СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ D-АПИОЗЫ ИЗ ПОЛИСАХАРИДА РЯСКИ МАЛОЙ LEMNA MINOR Российский патент 2002 года по МПК C12P19/02 A61K35/78 

Изобретение относится к химии, биохимии и иммунохимии, а именно к способу получения D-апиозы - моносахарида с разветвленной углеводной цепью из полисахарида, выделенного из ряски малой Lemna minor.

Известна D-апиоза, выделенная из петрушки Apium petroselinum кипячением предварительно выделенного гликозида апиина с 0,3%-ной серной кислотой, который распадается на D-апиозу и апигенин-D-глюкозид; последний, в свою очередь, при обработке соляной кислотой дает D-глюкозу и апигенин [E. Vongerichten, Fr. Muller, Ann. 318, 127 (1901); 321,74 (1902). E. Vongerichten, Fr. Muller, B. 39, 235 (1906)]. Способ описан не достаточно подробно, что затрудняет его повторение. Кроме того, в его описании ничего не говорится о количествах выделенной апиозы. Можно предположить, что она этим способом была выделена в аналитических количествах для установления ее структуры.

Других способов выделения апиозы из растительного сырья нами не выявлено, хотя на данный момент известно, что D-апиоза в минорных количествах входит в состав многих пектиновых веществ, выделенных из возобновленного растительного сырья [Ю.С. Оводов // Биоорганическая химия, 1998, т. 24, 7, с. 483-501].

Задачей настоящего изобретения является разработка способа выделения D-апиозы из широко распространенного пресноводного растения ряски малой Lemna minor в препаративных количествах с высокой степенью очистки при небольших затратах.

Это изобретение позволяет выделить D-апиозу в индивидуальном состоянии с удельным вращением [α]20D

+5.4^° (с. 1.0; Н₂О) в виде сиропа, что соответствует характеристикам апиозы, описанным ранее [Толленс-Эльснер. Справочник по углеводам. - Л.: Красный печатник, 1937].

Поскольку в полисахариде ряски малой Lemna minor содержание D-апиозы составляет около 25% общего моносахаридного состава полисахарида [Оводова Р.Г. , Головченко В.В., Шашков А.С., Попов С.В., Оводов Ю.С. // Биоорган. химия, 2000, т. 26, 10], то этот способ позволяет получать D-апиозу в препаративных количествах (выход 10-25% от массы полисахарида).

Выделенная таким способом апиоза является ценным биохимическим препаратом при изучении химического строения, биохимического поведения различных физиологически активных соединений, определении детерминантных групп иммуномодуляторов и при идентификации D-апиозы в составе олиго- и полисахаридов, а также гликозидов и других углеводсодержащих соединений.

Существенные признаки изобретения.

Способ получения D-апиозы, включающий обработку полисахарида ряски малой Lemna minor, способ получения которого описан в патенте RU 2149642, раствором трифторуксусной кислоты концентрацией 0,01-0,02 моль/л при 70-100^oС в течение 1-4 ч, соотношении массы исходного полисахарида и объема растворителя 1-3:100-400 соответственно, осаждение полисахарида из раствора 96%-ным этиловым спиртом при соотношении раствор: спирт 1:3-4, удаление выпавшего осадка центрифугированием и выделение целевого продукта путем концентрирования, сушки супернатанта упариванием с метанолом в вакууме при 40^oС.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1. 1-3 г полисахарида ряски малой Lemna minor заливают 100-400 мл 0,01-0,02М трифторуксусной кислотой, нагревают в термостате при 70-100^oС в течение 1-4 ч. Полисахарид осаждают из раствора 96%-ным этиловым спиртом в соотношении раствор: спирт 1:3-4, выпавший осадок отделяют центрифугированием. Полученный супернатант, содержащий D-апиозу, концентрируют и сушат упариванием с метанолом в вакууме при 40^oС. В результате этой процедуры получают D-апиозу в виде сиропа с выходом 18-25% от массы взятого полисахарида ряски малой Lemna minor в виде сиропа.

Определение соответствия выделенного продукта апиозе осуществляли следующими методами.

1. Методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). ГЖХ проводили на хроматографе Hewlett-Packard 4890А с пламенно-ионизационным детектором, капиллярной колонкой RTX-1 (0,25 мм ⊘ • 30 м), газ-носитель - Аr, сброс 1:60. Идентификация образцов D-апиозы проводилась в виде соответствующих ацетатов полиолов [York W.S., Darvill A. G., McNeil M.A., Stevenson T.T, Albersheim P. //Meth. Enzymol. l985. V. 118. P. 3-40], температурный режим - 175^oС --> 250^oС, Δ 3^o/мин.

2. Методом бумажной хроматографии (БЖХ). Бумажную хроматографию проводили нисходящим методом на бумаге Filtrak FN-12 и FN-13 в системе н-бутанол-пиридин-вода (6: 4: 3) с индикацией пятна моносахарида апиозы с помощью кислого анилинфталата при 105^oС.

3. Определением удельного вращения. Величину удельного вращения образца измеряли на приборе Polartronic MHZ (Германия) в кювете на 1 мл при температуре 20^oС в водном растворе концентрацией 1,0 мг/ 100 мл.

По данным этих методов выявлено соответствие полученного продукта D-апиозе с удельным вращением [α]20D

+5.4^° (с. 1.0; Н₂О).

Экспериментальные данные, полученные по описанному способу, приведены в таблице.

Пример 2. 2 г полисахарида ряски малой Lemna minor заливают 160 мл 0,05M трифторуксусной кислотой. Нагревают в термостате при 100^oС в течение 3 ч. Полисахарид осаждают 96%-ным этиловым спиртом в соотношении раствор:спирт 1: 3, выпавший осадок отделяют центрифугированием. Полученный супернатант, содержащий апиозу, концентрируют и сушат упариванием с метанолом в вакууме при 40^oС. По данным описанных выше методов (ГЖХ, БХ) выделенный образец представляет собой смесь апиозы и арабинозы в соотношении 8-10:1.

Из этого примера видно, что повышение концентрации растворителя ведет к получению смеси моносахаридов апиозы и арабинозы.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет выделить апиозу из полисахарида ряски малой Lemna minor в индивидуальном состоянии с удельным вращением [α]20D

+5.4^° (с. 1.0; H₂О) в виде сиропа в препаративных количествах с высокой степенью очистки при небольших затратах.

Изобретение относится к химии, биохимии и иммунохимии. Способ включает обработку полисахарида ряски малой Lemna minor раствором трифторуксусной кислоты концентрацией 0,01-0,02 моль/л при 70-100^oС в течение 1-4 ч, осаждение полисахарида из раствора 96%-ным этиловым спиртом, удаление выпавшего осадка центрифугированием. Целевой продукт выделяют путем концентрирования, сушки супернатанта упариванием с метанолом в вакууме при 40^oС. Обработку полисахарида раствором трифторуксусной кислоты проводят при соотношении массы исходного полисахарида и объема растворителя 1-3:100-400. Осаждение полисахарида из раствора этиловым спиртом осуществляют при соотношении раствор: спирт 1: 3-4 соответственно. Способ позволяет выделять D-апиозу в индивидуальном состоянии с удельным вращением [α]20D

+5,4^° (с. 1.0; Н₂О) в сиропообразном виде. Выделенная таким способом апиоза является ценным биохимическим препаратом при изучении химического строения, биохимического поведения различных физиологически активных соединений, определения детерминантных групп иммуномодуляторов. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения D-апиозы путем обработки природных соединений, полученных из растительного сырья кислотой при нагревании, отличающийся тем, что в качестве сырья используют полисахарид ряски малой Lemna minor, обработку проводят раствором трифторуксусной кислоты концентрацией 0,01-0,02 моль/л при 70-100^oС в течение 1-4 ч, после чего полисахарид из раствора осаждают 96%-ным этиловым спиртом, удаляют выпавший осадок центрифугированием, а целевой продукт выделяют путем концентрирования и сушки супернатанта упариванием с метанолом в вакууме при 40^oС. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сырье обрабатывают раствором трифторуксусной кислоты при соотношении сырье: раствор 1-3:100-400. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что осаждение полисахарида из раствора проводят этиловым спиртом при соотношении раствор: спирт 1:3-4.