Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к получению наборов для обнаружения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76) кур иммуноферментным анализом (И ФА), и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях и предприятиях биологической промышленности при изготовлении указанных наборов.
ССЯ-76 - заболевание птицы, вызываемое ДНК-содержащим вирусом, который относится к семейству Adenoviridae. Заболевание сопровождается резким, но непродолжительным снижением яичной продуктивности кур-несушек, ухудшением качества яиц, появлением яиц с мягкой деформированной скорлупой или без скорлупы.
Впервые установленный в 1976 году в Северной Ирландии ССЯ-76 в последующие годы регистрировали в других странах Европы, Южной Америки, Азии, Австралии и Африки [1, 2, 3].
В начале 80-х годов были выявлены случаи ССЯ-76 в нашей стране, что было подтверждено обнаружением в крови переболевших птиц антигемагглютининов к вирусу ССЯ-76 [4, 5] . В крупных птицеводческих хозяйствах ССЯ-76 наносит существенный экономический ущерб, который усугубляется затратами на оздоровительные мероприятия.
Диагноз на ССЯ-76 устанавливают комплексно на основании данных эпизоотологического обследования хозяйства, клинических признаков и патолого-анатомических изменений у пораженной птицы и результатов лабораторных исследований. Принятая в нашей стране схема ретроспективной диагностики предусматривает выявление антител с помощью традиционных серологических реакций: реакции диффузионной преципитации (РДП), реакции нейтрализации (РН) и реакции торможения гемагглютинации (РТГА).
Однако традиционные методы диагностики обладают рядом недостатков: более низкой чувствительностью и производительностью, большими затратами времени на получение результатов, недоступностью широкому кругу практических учреждений.
Разработка и применение иммунохимических методов, в частности ИФА, расширило возможность выявления специфических антител к возбудителям вирусных болезней, открыло перспективы устранения многих технических проблем лабораторной диагностики и повышение ее стандартизации и достоверности. Являясь одним из сравнительно "молодых" методов, базирующихся на использовании антител, конъюгированных с различными ферментами, ИФА по многим параметрам превосходит традиционные методы диагностики: по чувствительности, специфичности и производительности, быстроте получения результатов, возможности стандартизации условий постановки анализа, доступности широкому кругу практических учреждений. В связи с интенсивным развитием птицеводства диагностика заболеваний птиц методом ИФА с использованием наборов автоматизированных систем анализа приобретает все большее значение, и проблема их совершенствования остается актуальной.
Известен набор для определения антител к вирусу ССЯ-76 кур в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ССЯ-76, иммобилизованный на твердом носителе, положительную сыворотку крови кур к вирусу ССЯ-76, отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ССЯ-76, лиофильно высушенный антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов, субстратный буфер, детергент твин-20, краситель, 5- аминосалициловую кислоту, гидроперит [6].
Недостатки данного набора состоят в его низкой активности и специфичности, а также высокой себестоимости изготовления.
Известен также карбоксилсодержащий катионит КБ-4-П2, который является органическим ионообменным веществом слабокислотного типа в натриевой форме. Известно его применение для селективного удаления небольших количеств двухвалентных катионов из смесей с большими концентрациями одновалентных катионов, для очистки стрептомицина и других реакций катионного обмена [7].
Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является набор для определения антител к вирусу ССЯ-76 кур в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ССЯ-76, иммобилизованный на твердом носителе, сухие положительную сыворотку крови кур к вирусу ССЯ-76, отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ССЯ-76 и антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащие 5% сахарозы или лактозы, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов, субстратный буфер, краситель, детергент и гидроперит [8, 9].
Недостатки набора-прототипа состоят в его низкой активности и специфичности, а также высокой себестоимости изготовления. Это объясняется тем, что в наборе-прототипе используются лиофилизированные биокомпоненты, сложность получения которых заключается в том, что для лиофилизации необходимо использовать оптимальные объемы нативного материала (минимум 0,5 см3), иначе невозможно получить нормальную таблетку. Даже используя для лиофилизации такие минимальные объемы, существует опасность размораживания материала при загрузке и потери активности при высушивании, особенно конъюгата и специфической сыворотки. Процесс лиофилизации с предварительным замораживанием продолжается около 3 суток. Кроме того, при регидратации таблетки и разведении конъюгата до рабочего состояния перед использованием излишки ценного биокомпонента подвергают утилизации, так как он не подлежит хранению.
В задачу создания настоящего изобретения входила разработка набора для определения антител к вирусу ССЯ-76 кур в ИФА, обладающего более высокой активностью и специфичностью и низкой себестоимостью изготовления.
Технический результат от использования изобретения заключается в повышении активности и специфичности набора и снижении себестоимости его изготовления.
Указанный технический результат достигнут созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков:
1. Набор для определения антител к вирусу ССЯ-76 кур в ИФА содержит:
1.1. Очищенный и инактивированный антиген вируса ССЯ-76, иммобилизованный на твердом носителе.
1.2. Сухую положительную сыворотку крови кур к вирусу ССЯ-76, дополнительно содержащую карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.
1.2.1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ССЯ-76 и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
сухая положительная сыворотка - 2-15
катионит КБ-4П-2 - до 100
1.2.2. Сухую положительную сыворотку крови кур к вирусу ССЯ-76, полученную контактным обезвоживанием.
1.3. Сухую отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ССЯ-76, дополнительно содержащую карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.
1.3.1. Сухая отрицательная сыворотка крови кур к вирусу ССЯ-76 и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
сухая отрицательная сыворотка - 2-15
катионит КБ-4П-2 - до 100
1.3.2. Сухую отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ССЯ-76, полученную контактным обезвоживанием.
1.4. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащий карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.
1.4.1. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
антивидовой иммунопероксидазный конъюгат - 2-15
катионит КБ-4П-2 - до 100
1.4.2. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.
1.5. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов.
1.5.1. Из буферных растворов для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор.
1.6. Субстратный буфер.
1.6.1. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер.
1.7. Детергент.
1.7.1. Из детергентов набор содержит твин-20.
1.8. Краситель.
1.8.1. Из красителей набор содержит ортофенилендиамин.
1.9. Гидроперит.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1. Набор для определения антител к вирусу ССЯ-76 кур в ИФА содержит:
1.1. Очищенный и инактивированный антиген вируса ССЯ-76, иммобилизованный на твердом носителе.
1.2. Сухую положительную сыворотку крови кур к вирусу ССЯ-76, дополнительно содержащую карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.
1.3. Сухую отрицательную сыворотку крови кур, дополнительно содержащую карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.
1.4. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащий карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.
1.5. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов.
1.6. Субстратный буфер.
1.7. Детергент.
1.8. Краситель.
1.9. Гидроперит.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования:
1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ССЯ-76 и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
сухая положительная сыворотка - 2-15
катионит КБ-4П-2 - до 100
2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ССЯ-76, полученная контактным обезвоживанием.
3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур к вирусу ССЯ-76 и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
сухая отрицательная сыворотка - 2-15
катионит КБ-4П-2 - до 100
4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур к вирусу ССЯ-76, полученная контактным обезвоживанием.
5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
сухой конъюгат - 2-15
катионит КБ-4П-2 - до 100
6. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.
7. Из буферных растворов для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор.
8. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер.
9. Из детергентов набор содержит твин-20.
10. Из красителей набор содержит ортофенилендиамин.
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый набор и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1. Набор для определения антител к вирусу ССЯ-76 кур в ИФА.
2. Очищенный и инактивированный антиген вируса ССЯ-76, иммобилизованный на твердом носителе.
3. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ССЯ-76.
4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур.
5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур.
6. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов.
7. Субстратный буфер.
8. Детергент.
9. Краситель.
10. Гидроперит.
По сравнению с набором-прототипом существенными отличительными признаками предлагаемого набора являются:
1. Сухая положительная сыворотка крови кур, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.
2. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.
3. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащий карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования:
1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ССЯ-76 и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
сухая положительная сыворотка - 2-15
катионит КБ-4П-2 - до 100
2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ССЯ-76, полученная контактным обезвоживанием.
3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур к вирусу ССЯ-76 и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
сухая отрицательная сыворотка - 2-15
катионит КБ-4П-2 - до 100
4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур к вирусу ССЯ-76, полученная контактным обезвоживанием.
5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат - 2-15
катионит КБ-4П-2 - до 100
6. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.
7. Из буферных растворов для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор.
8. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер.
9. Из детергентов набор содержит твин-20.
10. Из красителей набор содержит ортофенилендиамин.
Предлагаемый набор обладает более высокой активностью и специфичностью и низкой себестоимостью изготовления.
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого набора, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.
Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".
Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. В результате поиска установлено следующее.
Известно использование карбоксилсодержащего катионита КБ-4П-2 для селективного удаления небольших количеств двухвалентных катионов из смесей с большими концентрациями одновалентных катионов, а также для очистки стрептомицина и других реакций катионного обмена (7). Для высушивания микроколичеств иммуноспецифических компонентов предлагаемого набора авторами использован впервые карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2, при этом авторами обнаружено новое, ранее неизвестное, свойство катионита КБ-4П-2 не изменять нативные характеристики иммуноспецифических компонентов при обезвоживании и одновременно повышать их специфичность и активность.
Результаты поиска показывают, что предлагаемое изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены аналогичные решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".
Сущность изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1.
Набор для диагностики ССЯ-76 кур методом ИФА содержит следующие компоненты: очищенный и инактивированный антиген вируса ССЯ-76 кур, нанесенный на пластиковый планшет (два планшета), дополнительно содержащие карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2, сухие положительную сыворотку крови кур к вирусу ССЯ-76 (одна ампула), отрицательную сыворотку крови кур (одна ампула) и антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур (одна ампула), а также набор солей для приготовления трис-буферного раствора, используемого для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов и содержащего трис (оксиметил)-аминометан в количестве 0,97 г, трис (оксиметил) аминометан гидрохлорид в количестве 6,61 г, хлористый натрий а количестве 11,7 г (три флакона), набор солей для приготовления субстратного буфера, содержащего натрий фосфорнокислый двузамещенный в количестве 5,37 г и лимонную кислоту в количестве 1,57 г (фосфатно-цитратный буфер - два флакона), ортофенилендиамин (1 таблетка), детергент твин-20 (один флакон), гидроперит (1 таблетка).
Пример 2.
Для изготовления антигена вируса ССЯ-76 используют штамм "В 8/78". Из матричной расплодки производственного штамма "В8/78" вируса ССЯ-76 готовят разведения 1: 10 на стерильном физиологическом растворе (pH 7,2- 7,4) с добавлением антибиотиков и нистатина. Время контакта антибиотиков с материалом 3 часа при температуре 4-8oС. Матричный материал разводят в объеме, необходимом для заражения партии утиных эмбрионов из расчета 0,2 см2 на один эмбрион. Полученный вирус инокулируют в аллантоиссную полость 10-суточных утиных эмбрионов и инкубируют при 37,7oC. У эмбрионов, инкубированных в течение 96 часов, отбирают экстраэмбриональную жидкость (ЭЭЖ), которую центрифугируют при 2000 g в течение 30 мин. Центрифугированный материал объединяют в 10,0-15,0 дм3 стеклянные бутыли, после чего разливают в стерильные флаконы емкостью 500 см3, заполняя флаконы на 1/3 их объема. Материал хранят при -40oC. Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) в конечной концентрации 0,15-0,2%. Инактивацию ведут в течение 48 часов при 37±0,5oC. Периодически смесь перемешивают. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют добавлением тиосульфата натрия до конечной концентрации 0,03 М. Нейтрализацию проводят при комнатной температуре в течение 2 часов при перемешивании смеси. Полученный антиген контролируют на авирулентность и гемагглютинирующую активность. Полноту инактивации инфекционных свойств вируса ССЯ-76 устанавливают в РГА с ЭЭЖ, полученной от заражения утиных эмбрионов после третьего пассажа. РГА должна быть отрицательной. Гемагглютинирующую активность инактивированного вируса ССЯ-76 определяют в РГА. Титр инактивированного вируса в РГА должен быть не ниже 1:4096. Полученный антиген очищают от балластных примесей центрифугированием при 2000 g в течение 10 минут и концентрируют полиэтиленгликолем (ПЭГ) 6000 (М.м.), который вносят до концентрации 7% и оставляют на 16-18 часов при +4oC. Осадок получают центрифугированием при 17000 g в течение 20 минут с последующим его ресуспендированием в изотоническом растворе трис-HCl-буфера pH 7,6-7,8 (1/50 исходного объема) и очищают равным объемом хлороформа. Полученный таким образом антиген фракционируют дополнительно в преформированном ступенчатом градиенте плотности хлористого цезия и сахарозы. Фракционирование градиента проводят с помощью проточного спектрофотометра "Увикорд" (LKB) при 254 нм. Препараты концентрата антигена хранят при -70oC. Чистоту и гомогенность антигенных препаратов контролируют электронной микроскопией, спектрофотометрией и электрофорезом вирусных белков в SDS-ПААГе.
Специфическую активность антигена определяют в непрямом варианте ИФА. Для этого антиген разводят в буфере для разведения антигена с 1:50 до 1: 51200. Каждое разведение вносят в лунки двенадцати вертикальных рядов двух планшетов. Положительная и отрицательная сыворотки в разведении 1:100 вносятся в 1-й горизонтальный ряд планшетов. Затем готовят двукратные разведения сывороток от 1:100 до 1:12800. Первый вертикальный ряд планшетов заполняют буфером для испытуемых проб, что служит контролем неспецифической активности исследуемых препаратов. Результаты реакции учитывают визуально или с помощью спектрофотометра-ридера SLT (Австрия). Предельным титром активности препарата считают его максимальное разведение, оптическая плотность которого в 2-2,1 раза превышает таковую отрицательного контроля (реакция с отрицательной сывороткой). Затем готовят планшеты с антигеном. Количество антигена, необходимое для изготовления партии наборов, размораживают и готовят рабочее разведение в буфере для разведения антигена. Затем в каждую лунку планшета вносят по 0,1 см3 рабочего разведения антигена. После инкубации в течение 18 часов при 4oC раствор антигена удаляют, планшеты промывают буфером и вносят по 0,1 см3 блокирующего раствора. Инкубируют 1 час при комнатной температуре и промывают 3 раза буфером. Высушивают планшеты на воздухе и упаковывают в полиэтиленовые пакеты поштучно.
Пример 3.
Для приготовления положительной сыворотки в качестве доноров используют кур в возрасте 110-120 дней.
Для этого 10 см3 полученного антигена с содержанием вирусного белка не менее 100 мкг/см3 эмульгируют с равным объемом адъюванта Фрейда (полного или неполного) на микроизмельчителе ткани РТ-1 в течение 3 минут. Полученным препаратом иммунизируют кур двукратно с интервалом 21 сутки, причем первую иммунизацию - внутримышечно в дозе 1,0 см3 в область бедренной мышцы, вторую - внутримышечно в дозе 2,0 см3 в область грудных мышц по 1,0 см3 в каждую сторону. Через 7 дней после второй иммунизации проводят пробное взятие крови из подкрыльцовой вены для определения специфической активности сыворотки в ИФА. Кур обескровливают в том случае, если активность сыворотки в РТГА не ниже 1: 1024-1: 2048. Если активность сыворотки ниже, то проводят дополнительную инъекцию очищенным концентрированным инактивированным антигеном вируса ССЯ-76 с содержанием вирусного белка не ниже 100 мкг/см3. Индивидуальные пробы крови выдерживают сначала при 37±1oC в течение 30-60 мин, а затем при 4±2oC в течение суток. Отстоявшуюся сыворотку отсасывают в стерильные пробирки и, не допуская попадания эритроцитов и других форменных элементов крови, инактивируют при 57±1oC в течение 30 минут, консервируют хинозолом 1: 1000 и выдерживают при 4±2oC не менее 20 дней. Проверку индивидуальных проб сыворотки крови на активность и специфичность проводят в ИФА с набором специфических и нормальных антигенов.
Для составления серийного препарата используют пробы с титром не ниже 1: 1024 и не связывающиеся в четырехкратном титре с нормальным антигеном. Полученную сыворотку смешивают с карбоксилсодержащим катионитом КБ-4П-2 в соотношении, мас. %, 2:98-15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.
Пример 4.
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к вирусу ССЯ-76, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
сухая положительная сыворотка - 2,0
катионит КБ-4П-2 - 98,0
Результаты испытаний представлены в таблице 1.
Представленные в таблице 1 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ССЯ-76 превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученную методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.
Пример 5.
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к вирусу ССЯ-76, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
сухая положительная сыворотка - 7,0
катионит КБ-4П-2 - 93,0
Результаты испытаний представлены в таблице 2.
Представленные в таблице 2 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ССЯ-76 превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученную методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.
Пример 6.
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к вирусу ССЯ-76, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
сухая положительная сыворотка - 15,0
катионит КБ-4П-2 - 85,0
Результаты испытаний представлены в таблице 3.
Представленные в таблице 3 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ССЯ-76 превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученную методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.
Пример 7.
Используемую в качестве компонента набора отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ССЯ-76 получают от здоровой безлейкозной птицы, гипериммунизированной нормальным антигеном вируса ССЯ-76, полученного в 11-12-дневных развивающихся утиных эмбрионах. Полученную сыворотку контролируют в РТГА на наличие вируса ССЯ-76. При получении отрицательного результата материал используют для изготовления целевого продукта. К полученной сыворотке добавляют карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 в соотношении, мас.%, 2:98-15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.
Пример 8.
В предлагаемом наборе используют антивидовые коммерческие конъюгаты, выпускаемые НИИЭМ имени Н.Ф.Гамалея, представляющие собой глобулиновую фракцию, выделенную из антисыворотки, полученной иммунизацией кур, и меченную пероксидазой хрена. К конъюгату добавляют карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 в соотношении, мас.%, 2:98-15:85 (указанные отношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.
Пример 9.
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученный контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
конъюгат - 2,0
катионит КБ-4П-2 - 98,0
Результаты испытаний представлены в таблице 4.
Представленные в таблице 4 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.
Пример 10.
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученный контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
конъюгат - 7,0
катионит КБ-4П-2 - 98,0
Результаты испытаний представлены в таблице 5.
Представленные в таблице 5 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.
Пример 11.
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученный контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
конъюгат - 15,0
катионит КБ-4П-2 - 85,0
Результаты испытаний представлены в таблице 6.
Представленные в таблице 6 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- набор для определения антител к вирусу ССЯ-76 кур в ИФА, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов:
- набор для определения антител к вирусу ССЯ-76 кур в ИФА, приготовленный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой активностью и специфичностью, а также низкой себестоимостью изготовления.
Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".
Источники информации
1. Eck I.H.H., van Davelaar F.G. et al. Dropped egg production soft-shelled and shell-less eggs assotiatted with apperance of precipitins to adenovirus in flocks of laying hens. Avian Pathol., 1976, 5, 261-272.
2. Baxendale W. Egg drop syndrome-76. Veterynary Record., 1978, 102, 285-286.
3. McFerran J.B. Adenovirus infection and "EDS-76". Las memorias del-5 Convencio annual de la Assosicion pacional de especialistas en ciencias avicolas proceeding of the western poultry disease conference and 14-th Colifornia health sympothium. Acapulka, Gro, Mexico, 1980, 22-25, 213-214.
4. Рождественский И.К. и соавт. Синдром снижения яйценоскости - аденовирусная болезнь кур. Ветеринария, 1981, 4, 70-71.
5. Бурцев В.И. и соавт. Синдром снижения яйценоскости. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. Тезисы докл. научн. конф. Покров, 1983, 61-66.
6. Фомина Н.В. Аденовирусная инфекция животных. В. 2 т. Т.2: М.: Колос, 1995, 117-180.
7. Краткая химическая энциклопедия. М., ГНИ, Сов. энциклопедия, 1963, т. 2, 299-306.
8. Временная инструкция по изготовлению и контролю диагностикумов и наборов для определения антител против вируса ССЯ-76 кур иммуноферментным методом. Утверждена директором ВНИИЗЖ 20.08.96 (прототип).
9. ТУ 9380-033-00008064-97 на "Набор для определения антител к вирусу ССЯ-76 иммуноферментным методом", введенные в действие с 22.04.97.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР | 2001 |
|
RU2189042C1 |
| НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ПТИЦ | 2001 |
|
RU2192014C1 |
| НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА ПТИЦ | 2001 |
|
RU2199126C2 |
| НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВОЗБУДИТЕЛЮ РЕСПИРАТОРНОГО МИКОПЛАЗМОЗА ПТИЦ | 2001 |
|
RU2202797C2 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНУ РЕОВИРУСНОГО ТЕНОСИНОВИТА КУР | 2000 |
|
RU2192012C2 |
| ШТАММ "БИСС № 113" ВИРУСА СИНДРОМА СНИЖЕНИЯ ЯЙЦЕНОСКОСТИ - 76 ПТИЦ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ | 2002 |
|
RU2221865C1 |
| ИНАКТИВИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ СИНДРОМА СНИЖЕНИЯ ЯЙЦЕНОСКОСТИ-76 ПТИЦ | 2003 |
|
RU2233671C1 |
| СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ СИНДРОМА СНИЖЕНИЯ ЯЙЦЕНОСКОСТИ-76 ПТИЦ | 2003 |
|
RU2239452C2 |
| НАБОР ДЛЯ РЕТРОСПЕКТИВНОЙ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА ЖИВОТНЫХ | 2001 |
|
RU2196609C2 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ЭНТЕРИТА ГУСЕЙ | 2006 |
|
RU2323743C2 |
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к получению наборов для обнаружения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости -76 (ССЯ-76) кур иммуноферментным анализом. Набор содержит очищенный и инактивированный антиген вируса синдрома снижения яйценоскости - 76, иммобилизованный на твердом носителе, сухие положительную сыворотку крови кур к вирусу синдрома снижения яйценоскости - 76 кур, отрицательную сыворотку к вирусу синдрома снижения яйценоскости - 76 кур и антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, а также буферный раствор для разведения и промывки, субстратный буфер, детергент, краситель и гидроперит. Дополнительно набор содержит сухие положительную сыворотку крови кур к вирусу синдрома снижения яйценоскости - 76, отрицательную сыворотку крови кур к вирусу синдрома снижения яйценоскости - 76 и антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. Это обеспечивает повышение активности и специфичности набора для иммуноферментного анализа, а также снижение себестоимости при его изготовлении. 10 з.п. ф-лы, 6 табл.
Положительная сыворотка - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
3. Набор по п.1, отличающийся тем, что он содержит сухую положительную сыворотку крови кур к вирусу синдрома снижения яйценоскости - 76, полученную контактным обезвоживанием.
Отрицательная сыворотка - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
5. Набор по п.1, отличающийся тем, что он содержит сухую отрицательную сыворотку крови кур к вирусу синдрома снижения яйценоскости - 76, полученную контактным обезвоживанием.
Конъюгат - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
7. Набор по п.1, отличающийся тем, что он содержит сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.
| СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ЛИХОРАДКИ ДОЛИНЫ РИФТ В СЫВОРОТКАХ ЖИВОТНЫХ | 1996 |
|
RU2112245C1 |
| RU 21476150 C1, 10.03.2000 | |||
| НАБОР ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ В РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ | 1996 |
|
RU2119671C1 |
| US 4537768 A1, 27.08.1985. | |||
