Способ получения ноурзеотрицина Советский патент 1988 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/57 

со со о го 4 to

I Изобретение относится к области |биотехнологии и касается фермента- тивного получения ноурзеотрицина - антибиотика, относящегося к группе стрептотрицинов.

Изолированный Брадлером и Трумом (1963-1965) из культуры варианта Streptomyces noursei АТСС 11455 анти- :биотик - ноурзеотрицин in vitro акти- |вен против грамположительньрс и грам- |отрицательных бактерий, а также про- |тив микробактерий, кроме того, прояв- ;ляет и противовирусное и тениацидаль- ное действие. Ноурзеотрицин в отношеНИИ химической структуры представля- ;ет собой в основном смесь стрептотри- |цина F и D (Грефе и др., 1974).

Штамм стрептомицетов, образующий антибиотик ноурзеотрицин, под назва- |нием otreptorayces noursei IMET lA 13890b, хранится в коллекции штаммов Центрального института микробиологии и экспериментальной терапии АН- ГДР.

, преимущественно 26-28°С. Глубинное культивирование для получения вегетативного посевого материала длится 24-72 ч, в частности 48 ч, а процесс выращивания главной культуры 72-144 ч.

Выделение антибиотика из отделенного от мицелия фильтрата культуры осуществляется путем адсорбции к соответствующим катионообменникам, например Вофатит СР-300, и последующего элюирования разбавленными кислотами, (Брадлер и Трум, 1963; Грефе и др. 1977..

На известном питательном субстрате (Ьрадлер и Трум, 1985) штамм Streptomyces noursei IMET lA 3890 b образует лишь незначительные количества ноурзеотрицина (ниже 100 мкг/мл) Добавлением аминоарилкарбоновых кислот, в частности 5-10 мМ о-аминобен- зойной кислоты, в начале выращивания культуры удается в известных техни

Изобретение относится к биотехнологии и касается ферментативного получения ноурзеотрицина - антибиотика, относящегося к группе стреп- тотрицинов. Цель изобретения - снижение расхода стимулятора при сохранении выхода антибиотика. Сущность способа сводится к тому, что штамм Str. noursei IMET JA3890 вьфащивают в полноценной питательной среде, содержащей стимулятор антибиотико- образования - азид натрия, бренцкате- хин, амиталь, сульфат цинка или 6-аланин. При этом стимулятор можно вводить как до инокуляции питательной среды, так и в процессе культивирования до завершения экспоненциальной фазы роста продуцента. Процесс ферментации ведут в аэробных условиях при 25-30°С в течение 3-10 дней, а целевой продукт выделяют из фильтрата культуральной жидкости. 4 табл. с S (Л

Согласно известнь1М способам (Брад- 25 ческих условиях увеличивать выход

лер и Трум, 1963/1965; Бокер и Трум, 1966; Трефе и др., 1974) культивирование осуществляют в аэробных условиях. Дпя этого лиофилизированный на

почве споровый материал этого штамма стрептомицетов пересевают на подходящие агаровые среды. После 6-10-дневного инкубирования при 28-30 С выросший таким образом спорулирующий мице- лиальньй газон используют для засева жидких стерильных питательных сред, состоящих из источников углерода и

азота,а также неорганических солей.

: В качестве источников углерода можно использовать различные сорта крах- Q вращается вторичный обмен в связи

мальной муки растительного происхождения, например картофельный крахмал глюкозу и/или глицерин. В качестве источников азота используют, в частности, соевую муку, различные аминокислоты и/или аммонийные соли, В начале ферментации кислотность среды, наиболее благоприятная для антибио- тикообразования, находится в пределах рН 6,0-6,7.

Глубинное культивирование микроорганизма Streptomyces noursei IMET lA 3890 b можно осуществлять в широ- когорлых колбах или круглых плоскодонных колбах различного содержания на качалке, а также в аэрируемых стерильным воздухом ферментаторах с перемешивающим устройством из коррозионно-стойкого материала при 25ферментации в 5-10 раз (Бокер и Трум, 1966; Трум и Бокер, 1965; Грефе и др., 1974).

о-Аминобензойная кислота и/или 0 другие а мин оарилкарбоновые кислоты (Грефе и др., 1974, 1977, 1978, 1979) вызывают специфическое подавление образования цитохрома а-типа (цито- хромоксидаз), косвенно ингибируя тем как перенос аминокислоты из питательной среды в мицелий, так и окислительное дезаминирование аминокислот в клетках ноурзеотрицино- образователя. За счет этого предот5

5

0

5

с клеточным изобилием азотных катабо- литов и, кроме того, исключено, что аминокислоты, служащие в качестве предшественников ноурзеотрицина, в значительной степени потреблюются антибиотикообразователем в фазе его роста. Таким образом, эти аминокислоты лучше доступны для вторичного обмена в ходе образования ноурзеотрицина, поскольку для образования биомассы используются преимущественно неорганические источники азота (аммонийный азот).

Ферментативное производство ноурзеотрицина с использованием о-амино- бензойной кислоты позволяет значительно увеличивать выход антибиотика. Однако необходимое использование больших количеств аминоарилкарбоно

вых кислот отрицательно влияет,на экономичность способа в связи с затратами на такие добавочные вещества Тепловую стерилизацию и соответственно химическую или радиационную стерилизацию растворов солей водных амино акрилкарбоновых кислот нельзя осуществлять из-за разложения аминоарил карбоновых кислот с образованием TOK сических продуктов превращения, для необходимого обеззараживания таких растворов остается только стерильная фильтрация. Последняя, однако, относительно трудоемка. Наличие амино- арилкарбоновЬк кислот в стоках хро- матографических колонок затрудняет биологическую очистку сточных вод.

Цель изобретения - снижение расхода стимулятора при сохранении выхода антибиотика.

Способ осуществляется следующим образом.

Задача изобретения - создание способа, обеспечивающего промышленное производство ноурзеотрицина без использования аминоарилкарбоновых кислот.

Добавки ингибиторов дыхательной цепи, например азид натрия или другие щелочные азиды, бренккатехин, а также амиталь (этилизоамилбарбитуро- вая кислота), и/или ингибиторов переноса аминокислот в живой клетке, например водорастворимые соли цинка ил бета-аланин, добавляемые в главную культуру в момент засева, оказывают аналогичное способствующее действие на биосинтез ноурзеотрицина, не меня биологических свойств продукта ферментации. Необходимые для этого концентрации одного из этих веществ лежат в пределах 0,025 - 0,25 ммоль, в основном около 0,15 мм (азида натрия) или О,;5 - 1,75 ммоль, в основном 0,50, до 0,75 ммоль (сульфата цинка илиуЗ-аланина) или 0,05 - 2,0 ммоль, в основном около 0,4, до 1,5 мм (бренцкатехина или ами- таля) .

Для способа используют следующие ферментационные среды, содержащие,%: среда Во-30 - глюкоза 2,9; соевая мука обезжиренная 1,3, хлористый натрий 0,5; карбонат кальция 0,3; водопроводная вода для получения 100 мл, рН 6,5 (перед стерилизацией)среда ВО-31 - кукурузный крахмал 3,0; глюкоза 0,3; соевая мука обезжиренная

5

0

5

0

0

5

0

5

0,7; нитрат аммония 0,5; сульфат магния кристаллический 0,2; хлористый натрий 0,5; карбонат кальция 0,3; водопроводная вода для получения 100 МП, рН 6,0 (перед стерилизацией), среда Во-32 - картофельньй крахмал 3,2; глюкоза 2,9; соевая мука обезжиренная 1,4; нитрат аммония сульфат магния кристаллический 0,2; хлористый натрий 0,1; карбонат кальция 0,6; водопроводная вода для получения 100 мл, рН 6,0 (перед стерилизацией) .

Эти среды, используемые для культуры продуцента, обеспечивают гораздо более высокий выход ноурзеотрицина по сравнению с известной ферментационной средой.

При наличии азида натрия и соответственно других щелочных азидов, бренцкатехина, амиталя, сульфата цинка и/или бетааланина, добавляемых в питательную среду отдельно или в смеси в момент засева культуры, ноур- зеотрицинообразование увеличивается еще в 2-10 раз.

Ноурзеотрицин можно выделить из фильтрата культуры путем адсорбции с использованием активированного угля и катионообменников (сильно-.и слабокислы). Предпочтительньм способ основан на адсорбции на щелочной основе слабокислых катионообменных солей. Элюирование адсорбатов проводят водными или спиртовыми растворами минеральных кислот. Из минерало- кисльпс элюатов, получают чистую соль ноурз еотрицина.

Пример 1. Лиофилизированцые на почве консервированные споры штамма Streptomyces noursei ШЕТ IA 3890b высевают на подходящую агаризованную среду, например среду Эмерсона. Примерно после семидневного инкубирования при 30 С вырезают из мицели- ального газона участки размером. 2 см и засевают ими культуральную среду 1-й стадии вьфащивания следующего состава, %: глюкоза 4,0; соевая мука обезжиренная 1,5; 0,03; NaCl 0,5; CaCOj 0,3; водопроводная вода 100 мл; рН 6,5-6,9 (перед стерилизацией) .

Среду в количествах по 50 мп заливают в закупоренные ватной пробкой широкогорлые колбы емкостью 500 мл. Стерилизацию осуществляют 35-минутным нагреванием до 120 С в автоклаве.

Засеянные культуры инкубируют на качалке при в течение 48 ч. 3 мл посевного материала используют для засева ферментационной среды.

Для ферментации используют следующие питательные среды, %: среда Во-30 - глюкоза 2,9; соевая мука обезжиренная 1,3; NaCl 0,5; СаСОз водопроводная вода 100 мл; рН 6,5 (перед стерилизацией), среда Во-31 - кукурузный крахмал 3,0; .глюкоза 0,3; соевая мука обезжиренная 0,7; 0,5; MgS04 7HpO 0,2; NaCl 0,5; CaCOj 0,3; водопроводная вода 100 мл; рН 6,О (перед стерилизацией) .

Ферментационные среды в количествах по 80 мл заливают в закупоренные ватной пробкой широкогорлые колбы емкостью 500 мл и стерилизуют при 120°С в течение 35 мин в автоклаве.

К предварительно подготовленной посевной культуре в момент зас.ева прибавляют стерильно профильтрованны водные нейтральные растворы с оответ- ствующих веществ (максимум 3,0 мл добавки/80 МП среды).

С помощью восьми полученных выращиванием на качалке 24-часовых культур 2-й стадии засевают 150 л термостерилизованной среды (60 мин при 125°С) описанного состава, залиВ табл. 1 и 2 приведены средние максимальные концентрации ноурзеотри- JQ той в ферментатор из благородной ста- цина, полученные в течение 72-100 ч ли (общая емкость 200 л), оснащенный

устройствами для подачи стерильного воздуха и перемешивающим устройством. Культивирование осуществляют при 26-28 0, скорости работы перемеши- вающего устройства 375 об/мин и коэффициенте аэрации 1 л воздуха и 1 л культуральной жидкости/мин (при нормальном давлении).

После 20-24 часового инкубирования используют 100 л этой культуры для засева 600 л ферментационной

инкубирования культуры продуцентом при методом диффузии в агар с использованием Bacillus subtilis АТСС 6633 в качестве тест-микроорганизма.

П р и м е р 2. Вегетативный посевной материал Str. noursei выращивают, как описано в примере 1. По 10 мл 48-часовой культуральной жидкости используют для засева 2-й посевной среды. Эта среда имеет такой же состав, как и среда 1-й стадии, и ее

40

среды. Эта среда заранее простерили- зована 1-часовым нагреванием до 180 С

среды. Эта среда заранее простерили- зована 1-часовым нагреванием до 180 С

стерилизуют таким же образом.

Среду в порциях по 400 мл заливают .j. (общая емкость 1000 л; имеются уст- - .4.«-,. ройства для перемешивания, подачи

стерильного воздуха и регулирования температурного режима).

Используемая для этого питательная среда Во-32 имеет следующий состав,%: картофельньй крахмал 3,2; глюкоза 2,9; соевая мука обезжиренная 1,4; нитрат аммония 0,7; сульфат магния кристаллический 0,2; хлористый натрий 0,1; карбонат кальция 0,6; под- 55 солнечное масло 0,3.; сульфат цинка кристаллический 0,048; водопроводная вода для получения 100 мл,.рН 5,6в закупоренные ватной пробкой широкогорлые колбы емко.стью 2500 мл. Посевы инкубируют при 29 °С в течение 24 ч на качалке. По 800 мл получаемого та- 1СИМ образом посевного материала 2-й стадии выращивания используют для засева стерильных ферментационных сред, залитых в количествах по 20 л в заранее термостерилизированные стеклянные ферментаторы емкостью 30 л каждый. Для этого используют указанные в примере 1 среды Во-30 и Во-31, которые дополнительно содер6,1 (перед стерилизацией).

жат еще 0,3% подсолнечного масла в

качестве пеногасителя. Непосредственно после засева добавляют стерильно профильтрованные водные нейтральные растворы приведенных в табл. 3 веществ (максимум 200 мл добавок/20 л среды).

Ферментационные среды инкубируют в течение 120 ч при 26-28°С и коэффициенте аэрации 20 л воздуха/мин (при. нормальном давлении) при пере- меиивании (440 об/мин). В качестве пеногасителя в случае необходимости используют стерильное подсолнечное масло.

Образуемый в процессе ферментации ноурзеотрицин ежедневно определяют микробиологическим способом, как описано в примере 1.

Ир им е р 3. Вегетативный посевной материал Str. noursei выращивают таким же образом и с использованием такой же питательной среды, как описано в примерах 1 и 2.

С помощью восьми полученных выращиванием на качалке 24-часовых культур 2-й стадии засевают 150 л термостерилизованной среды (60 мин при 125°С) описанного состава, залитой в ферментатор из благородной ста- ли (общая емкость 200 л), оснащенный

среды. Эта среда заранее простерили- зована 1-часовым нагреванием до 180 С

6,1 (перед стерилизацией).

Сульфат цинка добавляют в ферментационную среду перед стерилизацией.

Культивирование культуры осуществляют в течение 144 ч при 26-28 С, скорости работы перемешивающего устройства 290 об/мин и коэффициенте аэрации 1 л воздуха и 1 л культураль- ной жидкости/мин (давление 0,14- 0,16 МПа).

Для пеногашения используют по мере необходимости стерильное водосо- держащее подсолнечное масло. Образуемый в процессе ферментации ноурзеот- рицин ежедневно определяют микробиологическим способом как описано в примере 1.

Полученные результаты приведены в табл. 4.

Для вьщеления антибиотика 500 л культуральной жидкости с содержанием ноурзеотрицина 4000 мкг/л подкусляют щавелевой кислотой до значения рН

Получают 100 г белого ноурзеотрицин-гидрохлори жанием ноурзеотрицина 50

30

4,0 и сепарированием отделяют от твердых веществ. Затем фильтрат нейт- 25 10,0% сульфатной воды, рализуют 30%-ным водным раствором NaOH и вновь сепарируют для отделения дополнительных продуктов флокуля- ции. Для адсорбции антибиотика нейтрализованный фильтрат культуры фильтруют со скоростью протекания 70 л/ч через колонну, заполненную 70 л Вофа- тита СР-300 (натриевая форма). Адсор- бат промывают 50 л деионизированной воды, затем О,1 н. уксусной кислотой до кислотности рН 5,5 протока и еще 15 л воды. Элюирование антибиотика осуществляют 50 Л 1,0 н. НС1 и затем деионизированной водой, причем элюат принимают раздельно в двух фракциях: фракцию I до перехода элюата в сторону кислых значений, а фракцию II в качестве кислого элюата.

35

40

Формула изобр

Способ получения ноур путем культивирования шт myces noursei IMET lA 38 питательной среде, содер точники углерода и азота ные соли и стимулятор ан разования, в глубинных а

ловиях при 25-30 С в теч 10 дней с последующим вь левого продукта из фильт ральной жидкости, отл щийся тем, что, с ц ния расхода стимулятора нии выхода антибиотика, стимулятора антибиотикоо используют 0,025-0,25 мм натрия, 0,05-2,0 ммоль б на или амиталя, или 0,15 сульфата цинка этом стимулятор вводят л ственно в питательную ср рилизации, либо в процес рования до завершения эк ной фазы роста продуцент

Нейтральную фракцию I (около 50 л) выпаривают до патоки непосредственно в вакууме при температуре макси- мум 40°С (около 4 л). Этот остаток растворяют в 60 л метанола. После фильтрации метанолового раствора при перемешивании порциями прибавляют всего 260 л ацетона, осаждают ноур

зеотрицин-гидрохлорид. Осадок отфильтровывают, промывают 13 л смеси метанола:ацетона (1:3; V:V) и затем еще 8 л абсолютного ацетона и сушат в вакууме над концентрированной серной кислотой или пятиокисью фосфора.

Получают 740 г белого аморфного ноурзеотрицин-гидрохлорида с содержанием ноурзеотрицина 950 ед/мг и 5,4% сульфатной золы.

К солянокислой фракции II 15л прибавляют порциями при перемешивании анионообменник Бофатит L-150 (ОН-фор- ма) до нейтральной реакции раствора. После отфильтровывания ионообменника фильтрат концентрируют и обрабатывают как и фракцию I, причем используемые качества растворителей соответственно уменьшены.

Получают 100 г белого аморфного ноурзеотрицин-гидрохлорида с содержанием ноурзеотрицина 500 ед/мг

10,0% сульфатной воды,

10,0% сульфатной воды,

Формула изобретения

Способ получения ноурзеотрицина путем культивирования штамма Strepto- myces noursei IMET lA 3890 в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода и азота, минеральные соли и стимулятор антибиотикооб- разования, в глубинных аэробных ус

ловиях при 25-30 С в течение 3- 10 дней с последующим вьщелением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью снижения расхода стимулятора при сохранении выхода антибиотика, в качестве стимулятора антибиотикообразования используют 0,025-0,25 ммоль азида натрия, 0,05-2,0 ммоль бренцкатехи- на или амиталя, или 0,15-1,75 ммоль сульфата цинка или -аланина, при этом стимулятор вводят либо непосредственно в питательную среду до стерилизации, либо в процессе культивирования до завершения экспоненциальной фазы роста продуцента.

Примечание. Среда Во-30.

Таблица 1

1)

Содержание ноурзеотрицина мкг/мл.

Без добавки (контроль)

Примечание. Среда Во-31.

Концентрация добавки, ммоль

Азид натрия 0,125 Цэренцкатехин 0,500 Бренцкатехин 1,250

1390242

12 Т а б л и ц а 2

620

ТаблицаЗ

Содержание ноурзеотрицина,

мкг/мл

Во-30

I

Среда Во-31 1835

169

396

13

Продолжение табл.3

Концентрация добавки, ммоль

Сульфат цинка 0,750 445

Без добавки

(контроль)98

Концентрация добавки

Содержание ноурзеотрицина, мкг/мл, при продолжительности

культивирования, ч

24

Г 48 Г 72 I 96 I 120 I

56 210

65 200

990 2377

530

760

|Содержание ноурзеотрицина, мкг/мп

|Среда Во-30 j Среда Во-31

1860

Таблица4

144

4876 5020

760

865

850