СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБЕНТА ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИИ БЕЛКОВ Российский патент 2003 года по МПК B01J20/04 B01J20/30 C07K1/16 

Изобретение относится к области хроматографии белков, может быть использовано в биотехнологии для очистки и фракционирования ферментов и касается способа получения адсорбента - гидроксиапатита.

Известен способ получения гидроксиапатита (прототип), включающий стадию получения брушита (СаНР0₄) путем медленного сливания 0,5 М растворов СаСl₂ и Nа₂НРO₄ (по 2 л), фильтрование брушита, его 4-кратную промывку тремя литрами воды, обработку суспензии брушита в 3 л воды 100 мл 40%-ного NaOH при кипячении в течение 1 часа (нагрев 45 мин) при постоянном медленном перемешивании, отделение гидроксиапатита от очень мутного супернатанта фильтрованием, 4-кратную промывку гидроксиапатита тремя литрами воды, 2-кратную обработку 0,01 М фосфатным буфером (рН 6,8) при нагревании до 100^oС и 2-кратную обработку 0,001 М фосфатным буфером (рН 6,8) при кипячении в течение 15 мин (Справочник биохимика: Пер. с англ. /Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. - М.: Мир, 1991. - С. 463).

Недостатками данного способа является сложность процесса и низкий выход крупнозернистых фракций (50-500 мкм) гидроксиапатита, пригодных для препаративной хроматографии белков.

Задачей настоящего изобретения является сокращение числа стадий процесса и увеличение выхода крупнозернистых фракций гидроксиапатита. Технический результат достигается путем использования для получения брушита нерастворимых солей кальция, например карбоната или фосфата кальция, которые обрабатываются избытком дигидрофосфата натрия (калия) или ортофосфорной кислотой при рН 1,0-4,0 и температуре 100^oС.

Способ осуществляется следующим образом. При использовании карбоната кальция брушит получается по реакции 1:

Выделяющийся углекислый газ вызывает самопроизвольное перемешивание суспензии, что снижает вероятность истирания частиц в результате принудительного перемешивания. Изменение значений рН при обработке СаСО₃ позволяет влиять на фракционный состав гидроксиапатита. Необходимое значение рН среды поддерживается добавлением соляной, азотной или ортофосфорной кислот.

При использовании фосфата кальция брушит получается по реакциям 2 и 3 при рН 1,0-2,0, который устанавливается добавлением соляной, азотной или ортофосфорной кислот:
Ca₃(PO₄)₂+NaH₂PO₄+HCl-->3CaHPO₄+NaCl; (2)
Ca₃(PO₄)₂+H₃PO₄-->3CaHPO₄. (3)
Образование брушита происходит на поверхности твердых частиц карбоната и фосфата кальция, что способствует получению более крупных фракций брушита. В дальнейшем брушит отфильтровывают, промывают на фильтре 2 литрами воды и обрабатывают при кипячении гидроксидом натрия (калия). В целях получения сферических частиц гидроксиапатита стадии получения брушита и гидроксиапатита проводят во вращающейся со скоростью 10-50 оборотов в минуту круглодонной колбе, расположенной в бане под углом 0-60 градусов.

Пример 1. К 100 г СаСО₃ приливают 1 л 2 М раствора NaH₂PO₄ с рН около 4,0 и помещают суспензию в кипящую водяную баню. Для поддержания рН 4,0 в суспензию периодически добавляют 75%-ную ортофосфорную, соляную или азотную кислоту. После прекращения выделения пузырьков СО₂ суспензию нейтрализуют до рН 6,8-7,2 добавлением 50%-ного NaOH и дают остыть до комнатной температуры. Брушит отфильтровывают, промывают на фильтре 2 л воды и суспендируют в 500 мл воды, после чего добавляют 100 мл 50%-ного NaOH и помещают в кипящую водяную баню, периодически перемешивая суспензию. По истечении 2-х часов гидроксиапатит отфильтровывают и промывают на фильтре водой до нейтральной реакции фильтрата.

Пример 2. Аналогично примеру 1, добавляя кислоту до рН 3,0.

Пример 3. Аналогично примеру 1, добавляя кислоту до рН 2,0.

Пример 4. Аналогично примеру 1, добавляя кислоту до рН 1,0.

Пример 5. К 100 г Са₃(PO₄)₂ приливают 350 мл 2 М раствора NaH₂PO₄, устанавливают рН 1,0-2,0 суспензии добавлением 75%-ной ортофосфорной, соляной или азотной кислоты и помещают суспензию в кипящую водяную баню. Процесс ведут при периодическом перемешивании суспензии до достижения ею рН в пределах 3,5-4,0. Брушит отфильтровывают, промывают на фильтре водой до слабокислой реакции фильтрата и обрабатывают его щелочью аналогично примеру 1.

Пример 6. К 100 г Са₃(РO₄)₂ приливают 350 мл 1 М раствора Н₃РO₄, помещают суспензию в кипящую водяную баню и выдерживают ее при периодическом перемешивании, пока не установится рН среды в пределах 2,5-3,5. Суспензию нейтрализуют до рН 6,8-7,2 добавлением 50%-ного NaOH и дают медленно остыть до комнатной температуры. Брушит отфильтровывают, промывают на фильтре 2 л воды и обрабатывают щелочью аналогично примеру 1.

Пример 7. Стадии получения брушита и гидроксиапатита проводят аналогично примерам 1-6 во вращающейся со скоростью 10-50 оборотов в минуту круглодонной колбе, расположенной в бане под углом 0-60 градусов.

Фракционный состав гидроксиапатита по примерам 1-7 приведен в таблице.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет сократить число стадий процесса получения гидроксиапатита и увеличить выход крупнозернистых фракций целевого продукта по сравнению со способом-прототипом.

Изобретение относится к области хроматографии белков, может быть использовано в биотехнологии для очистки и фракционирования ферментов. Способ получения адсорбента-гидроксиапатита предусматривает использование для получения брушита нерастворимых солей кальция, например карбоната или ортофосфата, которые обрабатываются избытком дигидрофосфата натрия (калия) или ортофосфорной кислотой при рН 1,0-4,0 и температуре 100^oС. Также способ предусматривает получение сферических частиц гидроксиапатита при проведении стадий получения брушита и гидроксиапатита во вращающейся со скоростью 10-50 об/мин круглодонной колбе. Способ позволяет сократить число стадий процесса и увеличить выход крупнозернистых фракций гидроксиапатита. 4 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения адсорбента для хроматографии белков, предусматривающий получение брушита и его обработку щелочью при 100^oС для образования гидроксиапатита, отличающийся тем, что брушит получают из нерастворимой соли кальция путем обработки ее избытком дигидрофосфата натрия (калия) при температуре 100^oС в среде с рН 1,0-4,0, регулируя его добавками ортофосфорной, соляной или азотной кислот, с последующей нейтрализацией суспензий раствором щелочи до рН 6,8-7,2. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве нерастворимой соли кальция используют карбонат кальция. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве нерастворимой соли кальция используют ортофосфат кальция. 4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что обработку ортофосфата кальция ведут 1 М ортофосфорной кислотой при 100^oС и рН 1,0-2,0. 5. Способ по пп. 1-4, отличающийся тем, что стадии получения брушита и гидроксиапатита проводят во вращающейся со скоростью 10-50 об. мин круглодонной колбе, расположенной в бане под углом 0-60^o.