ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ LEMNA MINOR L. Российский патент 2001 года по МПК C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии выращивания пересадочных культур растительных тканей, и может быть использовано в медицинской промышленности.

Питательные среды для получения каллусной ткани Lemma minor L. из патентных и литературных источников нами не выявлены. Наиболее близкой к заявленному изобретению является питательная среда для получения каллусной ткани бегонии краснолистной (RU патент 1654841, МКИ C 12 N 5/04) следующего состава: макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу; витамины: пиридоксинт 0,1 мг/л; тиамин 0,1 мг/л; никотиновая кислота 0,5 мг/л; инозитол 40 мг/л; сахароза 3%; 6-БАП 1 мг/л; 2,4-Д 1 мг/л. Данный состав питательной среды не позволяет получить каллусную ткань Lemma minor L.

Задачей настоящего изобретения является определение состава питательной среды для получения каллусной ткани водного растения Lemna minor L. (класс Monocotyledones).

В этом состоит новый технический результат.

Технический результат достигается тем, что стерильные экспланты листецы Lemna minor L. помещаются на агаризованную модифицированную питательную среду, которая в отличие от прототипа содержит дополнительно витамины: фолиевую кислоту, рибофлавин, биотин, Ca-пантотенат, кобаламин при следующем количественном соотношении компонентов, мг/л:
KNO₃ - 1900
NH₄NO₃ - 1650
CaCl₂ - 332
MgSO₄ • 7H₂O - 370
KH₂PO₄ - 170
FeSO₄ • 7H₂O - 27,85
Na₂ ЭДТА - 37,25
H₃BO₃ - 6,2
MnSO₄ • 5H₂O - 24,1
ZnSO₄ • 7H₂O - 8,6
Na₂MoO₄ - 0,25
KI - 0,83
CuSO₄ • 5H₂O - 0,025
CoCl₂ • 6H₂O - 0,025
Фолиевая кислота - 0,5
Рибофлавин - 0,5
Биотин - 1,0
Ca-пантотенат - 1,0
Пиридоксин - 1,0
Тиамин хлорид - 1,0
Никотинамид - 2,0
Кобаламин - 0,0015
6-БАП - 1,0 - 1,5
2,4-Д - 0,5-2,0
Сахароза - 30000
Агар-агар - 8000
Вода - До 1 л
Пример 1. Для подтверждения получения каллусной ткани Lemna minor готовят питательную среду, используя химически чистые реактивы (хч, чда). Предварительно готовят концентрат макросолей, при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей, Fe-хелата, витаминов. Макро- и микросоли, Fe-хелат, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 6-БАП, 2,4-Д, сахарозу и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 250 мл насыпают по 2 г агар-агара, разливают среду по 250 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 10 мин при 1 атм. Чашки Петри стерилизуют в сухожаровом шкафу при 180^oC, завернутые в бумагу Крафт. В стерильном боксе в чашки Петри разливают по 30 мл питательной среды.

Стерилизацию эксплантов проводят путем обработки 70%-ным этанолом (10-15 с), затем 5%-ным раствором гипохлорита натрия в течение 5 мин с последующим 3-кратным промыванием в стерильной дистиллированной воде. Индукцию каллуса проводят на модифицированной питательной среде следующего состава: макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу; витамины: фолиевая кислота 0,5 мг/л, рибофлавин 0,5 мг/л, биотин 1,0 мг/л, Ca-пантотенат 1,0 мг/л, пиридоксин 1,0 мг/л, тиамин хлорид 1,0 мг/л, никотинамид 2,0 мг/л, кобаламин 0,0015 мг/л; 6-БАП 1,0 мг/л; 2,4-Д 0,5 мг/л; сахароза 30000 мг/л; агар-агар 8000 мг/л.

Чашки Петри содержат в термостате при 26±1^oC в условиях непрерывной темноты. Спустя 4-5 недель на эксплантах происходит каллусообразование. Образовавшийся каллус желтого цвета, плотный. Первичный каллус, достигший размера 0,5 см, отделяют от экспланта и пассируют на агаризованную питательную среду для дальнейшего культивирования.

Примеры 2-5. Получение каллусной ткани проводят аналогично примеру 1, различиями являются модификации питательных сред, включающие различные концентрации 2,4-Д и 6-БАП. Результаты испытания 5 модификаций питательных сред на основе среды Мурасиге и Скуга представлены в таблице.

Таким образом, применение предлагаемого состава питательной среды позволяет получить каллусную ткань из водного растения Lemna minor L. (класс Monocotyledones).

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии выращивания пересадочных культур растительных тканей, и может быть использовано в медицинской промышленности. Стерильные экспланты листецы Lemna minor L. помещают на агаризованную модифицированную питательную среду, содержащую смесь макро- и микросолей по Мурасиге и Скугу, смесь витаминов: фолиевую кислоту, рибофлавин, биотин, Ca-пантотенат, пиридоксин, тиамин хлорид, никотинамид, кобаламин; фитогормоны: 6-БАП и 2,4-Д; сахарозу; агар-агар с последующей инкубацией при 26±1^oС в условиях темноты. Оптимизированная питательная среда позволяет получить каллусную ткань из водного растения Lemna minor L. (класс Monocotyledones) с достаточной частотой каллусогенеза. 1 табл.

Питательная среда для получения каллусной ткани Lemna minor L., характеризующаяся тем, что она содержит компоненты в следующем количественном соотношении, мг/л:
КNО₃ - 1900
NН₄NО₃ - 1650
СаСl₂ - 332
МgSО₄•7Н₂О - 370
КН₂РО₄ - 170
FeSO₄•7Н₂О - 27,85
Nа₂ЭДТА - 37,25
Н₃ВО₃ - 6,2
MnSО₄•5Н₂О - 24,1
ZnSO₄•7Н₂О - 8,6
Nа₂МоО₄ - 0,25
КI - 0,83
CuSO₄•5Н₂О - 0,025
СоСl₂•6Н₂О - 0,025
Фолиевая кислота - 0,5
Рибофлавин - 0,5
Биотин - 1,0
Са-пантотенат - 1,0
Пиридоксин - 1,0
Тиамин хлорид - 1,0
Никотинамид - 2,0
Кобаламин - 0,0015
6-БАП - 1,0 - 1,5
2,4-Д - 0,5 - 2,0
Сахароза - 30000
Агар-агар - 8000
Вода - До 1 лк