Тест-система для определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма "О N2212/Приморский/2014" генотипа O/SEA/Mya-98 в сыворотках крови животных на основе жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА Российский патент 2024 года по МПК C12N7/00 G01N33/53 C12Q1/68 A61K39/135 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности созданию тест-системы для определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма О №2212/Приморский/2014 генотипа O/SEA/Mya-98 в сыворотках крови животных на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Ящур - высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, которое характеризуется высокой заболеваемостью, что влечет за собой ограничения на международную торговлю скотом и его продукцией. Основными клиническими признаками заболевания являются лихорадка, хромота, афты во рту, ступнях и сосках. Молодые животные имеют более высокую смертность из-за миокардита по сравнению со взрослыми особями. Вспышки ящура часто возникают в странах Ближнего Востока и Азии, Африки [1, 2].

Вирус ящура является представителем рода Aphthovirus семейства Picornaviridae и имеет 7 различных серотипов: О, А, Азия-1, С и SAT-1, SAT-2, SAT-3 [2]. Геном кодирует 4 структурных белка VP₁, VP₂, VP₃, VP₄. Петля G-H белка VP₁ была идентифицирована как основной антигенный сайт. РНК вируса ящура также несет в себе информацию о 8 неструктурных белках (L-протеаза, 2А, 2В, 2С, 3А, 3В, 3С-протеаза и ЗО-РНК-зависимая РНК-полимераза). Вирус ящура имеет очень высокую частоту мутаций из-за отсутствия механизма репарации вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы. Антигенные варианты вызваны различными аминокислотными мутациями, приводящими к трудностям в борьбе с ящуром [1, 2].

В РНК-содержащих вирусах вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время репликации вируса, а возникающие линии и сублинии обусловлены мутациями и рекомбинацией. Рекомбинация - еще один важный процесс, определяющий биологию и эволюцию вирусов. Она представляет собой обмен генетическим материалом между двумя несегментированными РНК-геномами. Было показано, что генетическая рекомбинация происходит между вирусами одного и того же серотипа [3, 4]. Внутритипическая рекомбинация происходит часто и, по-видимому, события рекомбинации при ящуре происходят легче в 3'-части генома, чем в участках, кодирующих структурные вирусные белки. Мутации в результате рекомбинации приводят к обмену генетическим материалом и образованию новых антигенных вариантов, которые могут избежать иммунного давления и привести к изменениям тропизма клеток и диапазона хозяев [2, 5, 6]. Одна или несколько аминокислотных замен на поверхности вирусных частиц могут привести к изменению распознавания и использования рецепторов. В результате один и тот же вирус будет приобретать способность проникать в клетки с использованием альтернативных рецепторов [6].

Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием вирусных факторов и клеток-хозяев [6, 7]. Изменения в генах, кодирующих капсидные белки, путем мутации могут привести к антигенным изменениям и появлению новых генетических линий [6].

Наиболее вариабельным является белок VP₁ вируса ящура, поскольку на него приходится не менее 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [7]. Участок поверхностного белка VP₁ в регионе 130-160 а.о. отличается высокой вариабельностью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина [8, 9, 10]. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому [9].

В последние годы в мире циркулирует вирус ящура генотипа O/SEA/Mya-98. В мае 2014 года на территории деревни Прохоры Спасского района Приморского края Российской Федерации от свиньи был отобран патологический материал, который доставили в ФГБУ «ВНИИЗЖ» и провели комплексное исследование, в ходе которого был получен изолят «О №2212/Приморский/2014». Проанализировали первичную структуру 1D-гена нуклеиновой кислоты данного вируса с помощью двух систем праймеров О-1C244F/EUR-2B52R и О-1C272BF/EUR-2B52R. Выделен фрагмент кДНК полученного изолята размером 639 п. н. По результатам секвенирования определено, что полученный изолят на 99,49% схож с представителями генотипа O/SEA/Mya-98.

В ФГБУ «ВНИИЗЖ» данный изолят был адаптирован к различным чувствительным клеточным линиям, в том числе, к монослойной и суспензионной перевиваемой клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17 и получен штамм «О №2212/Приморский/2014» (генотип O/SEA/Mya-98). Данный штамм был депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» (справка №43/15-6 о депонировании штамма «О №2212/Приморский/2014» серотипа О вируса ящура для целей патентной процедуры от 24.12.2021). Филогенетическая принадлежность выделенного изолята и полученного на его основе штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 представлена на фиг. 3.

Иммунизация является эффективным инструментом борьбы с болезнью. В связи с появлением представителя нового генотипа вируса ящура на территории РФ и необходимостью защиты животных от него, в ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработали вакцину, в состав которой входит антиген вируса ящура данного штамма.

Возникла необходимость создания высокоспецифичных и высокочувствительных диагностических тест-систем, которые позволили бы выявлять антитела против структурных белков вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98.

Защита от ящура после вакцинации определяется уровнем специфических антител против структурных белков возбудителя данного заболевания в сыворотке крови животных [11, 12, 13, 14]. Уровень гуморального иммунитета вакцинированного поголовья определяется путем выявления антител, специфичных к капсиду или структурным белкам вируса ящура. В соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE) [2] для определения иммунного статуса животных применяют реакцию нейтрализации и иммуноферментный анализ (ИФА). Реакция нейтрализации считается чувствительным и специфичным методом, однако проведение анализа имеет ряд следующих ограничений: 1) большая продолжительность времени постановки реакции (не менее 3 суток), 2) высокая стоимость процедуры, связанная с применением чувствительной клеточной линии, наличием СО₂-инкубатора, 3) предполагает использование живого вируса ящура, который является биологическим агентом II группы опасности.

В свою очередь ИФА обладают многими преимуществами, включая экспрессность, высокую специфичность и чувствительность, пригодность для крупномасштабного скрининга полевых образцов и отсутствие требований к специальным лабораторным условиям, например, культуре клеток или среде углекислого газа [15, 16]. Исходя из этого для определения титра антител у вакцинированных животных целесообразно применять ИФА.

Выделяют прямой и непрямой варианты ИФА. Преимущества прямого варианта ИФА заключаются в быстроте анализа, поскольку используется только один вариант иммуноглобулинов G и устраняется перекрестная реактивность вторичных антител. При этом имеются и некоторые недостатки, а именно, снижение иммунной активности первичных антител вследствие отрицательного влияния ферментов или меток, отсутствие гибкости в выборе первичной метки антител в зависимости от задачи исследования, а также минимальное усиление сигнала.

Существует непрямой вариант ИФА, который имеет заметные преимущества по сравнению с прямым. К достоинствам этого варианта метода относится следующее: 1) наличие большого разнообразия меченых вторичных антител, 2) универсальность (многие первичные антитела могут быть получены у одного вида, и одно и то же меченое вторичное антитело может быть использовано для обнаружения), 3) максимальная иммунная активность основного антитела сохраняется, поскольку оно не маркировано, 4) повышение чувствительности, поскольку каждое первичное антитело содержит несколько эпитопов, которые могут быть связаны меченым вторичным антителом, что позволяет усиливать детектируемый сигнал. К ограничениям метода относится вероятность появления перекрестной активности со вторичным антителом, что может привести к появлению неспецифического сигнала, а также наличие дополнительного этапа реакции [4, 15, 17].

Большое значение в лабораторной деятельности имеет «сэндвич»-вариант ИФА, который обычно требует использования пар подобранных антител, где каждое антитело специфично для другого, неперекрывающегося эпитопа антигена. Первые антитела принято называть сенсибилизирующими и предназначены они для захвата антигена. Вторые антитела - детекторные, необходимы для обнаружения антигена. Указанный вариант ИФА имеет следующие преимущества:

- высокая специфичность анализа;

- подходит для исследования полевых образцов разной степени очистки;

- высокая чувствительность реакции.

ИФА также разделяют на твердофазные и жидкофазные варианты. В настоящее время твердофазный вариант широко распространен по причине удобства применения и быстроте проведения анализа. На первом этапе реакции для твердофазного варианта адсорбируют антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Не связавшиеся компоненты удаляют отмыванием. При добавлении конъюгата и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.

Жидкофазный блокирующий непрямой вариант ИФА имеет ряд следующих преимуществ: 1) анализ максимально из всех модификаций данного анализа приближен к классической реакции нейтрализации, поскольку частицы антигена не прикреплены к субстрату; 2) эпитопы антигена наиболее доступны в пространстве для специфичных антител, и это позволяет получать наиболее приближенные результаты к реакции нейтрализации в клеточной линии; 3) обладает высокими показателями аналитической и диагностической чувствительности, специфичности и общей точности.

Sharma G.K. и др. (2015) предложили способ определения антител против вируса ящура типов А, О, Азия-1 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА [18]. Данная методика позволяла идентифицировать широкий спектр противоящурных антител, но при этом специфичность по отношению к вирусу ящура генотипа O/SEA/Mya-98 не более 47%, а следовательно, точное выявление иммуноглобулинов G не представляется возможным. Следует заметить, что данный способ предполагал применение в качестве блокирующего компонента не иммунную сыворотку лошади, которая содержит различные белковые соединения, в том числе, возможно, гомологичные участки аминокислотных последовательностей относительно антигенных детерминант. Авторы тест-системы применяли моноклональные антитела, использование которых увеличивает спектр выявления различных генетических линий вируса ящура в рамках одного серотипа, но при этом существенно снижается специфичность относительно выявления антител против изолятов/штаммов конкретного генотипа, в частности O/SEA/Mya-98. В качестве красителя использовали тетраметилбензидин (ТМВ), являющийся агрессивным канцерогеном и нестабильным компонентом для проведения цветной реакции. Для остановки реакции применяли серную кислоту, являющуюся опасным соединением.

Указанные выше тест-системы не представлены на рынке в качестве набора для детекции противоящурных антител в сыворотках крови животных и остаются недоступны для широкого потребителя диагностикумов. В свою очередь, на мировом рынке в настоящее время имеются европейские наборы для детекции антител против вируса ящура типа О - IZSLER (Италия) и PrioCHECK (Нидерланды).

Тест-система в наборе IZSLER предназначена для детекции противоящурных антител с помощью твердофазного прямого «сэндвич»-варианта ИФА [19]. Комплектующие набора IZSLER (Instituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia Romagna Brescia, Italy The Pirbright Institute) следующие:

1. Герметичные микропланшеты, сенсибилизированные инактивированным вирусом ящура типа О.

2. Конъюгат (моноклональные антитела против вируса ящура типа О, конъюгированные с пероксидазой).

3. Положительный контроль сыворотки против вируса ящура типа О.

4. Отрицательный контроль.

5. Буферный раствор для ИФА - фосфатно-солевой буфер с твином-20 (ФСБ-Tween-20).

6. Буфер для разведения сыворотки крови и конъюгата.

7. Субстрат (раствор хромогена ТМВ).

8. Раствор для остановки реакции (0,6N раствор серной кислоты).

Достоинством данного набора является применение моноклональных антител, однако они были получены ранее 2014 года (период, когда появился штамм «О/Приморский/2014», с 2014 года он стал использоваться в качестве производственного штамма) и не могут с высокой достоверностью и точностью детектировать специфические антитела в сыворотках крови животных. Специфичность и чувствительность указанной тест-системы для выявления антител против вируса ящура генотипа O/SEA/Mya-98 ниже 55%, что подтверждают данные реакции нейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Иными словами, применяемая тест-система не позволяет получать точных результатов именно в отношении изолятов и штаммов вируса ящура вновь появившегося генотипа.

Наиболее близким прототипом для разработанной нами тест-системы является тест-система PrioCHECK [20] (Prionics Lelystad B.V., Netherlands) для выявления антител к вирусу ящура типа О.

Комплектующие для соответствующего набора представлены ниже:

Компонент 1 - Планшеты иммунологические.

Компонент 2 - Конъюгат (30х). Разбавленный конъюгат не стабилен, готовят непосредственно перед применением.

Компонент 3 - Буфер для разведения (5х).

Компонент 4 - Неиммунная сыворотка крови лошади.

Компонент 5 - Деминерализованная вода.

Компонент 6 - Промывочный буфер (200х).

Компонент 7 - Референтная сыворотка 1 (позитивная) (жидкая).

Компонент 8 - Референтная сыворотка 2 (менее позитивная) (жидкая).

Компонент 9 - Референтная сыворотка 3 (еще менее позитивная) (жидкая).

Компонент 10 - Референтная сыворотка 4 (отрицательный контроль) (жидкая).

Компонент 11 - Субстрат хромогена (ТМВ).

Компонент 12 - Стоп-раствор (1 N раствор серной кислоты). Данные отражены в инструкции производителя.

Диагностикум удобен в применении и позволяет за 5-6 ч получить результаты исследования. Данная тест-система включает в себя конъюгат, который представляет собой меченые моноклональные антитела против вируса ящура серотипа О, исходя из этого является типоспецифичной, но без более узкой дифференциации. Разработана прототипная тест-система в конце 90-гг. XX в. и получены соответствующие антитела против антигенов вируса ящура различных генотипов, созданных с использованием изолятов, кроме активно циркулирующего с 2014 г. генотипа O/SEA/Mya-98. Изоляты и штаммы данной линии имеют существенные отличия от других линий серотипа О. Анализируя нуклеотидную и аминокислотную последовательность высоко вариабельного пептида вируса ящура VP₁, ученые пришли к выводу о наличии достаточного количества существенных замен, позволяющих отнести вирус к иному генотипу. Исходя из выше отраженного, прототипная тест-система не является высокочувствительной и специфичной по отношению к вирусу ящура генотипа O/SEA/Mya-98. Данная тест-система выявляет антитела к данному штамму не более, чем на 50%. Исходя из этого требуется разработать высокочувствительную, специфичную тест-систему для детекции и количественного анализа антител против вируса ящура представленного генотипа.

Кроме того, прототипная тест-система основана на твердофазном конкурентном «сэндвич»-варианте ИФА, однако эта форма хоть и является одним из вариантов серологических реакций, но при этом находится дальше от реакции нейтрализации относительно возможностей улавливания антигенных сайтов по сравнению с жидкофазным блокирующим непрямым «сэндвич»-вариантом ИФА.

Прототипный вариант предполагает наличие в своем составе нативных контрольных сывороток крови животных, что снижает сохранность компонентов тест-системы в течение длительного периода времени и есть риск контаминации микроорганизмами.

Прототипный вариант имеет также некоторое ограничение в применении, а именно, рабочий раствор конъюгата не стабилен и быстро разрушается. В составе набора он представлен в виде 30-кратного концентрата. В таком состоянии в отличие от лиофилизированного компонента срок хранения заметно сокращается. Следует также отметить, что данная тест-система не предусматривает контроля конъюгата, что не позволяет получать более достоверные данные по оптическим плотностям и титру антител против вируса ящура.

В прототипной тест-системе применяется прямой конъюгат, что удобно в применении, однако при этом повышается вероятность шумовых фоновых явлений, что может негативно отражаться на конечных результатах количественного исследования сывороток крови животных.

В прототипной тест-системе для проявления цветной реакции используют краситель ТМВ, который обладает канцерогенными свойствами.

Учитывая найденные ограничения в применении имеющихся тест-систем, в том числе прототипной, для проведения точного анализа гуморального иммунитета животных после инокуляции противоящурными вакцинами, содержащими инактивированный вирус ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98, актуальной является разработка серологической тест-системы жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для выявления антител в сыворотках крови животных с учетом выше приведенных недостатков.

На сегодняшний день в РФ запатентована «Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации» [21]. При этом в настоящее время ветеринарная служба Российской Федерации не располагает современной отечественной тест-системой ИФА, которая позволила бы с высокой достоверностью определять титр антител против структурных белков вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98, используемого в вакцинных препаратах.

Целью изобретения является создание тест-системы для определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 в сыворотках крови животных на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система содержит следующие иммуноспецифические компоненты:

1) культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98;

2) сенсибилизирующие антитела - лиофилизированные иммуноглобулины G кролика против структурных белков вируса ящура «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98;

3) детекторные антитела - лиофилизированные иммуноглобулины G морской свинки против структурных белков вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98;

4) контроль 1 - лиофилизированная положительная сыворотка крови телят к антигену вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 с процентом ингибиции >70%;

5) контроль 2 - лиофилизированная положительная сыворотка крови телят к антигену вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 с процентом ингибиции от 50% до 70%;

6) контроль 3 - лиофилизированная сыворотка крови телят, не содержащая антитела к вирусу ящура - отрицательный контроль;

7) лиофилизированная фетальная сыворотка крови крупного рогатого скота нормальная для блокирования открытых сайтов связывания на дне лунок планшета;

8) антивидовой конъюгат - лиофилизированные иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена.

Предлагаемая тест-система содержит также неспецифические компоненты: карбонатно-бикарбонатный буфер (рН 9,5-9,7) для разведения антигена, 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат - катион-радикал ABTS+, «стоп»-раствор - 0,5%-ный раствор натриевой соли лаурилсерной кислоты.

Цель достигается благодаря тому, что метод жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА наиболее приближен к классической реакции нейтрализации в естественных условиях, поскольку все антигенные сайты полных вирионов вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 находятся в свободном состоянии в жидкой фазе, открыты для связывания со специфическими сенсибилизирующими и детекторными антителами кролика и морской свинки, соответственно. Реакция основана на взаимодействии исследуемой сыворотки крови животного и инактивированного вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 в жидкой фазе в лунках круглодонного планшета с образованием иммунных комплексов. Параллельно с этим проводится сенсибилизация лунок плоскодонного планшета иммуноглобулинами G кролика против вируса ящура того же генотипа. После этого сенсибилизированные лунки блокируют с помощью фетальной сыворотки крови КРС, добавляют полученные иммунные комплексы из круглодонного планшета, инкубируют, вносят восстановленную суспензию детекторных антител. Образовавшийся сложный иммунный комплекс выявляют с помощью антител против Ig G морской свинки, конъюгированных с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата.

Технический результат от изобретения заключается в разработке современной, высокоспецифической и чувствительной тест-системы, предназначенной для определения титра антител против вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 методом жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА, вследствие применения инактивированного вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 и при получении специфических компонентов реакции в жидкой фазе.

В состав разработанной тест-системы ИФА входят следующие иммуноспецифические компоненты:

1. культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 - 1 флакон (0,5 см³);

2. сенсибилизирующие лиофилизированные антитела - иммуноглобулины G кролика против вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 - 1 флакон (0,5 см³);

3. детекторные лиофилизированные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 - 1 флакон (0,5 см³);

4. контроль 1 - положительная лиофилизированная сыворотка крови крупного рогатого скота к вирусу ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98, с процентом ингибиции>70% - 1 флакон (0,2 см³);

5. контроль 2 - положительная лиофилизированная сыворотка крови крупного рогатого скота к вирусу ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98, с процентом ингибиции от 50% до 70% - 1 флакон (0,2 см³);

6. контроль 3 - нормальная лиофилизированная сыворотка крови крупного рогатого скота, не содержащая антител к вирусу ящура - 1 флакон (0,2 см³);

7. фетальная лиофилизированная сыворотка крови телят нормальная для блокирования открытых сайтов связывания на дне лунок планшета - 2 флакона (по 4,0 см³);

8. антивидовой лиофилизированный конъюгат - иммуноглобулины кролика против IgG морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена - 1 флакон (0,5 см³);

Предлагаемая тест-система содержит неспецифические компоненты:

9. карбонатно-бикарбонатный буфер (рН 9,5-9,7) для разведения антигена;

10. 20-кратный концентрат буферного раствора;

11. хромогенный субстрат - катион-радикал ABTS+;

12. «стоп»-раствор - 0,5%-ный раствор натриевой соли лаурилсерной кислоты.

В состав тест-системы также входят 4 иммунологических 96-луночных плоскодонных полистироловых планшета для проведения ИФА и 1 полимерный 96-луночный круглодонный планшет для связывания антигена и антител в жидкой фазе.

В отличие от прототипа в разработанной тест-системе применяется культуральный инактивированный вирус ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98, который представлен в виде лиофилизированной суспензии. Данный факт дает возможность выявлять именно антитела против структурных белков вируса ящура указанного штамма с высокими показателями чувствительности (более 99,5%) и специфичности (100%), что более чем на 50% выше по сравнению с наиболее близким прототипом. Кроме того, лиофилизированный компонент остается стабильным не менее 3 лет по сравнению с антигеном в нативном состоянии, что является преимуществом в использовании данной тест-системы. Активность полученного антигена вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 составляет 1:3500.

В отличие от прототипа применяются сенсибилизирующие и детекторные антитела кролика и морской свинки, соответственно, высокоспецифичные по отношению к структурных белков вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98, поскольку были получены с применением высокоочищенного антигена с высокой активностью. Указанные в тест-системе ИФА иммуноглобулины G кролика и морской свинки против вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 представлены в виде лиофильного компонента, что позволяет антителам находится в стабильном состоянии не менее 3 лет с активностью не менее 1:9000 и 1:4500, соответственно.

В отличие от прототипа сыворотки крови КРС, контроль 1 и 2, получены против высокоочищенного инактивированного вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98, что позволяет достичь высокой специфичности и чувствительности при контроле работы тест-системы. Указанные компоненты представлены в виде лиофилизата, что позволяет хранить их не менее 3 лет с сохранением высокой активности в ИФА. Для контроля 1 активность составляет не менее 1:5000, для контроля 2 - не менее 1:4000. Данная активность высокая и удобна для получения большого количества контролей в рабочем нативном состоянии.

В отличие от прототипа для блокирования открытых сайтов связывания применяется очищенная фетальная сыворотка телят, белковые составляющие которой обеспечивают полное закрытие пустых участков на дне иммунологического планшета. Данный компонент также представлен в лиофильном виде, что позволяет хранить его в данном состоянии не менее 3 лет.

В отличие от прототипного варианта представленная тест-система предусматривает контроль антигена и конъюгата, что дает возможность учитывать фоновые значения и, тем самым, получать достоверные абсолютные данные по оптическим плотностям и значению титра антител против вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98.

В отличие от прототипа в предложенной тест-системе применяется непрямой конъюгат, что позволяет снижать вероятность шумовых фоновых явлений и получать более достоверные результаты определения титра антител против вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 в сыворотках крови животных. Активность конъюгата составляет 1:2000.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях: Фиг. 1 - Спектральный профиль фракций антигена вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98.

Фиг. 2 - Электрофореграмма для антигена вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 в 12% полиакриламидном геле. Примечание: целевой белок с молекулярным весом 25 кDа.

Фиг. 3 - Филогенетическая принадлежность штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов ID-гена штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот белка VPi штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура.

Разработанная тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА основана на специфическом блокировании антигена вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 антителами, содержащимися в исследуемой пробе сыворотки в жидкой фазе. Смесь «исследуемая сыворотка/антиген» переносится в лунки планшета, предварительно иммобилизованного сенсибилизирующими антителами кролика против штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98. Наличие антител к вирусу ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 в исследуемой пробе будет выражаться в формировании иммунного комплекса и уменьшении количества свободного антигена, который связывается сенсибилизирующими антителами. Фиксированный в лунках антиген взаимодействует с детекторными антителами морской свинки, которые выявляются в реакции с иммунопероксидазным конъюгатом против IgG морской свинки и последующим окрашиванием с помощью катион-радикала ABTS+. Интенсивность окрашивания обратно пропорциональна концентрации специфических антител в исследуемой пробе. Интенсивность цветной реакции учитывают с помощью спектрофотометра-ридера.

Перед началом работы компоненты инкубируют 30 минут при температуре от 18 до 23°С. Проводят подготовку лиофилизированных компонентов тест-системы. Перед началом работы лиофилизированные препараты (антиген вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98, конъюгат, положительные и отрицательный контроли, фетальную сыворотку крови телят) восстанавливают до необходимого объема дистиллированной водой.

Проводят приготовление рабочих растворов.

Раствор №1 (карбонатно-бикарбонатный буфер - КББ). Готовят по стандартной методике 100 мл КББ раствора (рН 9,5-9,7) для сенсибилизации планшетов.

Раствор №2 (промывочный раствор). Раствор используется для приготовления рабочего раствора для межэтапной промывки планшетов и подготовки проб для исследования, а так же как основа для приготовления рабочего буферного раствора для разведения детекторных антител и иммунопероксидазного конъюгата. Готовят 2 л стандартного буферного раствора TBS с добавлением 0,05% Tween-20 (рН 7,4-7,6).

Раствор №3 (буфер для восстановления антител и конъюгата). Рабочий буферный раствор для разведения детекторных антител и иммунопероксидазного конъюгата (рН 7,4-7,6) готовится из раствора №2 с добавлением 10% фетальной сыворотки телят. Для этого к 36 см³ раствора №2 следует добавить 4,0 см³ фетальной сыворотки телят, восстановленной из лиофилизированного препарата путем добавления к содержимому флакона с сывороткой 4,0 см³ дистиллированной воды. Готовится непосредственно перед использованием.

Этапы проведения жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 представлены ниже.

1. Сенсибилизация планшетов. Восстановленную суспензию сенсибилизирующих антител готовят в разведении 1:9000 в растворе №1 (карбонатно-бикарбонатный буферный раствор). Во все лунки иммунологического полистиролового 96-луночного планшета для ИФА вносят по 100 мкл суспензии сенсибилизирующих антител, накрывают крышкой и инкубируют в течение 18 часов при температуре (2-8)°С.

2. Промывание лунок планшета осуществляют с использованием Washer любой марки, либо вручную раствором №2. Процедуру повторяют два раза.

3. Серологическая реакция в жидкой фазе. Параллельно с сенсибилизацией планшета проводят иммунную реакцию связывания антигена с испытуемыми и контрольными пробами сыворотки крови. Готовят следующие разведения сывороток крови животных: 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0: 9,5; 10,0; 10,5; 11,0 log₂ SN₅₀ (1:16-1:2048) в растворе №2. Для этого во все лунки полимерного планшета за исключением лунок H1-6, которые оставляют для контроля антигена (КА) и контроля конъюгата (КК), вносят по 0,047 см³ (47 мкл) буферного раствора и 0,003 см³ (3 мкл) пробы. В лунки HI-6 вносят по 0,05 см³ (50 мкл) буферного раствора. Испытуемые и контрольные пробы располагают на планшете согласно таблице 1.

В качестве контроля 1 используют положительную сыворотку крови свиней против вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 - процент ингибиции 75-100%, контроля 2 - положительную сыворотку крови свиней против вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 - процент ингибиции 50-70%, контроля 3 - нормальную сыворотку свиней - процент ингибиции меньше 50%.

Во все лунки планшета добавляют по 0,05 см³ рабочего разведения антигена в растворе №2 в соответствии с разведением 1:3500. После перемешивания содержимого лунок планшета при помощи шейкера или легким встряхиванием вручную планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 18-20 часов при температуре (2-8)°С.

4. Улавливание антигена. В промытые лунки сенсибилизированного планшета вносят по 0,05 см³ смеси контрольных и испытуемых проб и антигена, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 60±5 мин при температуре (37±0,5)°С.

5. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п.2). Процедуру повторяют 4 раза.

6. Внесение детекторных антител. Во все лунки планшета, за исключением лунок с КК (контроль конъюгата), куда добавляют по 0,05 см3 раствора №3, вносят по 0,05 см³ рабочего разведения детекторных антител (1:4500) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±5 мин при температуре (37±1)°С.

7. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 4 раза.

8. Внесение конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ рабочего разведения конъюгата (1:2000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±5 мин при температуре (37±0,5)°С.

9. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 4 раза.

10. Проявление цветной реакции. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ катион-радикала ABTS+, закрывают крышкой и выдерживают 15-20 минут при температуре (18-23)°С.

11. Остановка реакции. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета 0,05 см³ 0,5% раствора натриевой соли лаурилсерной кислоты.

12. Учет результатов ИФА. Результаты анализа учитывают инструментальным способом. Сразу после остановки реакции измеряют оптическую плотность (D) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 415 нм, используя спектрофотометр-ридер для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения D контрольных и исследуемых проб переводят в значение процента ингибиции (PI, %) по формуле:

PI(%)=(1-(D_{сыворотки}-D_КК)/(D_КА- D_КК))×100,

где D_{сыворотки} - среднее значение оптической плотности смеси сыворотки с инактивированным вирусом ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98;

D_КА - среднее значение оптической плотности контроля антигена;

D_КК - среднее значение оптической плотности контроля конъюгата.

Результаты реакции достоверны в том случае, если данные удовлетворяют следующим критериям:

- разница между значениями D_КА и D_КК не менее 0,4 оптических единиц (о.е.);

- контроль 1 имеет значение PI>70%;

- контроль 2 имеет значение PI в пределах 50-70%;

- контроль 3 имеет значение PI<50%.

Пробы, демонстрирующие значение PI≥50%, считают положительными. Значение PI<50% в сыворотке крови обследуемых животных является отрицательным, что свидетельствует об отсутствии специфических антител к ящуру, вызванного вирусом штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98. Исходя из полученных данных берут последнее разведение сыворотки, для которого процент ингибиции составляет>50%. Это разведение считают титром антител против ящура, вызванного вирусом штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98.

В результате проведенных экспериментов были оптимизированы условия постановки реакции. Активность детекторных антител, определенная в непрямом варианте ИФА, составила 1:4500, антивидового конъюгата - 1:2000; сенсибилизирующих антител - 1:9000, антигена вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 - 1:3500, контроля 1 -1:5000, контроля 2 - 1:4000, контроля 3 - 1:2000. С использованием разработанной тест-системы проведено исследование образцов сывороток крови животных с определением титра антител и проведен сравнительный анализ с результатами реакции нейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи (IB-RS-2) [2].

Разработанный вариант ИФА позволяет тестировать одновременно в формате 96-луночного планшета 6 проб сывороток в следующих разведениях, выраженных в двоичном логарифме: 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0: 9,5; 10,0; 10,5; 11,0 log₂ (1:23-1:2048). Срок годности предлагаемой тест-системы составляет не менее 24 месяцев со дня изготовления при температуре хранения 4-8°С.

В качестве рабочего антигена применяли инактивированный вирус ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98.

Контроль штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура на специфичность. Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура, был выделен в мае 2014 года на территории деревни Прохоры Спасского района Приморского края РФ от свиньи. Специфичность определена с помощью ОТ-ПЦР с последующим секвенированием ID-гена, соответствующего белку VP₁, отвечающему за изменчивость вируса ящура. По результатам исследования нуклеотидной последовательности указанного гена была выявлена принадлежность штамма «О №2212/Приморский/2014» к генотипу O/SEA/Mya-98. Расчет проводился в соответствии с Байесовской теорией вероятности. Специфичность подтверждена также в реакции связывания комплемента со штаммоспецифической сывороткой. Концентрация общего вирусного белка в исследуемом антигене вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 составила 2,87 мкг/мл, концентрация 146S компонента - 2,01 мкг/мл, 75S компонента - 0,77 мкг/мл, 12S - 0,09 мкг/мл.

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура для контроля антигенной и иммуногенной активности, а также для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О.

Морфологические признаки

Штамм «О №2212/Приморский/2014» вируса ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, серотипу О, генотипу O/SEA/Mya-98 и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 24-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. При репродукции вируса ящура образуется основной иммуногенный компонент - полные частицы, или 146S компонент, состоящий из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP₂, VP₄, VP₃, VP₁.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции нейтрализации.

При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:4500.

Антигенное родство штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура с имеющимися производственными штаммами вируса ящура серотипа О исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 антигенно отличается от производственных штаммов «01/Манисса/1993», «О №1715/Тайвань/3/97», «О №2147/Приморский/2012», «О №2047/Саудовская Аравия/2008», «О №2311/Забайкальский/2016».

Антигенное соответствие (r₁) составило для «01/Маниса/1993» - 0,19; «О №1715/Тайвань/3/97» - 0,21; «О №2147/Приморский/2012» - 0,22; «О №2047/Саудовская Аравия/2008» - 0,23; «О №2311/Забайкальекий/2016» - 0,18. При значении r₁≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического полевого вируса, при значении r₁<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического полевого вируса.

Биотехнологические характеристики.

Штамм «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 репродуцируется в перевиваемых монослойных клеточных линиях почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи IB-RS-2, почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21, и в течение 12-18 часов инкубирования вируса в указанных культурах клеток накапливается от 6,25 до 7,75 lg ТЦД₅₀/см³.

Генотаксономическая характеристика.

Штамм «О №2212/Приморский/2014» вируса ящура серотипа О является РНК-содержащим вирусом.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой с молекулярной массой 2,8×10⁶ Да. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех структурных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства.

Для данного вируса при константе седиментации полных вирусных частиц 146 S, константе диффузии 1,41 см²/с молекулярная масса составляет 8,08×10⁶ Д. Размер вириона 24-25 нм, масса составляет 8,4×10^-18 г.

Устойчивость к внешним факторам.

Штамм «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,45-7,82. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, у-облучению, высоким температурам. Дополнительные признаки и свойства.

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Антигенная активность - введение инактивированного вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 морским свинкам, кроликам, свиньям, овцам, КРС индуцирует образование вирусоспецифических антител.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при культивировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).

Сущность изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Получение инактивированного вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98.

Для получения инактивированного вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 для диагностических целей проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21 в течение 10-12 ч с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 7,0 lg ТЦД₅₀/см³. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли с применением полигексаметиленгуанидина.

Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и 4°С. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Д (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 7,5% и хлорида натрия (сухой) до конечной концентрации 0,85%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 2±0,5°С в течение 18-24 часов. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ), концентрируя в 300 раз (1/300 от первоначального объема).

К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98. Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле.

На следующем этапе проводили получение 146S компонента вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 (данный компонент является иммуногенным и наиболее важным в иммунизации животных, поскольку представляет собой полные вирионы).

Перед помещением в градиент сахарозы антиген вируса ящура обрабатывали NP-40 в концентрации 2,0%.

Для выделения 146S компонента готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50%. Обработанный с помощью NP-40 антиген вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 наливали по 15 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания центрифугировали при скорости 25000 об/мин и температуре 2±1°С в течение 3,5 часов. Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1 мл в отдельные пробирки. Начало и конец пика 146S компонента определяли по спектральному профилю, объединяя фракции, входящие в этот диапазон.

При использовании перистальтического насоса сначала визуально оценивали пробирку с градиентом сахарозы. Опалесцирующий слой, содержащий 146S компонент, располагается приблизительно в 30%-м слое сахарозы. В этом случае отбирали последнюю верхнюю фракцию 50%-го слоя (1,0 мл), все фракции 30%-го слоя (5,0 мл) и нижнюю фракцию 20%-го слоя сахарозы (1,0 мл). Общий объем составляет приблизительно 7,0 мл. Затем 146S компонент переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 25000 об/мин. и температуре 2±0,5°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций антигена вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 в виде антигенного профиля представлены на фиг.1. Анализ проводили для 21 фракций, высокие значения оптической плотности наблюдали для 6-12 фракций с максимальными значениями для восьмой фракции. Проведен электрофорез данной фракции в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, в которых находится 146S компонент вируса ящура данного штамма (фиг. 2). На фиг. 2 отражено, что для фракции №8, которая соответствует 30%>-ному раствору сахарозы, определено наличие 146S компонента (на треке обнаружена четкая полоска вирусного структурного белка).

Пример 2. Получение гипериммунной сыворотки крови кроликов (сенсибилизирующие антитела) против штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98.

Для получения специфических сывороток крови против вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 применяли клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяли концентрированный очищенный инактивированный вирус ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98, полученный как описано в примере 1, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-71R VG (в соотношении адъювант/антиген=70/30 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 21 и 42 дни в объеме 0,5 см³. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови - содержащую сенсибилизирующие антитела, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре 4-8°С.

Пример 3. Получение гипериммунной сыворотки крови морских свинок (детекторные антитела) против вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98.

Для гипериммунизации морских свинок использовали эмульсию очищенного препарата концентрированного инактивированного вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98, полученного как описано в примере 1. Приготовление вакцины и схема иммунизации такая, как в примере 2.

Пример 4. Определение активности антигена вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98, сенсибилизирующих и детекторных антител.

Индивидуальные пробы сывороток проверяли на активность и специфичность в жидкофазном блокирующем непрямом «сэндвич»-варианте варианте ИФА. Был проведен подбор оптимальных рабочих разведений указанных компонентов для получения достоверных результатов в ИФА. Полученные данные анализа представлены в таблицах 2, 3, 4.

Для анализа исследовали следующие разведения сенсибилизирующих антител: 1:7000, 1:8000, 1:9000, 1:10000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:3500, для детекторных антител - 1:4500, конъюгата - 1:2000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 1:256. Их таблицы 2 следует, что при разведении сенсибилизирующих антител 1:9000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8 log₂ SN₅₀). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.

Для анализа исследовали следующие разведения детекторных антител: 1:3000, 1:4000, 1:4500, 1:5000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:3500, для сенсибилизирующих антител - 1:9000, конъюгата - 1:2000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 1:256. Их таблицы 3 следует, что при разведении детекторных антител 1:4500 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8 log₂ SN₅₀). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.

Для анализа исследовали следующие разведения антигена: 1:2000, 1:3000, 1:3500, 1:4000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для детекторных антител - 1:4500, для сенсибилизирующих антител - 1:9000, конъюгата - 1:2000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 1:256. Их таблицы 4 следует, что при разведении антигена 1:3500 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8 log₂ SN₅₀). При меньших разведениях наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных.

При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.

Таким образом, в ходе лабораторных исследований доказано, что рабочие разведения антигена вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98, сенсибилизирующих и детекторных антител составили 1:3500, 1:9000, 1:4500, соответственно.

Пример 5. Применение тест-системы для определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 в сыворотках крови животных на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Исследовали 12 сывороток крови животных, полученных после иммунизации инактивированными эмульсионными вакцинами против ящура, содержащими антиген вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98. Определили значения титра специфических антител с применением разработанной тест-системы ИФА, а также данные сыворотки были исследованы в реакции микронейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии IB-RS-2, рекомендованной OIE [2]. Полученные результаты отражены в таблице 5, из которой следует, что степень корреляции результатов разработанной тест-системы ИФА (предлагаемое изобретение) и классического метода (РМН - реакция микронейтрализации) высокая.

Пример 6. Определение диагностических показателей разработанной тест-системы для определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 в сыворотках крови животных на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Для исследования представленной тест-системы (предлагаемое изобретение) для определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 в сыворотках крови животных на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения чувствительности предложенной тест-системы анализировали 498 сывороток крови животных, которые являлись заведомо положительными по данным реакции микронейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Титр антител для данных сывороток крови находился в диапазоне 1:32-1:2048 (пробы имеют защитный титр антител по данным OIE - не менее 1:32). Постановку ИФА проводили, как отражено выше. Разработанной тест-системой (предлагаемое изобретение) определили, что из 498 образцов сывороток крови 496 определены в качестве положительных, а 2 - в качестве отрицательных (определен титр - 1:24). Для исследования специфичности метода тестировали 232 отрицательных сывороток крови животных. В результате исследования с помощью ИФА (предлагаемое изобретение) определили, что из 232 отрицательных проб - 232 определены в качестве отрицательных. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,56-99,95%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,42-100,00%, k-критерий - 0,994; прогностичность положительного результата (PPV) - 100,00%, прогностичность отрицательного результата (NPV) - 96,68-99,78%, общая точность (DAc) - 99,02-99,97 (таблица 6).

Таким образом предлагаемая «Тест-система для определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 в сыворотках крови животных на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА» является специфичной и чувствительной, позволяющей проводить анализ сывороток крови животных с количественным определением значения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98, который входит в состав вакцинных препаратов против ящура.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система для определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 в сыворотках крови животных на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА»:

1. Груздев, К.Н. Программа совместных действий по профилактике и борьбе с ящуром животных в странах СНГ / К.Н. Груздев, В.М. Захаров, A.M. Рахманов // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. -Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 3-13.

2. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. -Paris, 2018. - Chapter2.1.8.

3. Гуленкин, В.М. Экономическая эффективность проведения профилактической вакцинации животных против ящура на территории Российской Федерации / В.М. Гуленкин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2012. - Т. 10. - С. 31-41.

4. Anon Global Strategy for control of foot-and-mouth disease. - In, Bangkok, Thailand, - 2012. - P. 27-29.

5. Динамика развития противоящурного гуморального иммунитета у крупного рогатого скота, иммунизированного трехвалентной сорбированной вакциной типов А, О, Азия-1 / Д.В. Михалишин, Т.Н. Лезова // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 75-82.

6. Wong C.L., Yong C.Y., Ong Н.К., Но K.L., Tan W.S. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease // Front Vet Sci. - 2020 Aug 21. - V.7. - P. 477.

7. Curry S., Abu-Ghazaleh R., Blakemore W., Fry E., Jackson Т., King A., Lea S., Logan D., Newman J., Stuart D. Crystallization and preliminary X-ray analysis of three serotypes of foot-and-mouth disease virus // J. Mol Biol. - 1992. - V. 228(4). - P. 1263-1268.

8. Fry E.E., Stuart D.I., Rowlands D.J. The structure of foot-and-mouth disease virus // Curr Top Microbiol Immunol - 2005. - V. 288. - P. 71-101.

9. Palmenberg A.C. Proteolytic processing of picornaviral polyprotein // Annu Rev Microbiol. - 1990. - V. 44. - P. 603-623.

10. Curry S., Fry E., Blakemore W., Abu-Ghazaleh R., Jackson Т., King A., Lea S., Newman J., Stuart D. Dissecting the roles of VP₀ cleavage and RNA packaging in picornavirus capsid stabilization: the structure of empty capsids of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. - 1997. - V. 71(12). - P. 9743-9752.

11. Curry S.R. Zunszain P.A., Leatherbarrow R.J. Foot-and-mouth disease virus 3C protease: recent structural and functional insights into an antiviral target // Int J Biochem Cell Biol. - 2007. - V. 39(1). - P.l-6.

12. Oem J.K., Park J.H., Lee K.N., Kim Y.J., Kye S.J., Park J.Y., Song H.J. Characterization of recombinant foot-and-mouth disease virus pentamer-like structures expressed by baculovirus and their use as diagnostic antigens in a blocking ELISA // Vaccine. - 2007. - V. 25(20). - P. 4112-112.

13. Lewis S.A., Morgan D.O., Grubman M.J. Expression, processing, and assembly of foot-and-mouth disease virus capsid structures in heterologous systems: induction of a neutralizing antibody response in guinea pigs // J. Virol. - 1991. - V. 65(12).-P. 6572-6580.

14. Cao Y., Lu Z., Sun J., Bai X., Sun P., Bao H., Chen Y., Guo J., Li D., Liu X., Liu Z. Synthesis of empty capsid-like particles of Asia I foot-and-mouth disease virus in insect cells and their immunogenicity in guinea pigs // Vet. Microbiol. - 2009. - V. 137(1-2). - P. 10-17.

15. Hamblin C, Barnett I.Т., Hedger R.S. A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA // J. Immunol. Methods. - 1986. - V. 93(1). - P. 115-121.

16. Grubman M.J., Moraes M.P., Diaz-San Segundo F., Pena L., de los Santos T. Evading the host immune response: how foot-and-mouth disease virus has become an effective pathogen // FEMS Immunol Med Microbiol. - 2008. - V. 53(1). - P. 8-17.

17. Ma L.N., Zhang J., Chen H.T., Zhou J.H., Ding Y.Z., Liu Y.S. An overview on ELISA techniques for FMD // Virol J. - 2011 Sep 4. - V. 8. - P. 419.

18. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India / Sharma G.K., Mahajan S., Matura R., Subramaniam S., Ranjan R., Biswal J., Rout M., Mohapatra J.K., Dash B.B., Sanyal A., Pattnaik B. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India // World J Virology. - 2015. - V. 4(3). - P. 295-302.

19. IZSLER ELISA. URL: https://www.fao.org/fileadmin/user_upload/eufmd/docs/Open_Session2012/Appendices/75_New_Elisa_for_diagnosis_Brocchi_.pdf (Дата обращения: 20.02.2023).

20. PrioCHECK ELISA. URL: http://vetprofilab.ru/f/priocheck_ fmdv_antibody_elisa_kit_cut.pdf (Дата обращения: 27.01.2023).

21. Патент РФ №2787714, 11.01.2023. Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации // Заявка №2022108324 / Луговская Н.Н., Доронин М.И., Михалишин Д.В., Гочмурадов Ы.М., Оковытая Т.В., Борисов А.В.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMDV ELISA O SEA

Mya-98 xml.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-02-21">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-02-21</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>486</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-02-21</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Тест-система для определения титра

антител против структурных белков вируса ящура штамма «О

№2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 в сыворотках крови

животных на основе жидкофазного блокирующего непрямого

«сэндвич»-варианта ИФА</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value> FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacttcgacgggcgagtcagccgaccccgtgaccgctactgttgaga

actacggtggcgagacacaggtccagaggcgtcaccacacagacgtctcatttatattggacagatttgt

gaaagtcacaccacaagaccaaattaatgttttggacctgatgcagacccccccccacactctggtggga

gcgctccttcgtactgccacttactactttgctgatctagaggtggcagtgaaacacgagggggatctca

cctgggtaccaaatggagcacctgaggcagccttgggtaataccaccaacccaacggcgtaccacaaagc

gccactcactcggcttgcattgccttacacggcaccacaccgtgttctggctaccgtttatttcgggaac

tgcaaatacgctgggggtccactgaccaacgtgagaggcgatctccaggtgctggctcagaaggcggcga

ggccgctgcctacctccttcaactatggtgccatcaaagccacccgggtggcagaactgctgtaccgcat

gaagagggccgagacgtattgcccgcggcctcttttggccgtccacccggatcaagctagacacaagcag

aaaattgtggcaaaagtgaaacagtcctgg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSTGESADPVTATVENYGGETQVQRRHHTDVSFILDRFVKVTPQDQIN

VLDLMQTPPHTLVGALLRTATYYFADLEVAVKHEGDLTWVPNGAPEAALGNTTNPTAYHKAPLTRLALPY

TAPHRVLATVYFGNCKYAGGPLTNVRGDLQVLAQKAARPLPTSFNYGAIKATRVAELLYRMKRAETYCPR

PLLAVHPDQARHKQKIVAKVKQSW</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана тест-система жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 в сыворотках крови животных на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА. Тест-система включает в себя специфические компоненты: культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98; сенсибилизирующие антитела - лиофилизированные иммуноглобулины G кролика против вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98; детекторные антитела-лиофилизированные иммуноглобулины G морской свинки против вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98. Изобретение расширяет арсенал средств для определения титра антител против вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 методом жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 6 пр.

1. Тест-система для определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 в сыворотках крови животных на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА, содержащая:

- специфические компоненты: культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98; сенсибилизирующие антитела - лиофилизированные иммуноглобулины G кролика против вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98; детекторные антитела-лиофилизированные иммуноглобулины G морской свинки против вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98; контроль 1 - лиофилизированную положительную сыворотку крови телят к антигену вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98, с процентом ингибиции ≥75%; контроль 2 - лиофилизированную положительную сыворотку крови телят к антигену вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98, с процентом ингибиции от 50% до 70%; контроль 3 - лиофилизированную сыворотку крови телят, не содержащую антитела к вирусу ящура - отрицательный контроль; лиофилизированную фетальную сыворотку крови телят, нормальную для блокирования открытых сайтов связывания; антивидовой конъюгат - лиофилизированные иммуноглобулины кролика против IgG морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена;

- неспецифические компоненты: карбонатно-бикарбонатный буфер рН 9,5-9,7 для разведения антигена; 20-кратный концентрат буферного раствора; хромогенный субстрат - катион-радикал ABTS+; «стоп»-раствор - 0,5%-ный раствор натриевой соли лаурилсерной кислоты,

отличающаяся тем, что в качестве антигена вируса ящура содержит культуральный инактивированный вирус ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 и для определения процента ингибиции используется модифицированная формула: PI(%)=(1-(D_{сыворотки}-D_КК)/(D_КА-D_КК))×100, при этом за титр антител принимается наибольшее разведение исследуемой сыворотки крови, для которой значение процента ингибиции составляет ≥50%.

2. Тест-система по п. 1, являющаяся специфичной и чувствительной, позволяющей проводить анализ сывороток крови животных с оценкой уровня антител против структурных белков вируса ящура штамма «О №2212/Приморский/2014» генотипа O/SEA/Mya-98 и определять их титр в диапазоне 4,5-11,0 log₂ SN₅₀ (1:23-1:2048).