби О1Ого пасса.жа.

Питательная среда содержит, г/л: глюкоза 5; соевая NiyKa 15; карбонат кальция 1,0; хлорид натрия 5,0; дигидрофосфат калия 0,3; водопроводная вода до 1000 мл, рН 6,5- 6,9 (разливать по 50 мл в 500-.мл колбы на 0 качалке)..

Стерилизацию среды производят при 120°С в течепие 35 мин.

После 48-часового культивирования при 28°С на ротационной качалке культивируют 2-й глубинный пассаж (разлив 250 мл, 5 2000 - .мл колбы на качалке) в соотношении 1 ч инокулюма к 25 ч питательной среды в течение 24 ч на ротационной кача.чке. 600 мл 2-го глубинного пассажа ИСПОЛЬЗУЮТ

для засева 800 л среды посевного ферментатора.

Питательная среда содержит, г/л: глюкоза 15; соевая мука 15; дигидрофосфат калия 0,3; хлорид натрия 5,0; карбонат кальция 1,0; антафрон 5,0; подсолнечное масло 37,5.

Значение рН устанавливают перед стерилизацией на 7,6, после стерилизации оно составляет 6,8-7,0. Стерилизацию осуществляют при 120°С в течение 60 мин.

После 30-часового культивирования при 28°С потребляется около 60 мг растворимого фосфата на литр, причем образуется 12- 15 г биомассы на литр.

Количество инокулюма в 800 л достаточно для засева около 18 м производственной среды основной культуры.

Питательная среда производственного ферментатора содержит, г/л: картофельный крахмал 32,0; соевая мука 15,0; хлорид натрия 1,0; .карбонат кальция 6,0; сульфат цинto

15

0,3:1 (м воздуха:м культуральной жидкости в 60%).

Если предельные значения не достигают величины 5 г/л для глюкозы и 0,2 г/л для аммонийного азота, эти компоненты прибавляют как 50%-ные стерильные растворы, пока культуральная жидкость не достигает рН 5,2 при значении аммонийного азота свыше 300 мг/л.

В дальнейшем прибавление аммонийного азота осуществляют дозированным прибавлением аммиачной воды при постоянном рН 5,5. Через 130 ч ферментации достигается биологическая активность порядка 800- 11000 мкг ноурзеотрицина на 1 мл культуральной жидкости.

Формула изобретения

Способ получения ноурзеотрицина путем культивирования штамма Streptomyces nour- sei ZIMET JA 38906 в питательной среде.

ка 0,5; сульфат магния 2,0; подсолнечное 20 содержащей источники углерода, азота, фосмасло 3,0; антафрон 0,3; глюкоза 10-35; сульфат ам.мония 2-11.

Компоненты глюкозы и сульфата аммония прибавляют к питательной среде после раздельной стерилизации (120°С, 30 мин).

Стерилизацию среды производят при 115°С в течение 60 мин, причем до начала устанавливают значение рН 7,8, которое по окончании стерилизации достигает значений в пределах 7,2-8,2.

Пополненная среда достигает значения рН в пределах 7,0-7,4. Ферментацию производят при 28°С с соотношением аэрации

25

фора, минеральные и органические добавки, в условиях аэрации и перемешивания, отличающийся тем, что, с целью повышения производительности способа, в начале фер.мен- тации устанавливают концентрацию растворимого фосфата в питательной среде ниже 10 мг/л, в процессе ферментации поддержи- вают величину рН в пределах 5,0-6,5, отношение концентраций углерода и азота поддерживают в пределах 5-15 г глюкозы/л 30 среды и 0,015-0,2 г аминного азота/л среды, а парциальное давление кислорода устанавливают на уровне 30-60% от полного насыщения среды.

o

5

0,3:1 (м воздуха:м культуральной жидкости в 60%).

Если предельные значения не достигают величины 5 г/л для глюкозы и 0,2 г/л для аммонийного азота, эти компоненты прибавляют как 50%-ные стерильные растворы, пока культуральная жидкость не достигает рН 5,2 при значении аммонийного азота свыше 300 мг/л.

В дальнейшем прибавление аммонийного азота осуществляют дозированным прибавлением аммиачной воды при постоянном рН 5,5. Через 130 ч ферментации достигается биологическая активность порядка 800- 11000 мкг ноурзеотрицина на 1 мл культуральной жидкости.

Формула изобретения

Способ получения ноурзеотрицина путем культивирования штамма Streptomyces nour- sei ZIMET JA 38906 в питательной среде.

0 содержащей источники углерода, азота, фос5

фора, минеральные и органические добавки, в условиях аэрации и перемешивания, отличающийся тем, что, с целью повышения производительности способа, в начале фер.мен- тации устанавливают концентрацию растворимого фосфата в питательной среде ниже 10 мг/л, в процессе ферментации поддержи- вают величину рН в пределах 5,0-6,5, отношение концентраций углерода и азота поддерживают в пределах 5-15 г глюкозы/л 0 среды и 0,015-0,2 г аминного азота/л среды, а парциальное давление кислорода устанавливают на уровне 30-60% от полного насыщения среды.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков. Цель изобретения - повышение производительности способа. Сущность способа сводится к тому, что культуру-продуцент на первой стадии ферментации выращивают в условиях лимитации по фосфору. Для этого концентрацию фосфата в питательной среде устанавливают ниже 10 мг/л. В процессе ферментации регулируют величину рН, поддерживая ее на уровне 5,0-6,5. Концентрацию углерода и азота в процессе ферментации поддержи вают в пределах 5-15 г глюкозы/л среды и 0,015-0,2 г аминного азота/л среды, а парциальное давление устанавливают на уровне 30-60% от полного насыщения среды. Через 130 ч ферментации достигается биологическая активность порядка 8000 - 11000 мкг антибиотика/мл культуральной жидкости. I (/ С