НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР Российский патент 2002 года по МПК G01N33/545 A61K39/215 

Изобретение относится к области диагностики, ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к получению наборов для обнаружения антител к вирусу инфекционного бронхита кур (ИБК) иммуноферментным анализом (ИФА), и может быть использовано при диагностике ИБК в научно-исследовательских учреждениях, региональных и областных ветеринарных лабораториях и при изготовлении указанных наборов на предприятиях биологической промышленности.

ИБК - это вирусное высококонтагиозное заболевание, характеризующееся поражением респираторного тракта почек, тонкого отдела кишечника, яичников и яйцевода, а также снижением яйценоскости и дифференциацией скорлупы. Возбудителем болезни является РНК-содержащий вирус из семейства Coronaviridae. В настоящее время болезнь распространена в большинстве стран Европы, Америки и Азии, в Австралии, Японии, России и др., которые имеют развитое промышленное птицеводство. Основным источником ИБК является больная и переболевшая птица, выделяющая вирус со слюной, истечениями из носовых отверстий и глаз, при кашле и с фекалиями, контаминируя объекты внешней среды: воздух, воду, подстилку, предметы ухода и т.д., которые служат средствами распространения возбудителя. Вирус передается вертикально и горизонтально. Однако основным способом передачи считается аэрогенный путь. При инфицировании интактной птицы в полевых условиях заболеваемость может достигать 90% с летальностью от 5 до 30%, а при ассоциированной инфекции - до 60% и более. Инфекция не имеет сезонности и поражает птиц всех возрастов. Экономический ущерб складывается за счет падежа, снижения яичной продуктивности, а также из-за затрат на проведение ветеринарно-санитарных мероприятий, в том числе специфическую профилактику. Предрасполагающими факторами вспышки ИБК могут служить возбудители инфекционного ларинготрахеита, бурсита (болезни Гамборо), адено- и реовирусных инфекций, колисептицемии, сальмонеллеза, кампилобактериоза и др. , а также различные стресс-факторы.

Важными средствами борьбы против ИБК является своевременная диагностика заболевания и его вакцинопрофилактика. ИБК протекает остро, с характерной клиникой заболевания. При острой форме болезни на первый план выступают клинические и патологоанатомические признаки, свойственные вторичным инфекциям, что создает затруднения при постановке диагноза. Диагноз на ИБК устанавливают на основании клинических, патологоанатомических и эпизоотических данных, а также вирусологических и серологических исследований.

Серологическая диагностика ИБК является наиболее распространенной как в аспекте ретроспективного отслеживания возможных вспышек заболевания, так и оценки эффективности его специфической профилактики. Для обнаружения вирусного антигена или специфических антител, свидетельствующих о контакте птиц с вирусом, используют различные серологические тесты, позволяющие выявлять комплексы антиген-антитело (иммунные комплексы). Такими тестами являются РЗГА, РДП, РПГА, РН, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) и др. , в которых исследуют сыворотки крови переболевших птиц. Наиболее простыми, дешевыми и высокопроизводительными методами антител являются РЗГА, РТГА и твердофазный ИФА (1). Для массового серологического обследования птиц на наличие антител к вирусу ИБК чаще используют высокопроизводительный и автоматизированный твердофазный ИФА. Для выявления антител к вирусу ИБК и определения их концентрации в сыворотках крови получил распространение непрямой вариант твердофазного ИФА, в котором исследуемый образец взаимодействует с антигеном, иммобилизованном на планшете из оптически прозрачного полимера с 96 лунками. Далее антитела в составе иммунных комплексов реагируют с конъюгатом. Результаты анализа с высокой точностью фиксируют средствами спектрофотометрии. Для обнаружения и оценки титра антигена вируса ИБК в биологических материалах широко применяют непрямой сэндвич-вариант ИФА, при осуществлении которого исследуемый антиген вначале улавливается специфическими антителами, иммобилизованными на планшете, а затем выявляется детекторными антителами, с которыми взаимодействует конъюгат. Результаты анализа фиксируют также с помощью спектрофотометра.

Достоинством ИФА являются высокая чувствительность и специфичность, возможность проведения масштабных исследований в полевых условиях, оперативность проведения анализов, небольшие объемы исследуемых проб и возможность автоматизации практически всех стадий выполнения реакции, включая регистрацию и обработку получаемых результатов (2).

В настоящее время фирмы, специализирующиеся на производстве средств для молекулярно-биологической диагностики, выпускают специальные наборы для проведения ИФА с целью обнаружения сывороточных антител к вирусам, вызывающим различные заболевания кур, в том числе и ИБК.

Известен набор для определения антител к вирусам ИББ, НБ и ИБК у птиц в крови, сыворотке крови или яичном желтке (полуколичественный метод) в ИФА. Антигены вирусов ИББ, НБ и ИБК нанесены отдельно на пластиковую гребенку. Реакция протекает внутри ячеек проявляющих пластин. В состав набора включены 3 карточки гребенки "Immunocomb", 3 проявляющие пластины, 3 листка бумаги для образцов с предварительно нанесенными дисками, 4 ланцета для взятия проб крови, 1 пинцет, 1 калибровочная цветовая шкала "CombScale", 1 пробирка с сывороткой для положительного контроля, 1 пробирка с сывороткой для отрицательного контроля, график "CombScore". Набор используется для оценки эффективности вакцинации, определения наиболее приемлемых сроков вакцинации и периодического серологического анализа стад с целью быстрой и эффективной диагностики заболеваний (3).

Известен набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ИБК, иммобилизованный на твердом носителе, положительный и отрицательный контроли, препарат козьих антител к куриным IgG, конъюгированных с пероксидазой хрена, с гентамицином, буфер для разведения проб, буфер для разведения концентрата субстрата ТМВ, концентрат субстрата ТМВ, останавливающий раствор (0,12% HF). Значения титра антител определяют по формуле: IgT=1,09(IgS/P)+3,39 (4).

Известен набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ИБК,иммобилизованный на твердом носителе, положительную и отрицательную контрольные сыворотки, раствор козьих антител на куриных IgG, конъюгированных с пероксидазой хрена, буфер для разведения сывороток и конъюгата, субстратный раствор ABTS, 5-кратный концентрат SDS (останавливающий раствор), промывочный буфер (20-кратный концентрат). Значения титра антител определяют по формуле: IgT=1,642(IgS/P) + 3,568 (5).

Известен набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ИБК, иммобилизованный на твердом носителе, положительный и отрицательный контроли, конъюгат моноклональных антител к штамму М41 вируса ИБК с пероксидазой хрена, концентрат буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов, субстратный буфер АБТС, детергент, краситель (6).

Общим недостатком указанных наборов является то, что они импортные, что определяет высокую себестоимость соответствующих исследований.

Известен также карбоксилсодержащий катионит КБ-4-П2, который является органическим ионообменным веществом слабокислотного типа в натриевой форме. Известно его применение для селективного удаления небольших количеств двухвалентных катионов из смесей с большими концентрациями одновалентных катионов, для очистки катионного обмена (7).

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ИБК, иммобилизованный на твердом носителе, сухие положительную сыворотку крови кур к вирусу ИБК, отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ИБК и антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащие 5% сахарозы или желатозы, или лактозы, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов, субстратный буфер, краситель, детергент и гидроперит (8).

Недостатки набора - прототипа состоят в его низкой активности и специфичности, а также высокой себестоимости изготовления. Это объясняется тем, что в наборе-прототипе используются лиофилизированные биокомпоненты, сложность получения которых заключается в том, что для лиофилизации необходимо использовать оптимальные объемы нативного материала (минимум 0,5 см³), иначе невозможно получить нормальную таблетку. Даже используя для лиофилизации такие минимальные объемы, существует опасность размораживания материала при загрузке и потери активности при высушивании, особенно конъюгата и специфической сыворотки. Процесс лиофилизации с предварительным замораживанием продолжается около 3 сут. Кроме того, при регидратации таблеток и разведении конъюгата до рабочего состояния после использования излишки ценных биокомпонентов подвергают утилизации, так как они не подлежат хранению.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка набора для определения антител к вирусу ИБК в ИФА, обладающего более высокой активностью и специфичностью и низкой себестоимостью изготовления.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении активности и специфичности набора и снижении себестоимости его изготовления.

Указанный технический результат достигнут созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков:
1. Набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА.

1.1. Очищенный и инактивированный антиген вируса ИБК, иммобилизованный на твердом носителе.

1.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.2.1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Положительная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
1.2.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК, полученная контактным обезвоживанием.

1.3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.3.1. Сухая отрицательная сыворотка крови кур к вирусу ИБК и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Отрицательная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
1.3.2. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, полученная контактным обезвоживанием.

1.4. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащий карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.4.1. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Антивидовой иммунопероксидазный конъюгат - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
1.4.2. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.

1.5. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов.

1.5.1. В качестве буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трио-буферный раствор.

1.6. Субстратный буфер.

1.6.1. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер.

1.7. Детергент.

1.7.1. Из детергентов набор содержит твин-20.

1.8. Краситель.

1.8.1. Из красителей набор содержит ортофенилендиамин (ОФД).

1.8.2. Из красителей набор содержит АБТС.

1.9. Гидроперит.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1. Набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА.

1.1. Очищенный и инактивированный антиген вируса ИБК, иммобилизованный на твердом носителе.

1.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.4. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащий карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.5. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов.

1.6. Субстратный буфер.

1.7. Детергент.

1.8. Краситель.

1.9. Гидроперит.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования:
1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Положительная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК, полученная контактным обезвоживанием.

3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Отрицательная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, полученная контактным обезвоживанием.

5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Конъюгат - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
6. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.

7. В качестве буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор.

8. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер.

9. Из детергентов набор содержит твин-20.

10. Из красителей набор содержит ОФД.

11. Из красителей набор содержит АБТС.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый набор и совпадающим и с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1. Набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА.

1.2. Очищенный и инактивированный антиген ИББ кур, иммобилизованный на твердом носителе.

1.3. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК.

1.4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур.

1.5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур.

1.6. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов.

1.7. Субстратный буфер.

1.8. Детергент.

1.9. Краситель.

1.10. Гидроперит.

По сравнению с набором-прототипом существенными отличительными признаками предлагаемого набора являются:
1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

2. Сухая отрицательная сыворотка кур, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

3. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащий карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования:
1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Положительная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК, полученная контактным обезвоживанием.

3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Отрицательная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, полученная контактным обезвоживанием.

5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Антивидовой иммунопероксидазный конъюгат - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
6. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.

7. В качестве буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор.

8. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер.

9. Из детергентов набор содержит твин-20.

10. Из красителей набор содержит ОФД.

11. Из красителей набор содержит АБТС.

Предлагаемый набор обладает более высокой активностью и специфичностью и низкой себестоимостью изготовления.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого набора, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. В результате поиска установлено следующее.

Известно использование карбоксилсодержащего катионита КБ-4П-2 для селективного удаления небольших количеств двухвалентных катионов из смесей с большими концентрациями одновалентных катионов, а также для очистки стрептомицина и других реакций катионного обмена (9). Для высушивания микроколичеств иммуноспецифических компонентов предлагаемого набора авторами использован впервые карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2, при этом авторами обнаружено новое, ранее неизвестное свойство катионита КБ-4П-2 не изменять нативные характеристики иммуноспецифических компонентов при обезвоживании и одновременно повышать их специфичность и активность.

Результаты поиска показывают, что предлагаемое изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены аналогичные решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1
Набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА содержит следующие компоненты: очищенный и инактивированный антиген вируса ИБК, штамм Н120 или "Чапаевский", нанесенный на пластиковый планшет (два планшета), дополнительно содержащие карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 сухие положительную сыворотку крови кур к вирусу ИБК (одна ампула), отрицательную сыворотку крови кур (одна ампула) и антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобинов кур (одна ампула), а также набор солей для приготовления трис-буферного раствора, используемого для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов и содержащего трис (оксиметил) аминометан в количестве 0,97 г, трис (оксиметил) аминометан гидрохлорид в количестве 6,61 г, хлористый натрий в количестве 11,7 г (три флакона), набор солей для приготовления субстратного буфера, содержащего натрий фосфорнокислый двузамещенный в количестве 5,37 г и лимонную кислоту в количестве 1,57 г (фосфатно-цитратный буфер - два флакона), ОФД (одна таблетка) или АБТС (одна таблетка), детергент твин-20 (один флакон), гидроперит (одна таблетка). Препараты антигена вируса ИБК, контрольных вирусспецифических антител и конъюгата антивидовых антител с пероксидазой хрена могут использоваться как самостоятельные диагностикумы.

Пример 2
Для изготовления антигена вируса ИБК используют производственный штамм Н120 или "Чапаевский", относящиеся к серотипу Массачустс и не требующие адаптации к куриным эмбрионам. Вирус культивируют на 9-11-дневных SPF-эмбрионах кур. Первый пассаж является матровой расплодкой, которую используют для получения необходимого количества вируссодержащего сырья. Для получения матрового вируса вируссодержащим материалом из производственного штамма в объеме 0,2 см³ инокулируют эмбрионы в аллантоисную полость в области пуги. Зараженные куриные эмбрионы помещают в термальную комнату или инкубатор и выдерживают при 37,4^oС и относительной влажности 60-70^oС в течение 72 ч. Каждые 24 ч эмбрионы овоскопируют. Эмбрионы, павшие через 48-72 ч с момента заражения, а также живые зараженные эмбрионы через 72 ч используют для сбора вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости (ВСЭЭЖ). Вскрытие эмбрионов проводят в отдельном помещении с соблюдением правил асептики. ВСЭЭЖ из полости эмбриона отсасывают в стерильные флаконы емкостью 500-1000 см³. Затем полученную ВСЭЭЖ центрифугируют при 2000 g в течение 30 мин. Центрифугированный материал объединяют в 10,0-15,0 дм³ стеклянные бутыли, после чего разливают в стерильные флаконы емкостью 500 см³, заполняя флаконы на 1/3 их объема. Матровый вирус хранят при -40^oС. Для изготовления производственной серии антигена матровый вирус разводят в соотношении 1:10 стерильном физиологическом раствором рН 7,2-7,4 с добавлением антибиотиков. Время контакта антибиотиков с материалом 3 ч при 4-8^oС. Матричный материал разводят в объеме, необходимом для заражения производственной партии куриных эмбрионов из расчета 0,2 см³ на одни эмбрион. Полученный вирус подвергают инактивации. Для этого в полученную ВСЭЭЖ вносят аминоэтилэтиленимин до концентрации 0,15-0,2%. Инактивацию ведут при 37,0±0,5^oС в течение 48 ч с периодическим перемешиванием смеси.

По истечении срока инактивации для нейтрализации инактиванта к полученному антигену добавляют тиосульфат натрия до концентрации 0,03 М. Нейтрализацию проводят при комнатной температуре в течение 2 ч при перемешивании смеси. Инактивированный вирус контролируют на авирулентность путем трех последовательных пассажей длительностью 72 ч на 10 развивающихся куриных эмбрионах в возрасте 9-11 сут. После этого антиген осветляют в течение 20 мин при 3000 об/мин на центрифуге "Beckman", очищают и концентрируют через 30% раствор сахарозы 70 мин на высокоскоростной центрифуге "Sorvall" при 25000 об/мин. Затем осадок ресуспендируют в 0,05М трис-НСl с добавлением 0,2 М NaCl pH 7,5 в соотношении 1:100 от первоначального объема вируса. Очищенный, концентрированный и Инактивированный препарат антигена вируса ИБК расфасовывают по 0,5±0,1 см³ и хранят при -70^oС.

Определение специфической активности антигена проводят в непрямом варианте ИФА. Для его постановки антиген разводят в буфере для разведения антигена с 1:25 до 1:800. Каждое разведение вносят в лунки 12 вертикальных рядов 2 планшетов. Вирусспецифическую и неиммунную сыворотки в разведении 1: 100 вносят в первый горизонтальный ряд планшетов. Затем готовят двукратные разведения сывороток от 1:100 до 1:12800. Первый вертикальный ряд планшетов заполняют буфером для испытуемых проб, что служит контролем неспецифической активности исследуемых препаратов. После инкубации в течение 2 ч при 37^oС и 3-кратной промывки буфером для промывания в каждую лунку вносят по 0,1 мл раствора субстрата и выдерживают при комнатной температуре 10-15 мин. Реакцию останавливают внесением в каждую лунку стоп-раствора. Результаты реакции учитывают визуально или с помощью многоканального спектрофотометра Multiskan, Flow. Предельным титром активности препарата считают его максимальное разведение, оптическая плотность которого в 2-2,1 раза превышает таковую отрицательного контроля (реакция с неиммунной сывороткой). К выпуску разрешают препараты антигена вируса ИБК с титром не менее 1:50, контрольной вирусспецифической сыворотки не менее 1:3200.

Прошедший необходимые тесты препарат антигена вируса ИБК используют для иммобилизации на 96-луночные планшеты. Для этого количество антигена, необходимое для изготовления партии наборов, размораживают и готовят рабочее разведение в 0,01 М карбонатнобикарбонатном буфере рН 9,5-9,6. Затем в каждую лунку планшета вносят по 100 мкл рабочего разведения антигена. После инкубации в течение 18 ч при 4^oС раствор антигена удаляют, планшеты промывают буфером, содержащим 0,05 М Трис-НСl с 0,2 М NaCl и 0,1% твина-20, и вносят по 0,1 мл блокирующего раствора, содержащего концентрированный 5-кратный раствор 5% раствора додецилсульфата натрия. Ингибируют 1 ч при комнатной температуре и промывают 3 раза буфером, содержащим 0,05 М трис-НСl с 0,2 NaCl и 0,1% твина 20. Планшеты высушивают на воздухе и упаковывают в полиэтиленовые пакеты поштучно.

Пример 3. Для получения положительной сыворотки кур иммунизируют очищенным, концентрированным и инактивированный антигеном вируса ИБК, полученным так, как описано в примере 2. 10 см³ антигена с содержанием вирусного белка не менее 100 мкг/см³ эмульгируют с равным объемом адъюванта Фрейнда (полного или неполного) на микроизмельчителе ткани РТ-1 в течение 3 мин. Иммунизацию кур проводят двукратно с интервалом 21 сут, причем первую иммунизацию - внутримышечно в дозе 1 см³ в область бедренной мышцы, вторую - внутримышечно в дозе 2 см³ в область грудных мышц по 1 см³ в каждую сторону. Через 7 дней после второй иммунизации проводят пробное взятие крови из подкрыльцовой вены для определения специфической активности сыворотки в ИФА. Кур обескровливают в том случае, если активность сыворотки в РЗГА не ниже 1:12800. Если активность сыворотки ниже, то проводят дополнительную инъекцию очищенным, концентрированным и инактивированным антигеном вируса ИБК с содержанием вирусного белка не ниже 100 мкг/см³. Индивидуальные пробы крови выдерживают сначала при температуре 37±1^oС в течение 30-60 мин, а затем при 4±2^oС в течение суток. Отстоявшуюся сыворотку отсасывают в стерильные пробирки, не допуская попадания эритроцитов и других форменных элементов крови, инактивируют при 57±1^oС в течение 30 мин, консервируют хинозолом 1:1000 и выдерживаний при 4±2^oС не менее 20 дней. Проверку индивидуальных проб сыворотки крови на активность и специфичность проводят в ИФА с набором специфических и нормальных антигенов. Полученную сыворотку смешивают с карбоксилсодержащим катионитом КБ-4П-2 в соотношении, мас.%: 2:98-15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.

Пример 4
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к вирусу ИБК, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, маc. %:
Положительная сыворотка - 2,0
Катионит КБ-4П-2 - 98,0
Результаты испытаний представлены в табл.1.

Представленные в табл. 1 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученную методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 5
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к вирусу ИБК, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КП-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, маc. %:
Положительная сыворотка - 7,0
Катионит КБ-4П-2 - 93,0
Результаты испытаний представлены в табл.2.

Представленные в табл.2 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученного методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 6
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к вирусу ИБК, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет мас.%:
Положительная сыворотка - 15,0
Катионит КБ-4П-2 - 85,0
Результаты испытаний представлены в табл. 3.

Представленные в табл.3 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученную методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 7
Используемую в качестве компонента набора отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ИБК получают от здоровой безлейкозной птицы. К полученной сыворотке добавляют карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 в соотношении, мас.%: 2: 98 - 15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.

Пример 8
В предлагаемом наборе используют антивидовые коммерческие конъюгаты, выпускаемые НИИЭМ имени Н.Ф. Гамалея, представляющие собой глобулиновую фракцию, выделенную из антисыворотки, полученной иммунизацией кур и меченную пероксидазой хрена. К конъюгату добавляют карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 в соотношении, мас. %: 2:98 - 15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.

Пример 9
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученный контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Конъюгат - 2,0
Катионит КБ-4П-2 - 98,0
Результаты испытаний представлены в табл. 4.

Представленные в табл. 4 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 10
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученного контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Конъюгат - 7,0
Катионит КБ-4П-2 - 93,0
Результаты испытаний представлены в табл.5.

Представленные в табл. 5 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 11
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученного контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Конъюгат - 15,0
Катионит КБ-4П-2 - 85,0
Результаты испытаний представлены в табл.6.

Представленные в табл.6 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в диагностике ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА, приготовленный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой активностью и специфичностью, а также низкой себестоимостью изготовления.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
"Набор для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур"
1. Вишняков И.Ф., Лагуткин Н.А. и др. Коронавирусные инфекции. Покров, ВНИИВВ и М., Россельхозакадемия, 1997, 42-55.

2. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я. и др. Вирусные болезни животных. М., ВНИТИБП, 1998, 65-84.

3. Временное наставление по применению диагностического набора "Иммунокомб IBD/ND/IBV для определения антител против возбудителей инфекционной бурсальной болезни (ИББ), болезни Нью-Кастла (БН) и инфекционного бронхита (ИБ) у птиц (фирма "Биогал", Израиль). Одобрено Советом по ветеринарным препаратам. Протокол 2 от 27.03.96 г. 10 с.

4. Наставление к набору "Infectous Bronchitis virus Antibody Test Kit". IDEXX Laboratories, Inc., One IDEXX Drive, Westbrook, Maine 04092 USA.

5. Временное наставление по применению набора для выявления антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом производства фирмы KPL (США). Приложения на 4 листах к сертификату соответствия РОСС US. ФВ01. А03398 02874792, выданному ИЦ ВГНКИ (РОСС RU. 0001.21.ФВ02) на основании протокола испытаний 5/229 от 15.03.99г.

6. Moving V., Czifra G. et al. A monoclonal antibody blocking ELISA for the detection of IBV antibodies in fowl. (SVANOVA Biotech., National Veterinary Institute, Upsala, Sweden). ADV. Exp. Med. Biol., 1998, 440, 495-499.

7. Краткая химическая энциклопедия М., ГНИ "Сов. энциклопедия", 1963, т. 2, 299-306.

8. Наставление по применению набора для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом. Утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России от 25.11.99 г. 13-7-2/1791, 6 с. (прототип).

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Набор содержит очищенный и инактивированный антиген вируса ИБК, иммобилизированный на твердом носителе, сухую положительную сыворотку крови кур к вирусу ИБК, отрицательную сыворотку крови кур и сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащие карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. Из неспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор, фосфатно-цитратный буфер, краситель ортофенилендиамин или 2,2'-азино-ди[3-этил]бензтиазолинсульфоновую кислоту, детергент твин-20 и гидроперит. Набор обладает более высокой активностью и специфичностью. 11 з.п.ф-лы, 6 табл.

1. Набор для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным анализом, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса инфекционного бронхита кур, иммобилизованный на твердом носителе, сухую положительную сыворотку крови кур к вирусу инфекционного бронхита кур, сухую отрицательную сыворотку крови кур и сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, а также буферный раствор для разведения и промывки, субстратный буфер, детергент, краситель и гидроперит, отличающийся тем, что сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу инфекционного бронхита кур, сухая отрицательная сыворотка крови кур и сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур дополнительно содержат карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 2. Набор по п. 1, отличающийся тем, что сухая положительная сыворотка и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас. %:
Положительная сыворотка - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
3. Набор по п. 1, отличающийся тем, что он содержит сухую положительную сыворотку крови кур к вирусу инфекционного бронхита кур, полученную контактным обезвоживанием. 4. Набор по п. 1, отличающийся тем, что сухая отрицательная сыворотка крови кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас. %:
Отрицательная сыворотка - 2 - 15
Катионит КБ-4Б-2 - До 100
5. Набор по п. 1, отличающийся тем, что он содержит сухую отрицательную сыворотку крови кур, полученную контактным обезвоживанием. 6. Набор по п. 1, отличающийся тем, что сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас. %:
Конъюгат - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
7. Набор по п. 1, отличающийся тем, что он содержит сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием. 8. Набор по п. 1, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора он содержит трис-буферный раствор. 9. Набор по п. 1, отличающийся тем, что в качестве субстратного буфера он содержит фосфатно-цитратный буфер. 10. Набор по п. 1, отличающийся тем, что из детергентов он содержит твин-20. 11. Набор по п. 1, отличающийся тем, что из красителей он содержит ортофенилендиамин. 12. Набор по п. 1, отличающийся тем, что из красителей он содержит 2,2'-азино-ди[3-этил] бензтиазолинсульфоновую кислоту.