СПОСОБ КОНТРОЛЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ДВС-СИНДРОМЕ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/86 

Изобретение относится к области медицины, в частности исследованию крови, и может быть использовано для лабораторного контроля эффективности и достаточности заместительного лечения синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдрома).

ДВС-синдром - широко распространен в клинической практике, осложняет течение многих критических и терминальных состояний и способствует высокой летальности больных. Контроль лабораторных показателей крови при лечении этого тяжелого состояния повышает эффективность применяемой терапии. Заместительная терапия является основой лечения ДВС. Целью заместительной терапии является пополнение крови больных коагуляционными факторами и антикоагулянтами, так как в крови больных с ДВС-синдромом вследствие повышенного расхода снижена концентрация физиологических антикоагулянтов, прежде всего протеинов С и S, а также факторов свертывания. Поэтому для контроля эффективности терапии ДВС-синдрома необходимо определение важнейших физиологических антикоагулянтов в динамике лечения этих больных.

Известен способ контроля эффективности лечения ДВС-синдрома путем определения концентрации антикоагулянта антитромбина III [Балуда В.П., Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д. и др. Лабораторные методы исследования системы гемостаза. - Томск, 1980. - С.199-202]. Однако известный способ трудоемок, выполняется в несколько этапов, требует дополнительного нестандартного (56^oС) прогрева исследуемой плазмы, имеет плохую воспроизводимость, имеет ряд других ограничений. Вследствие этих негативных особенностей известный способ не может быть использован в повседневной диагностической практике.

Наиболее близким по достигаемому положительному результату (прототип) является способ раздельного определения концентрации антикоагулянтов в крови больных с ДВС для оценки эффективности лечения этого синдрома [Ерин Е.Н. Роль снижения уровня протеинов С, S и антитромбина III при инфекционно-септическом ДВС-синдроме и коррекция их дефицита криосупернатантом. // Автореф. канд. мед. наук. Барнаул, 1999. - 21 с.]. Однако известный способ трудоемок и не оперативен, требует оснащения лаборатории специальным дорогостоящим импортным оборудованием и реактивами для проведения иммуноферментного анализа, поэтому он не может быть использован в повседневной диагностической практике.

Авторы предлагают простой и доступный способ контроля эффективности заместительной терапии при ДВС-синдроме, который основан на оценке антикоагулянтного ответа исследуемой плазмы после добавления активатора протеина С в тест-системе АПТВ (активированного парциального тромбопластинового времени).

Положительным результатом заявляемого способа является повышение эффективности лечения ДВС-синдрома за счет объективной оценки достаточности и результативности заместительной терапии.

Положительный результат достигается тем, что для контроля эффективности заместительной терапии при ДВС-синдроме вычисляют показатель отношения времени свертывания в АПТВ-тесте после добавления активатора протеина С к времени свертывания в АПТВ без активатора и при значении этого показателя после лечения меньше 2,1 лечение расценивают неэффективным, а при значении показателя равным 2,1 или больше лечение расценивают эффективным.

Известен способ скрининговой диагностики наследственных тромбофилий (резистентности фактора V к активированному протеину С, дефицита протеина S, дефицита протеина С), который основан на выявлении недостаточного удлинения времени свертывания в АПТВ-тесте после добавления в тестируемую смесь активатора протеина С (Protac) у больных с наследственными тромбофилиями [Kraus M., Noah M. and Flekencher К. The PCAT - a simple screening assay for assessing the functionality of the protein С anticoagulant pathway. //Thromb. Res. - 1995. - 79. - P. 217-222]. Однако известный способ не предназначался для контроля заместительного лечения ДВС-синдрома.

Способ осуществляют следующим образом.

Реактивы и оборудование:
1. 3,8% (0,1 M) раствор цитрата натрия. Получают растворением 3,8 г три-натрия-цитрата в 100 мл дистиллированной воды.

2. Референтная нормальная пулированная плазма (РНП-плазма) для стандартизации реагентов лиофильно высушена, производитель фирма "Технология-Стандарт".

3. Каолин (легкая фракция) фирмы "Технология-Стандарт" (Барнаул), концентрация 0,025 мг/мл, хранится при +2...8^oС, (реагент готов к употреблению) перед применением встряхивается до получения гомогенной суспензии.

4. Кефалин, производитель фирма "Технология-Стандарт", флакон содержит 30 мг лиофильно высушенного кефалина, полученного из тканевого тромбопластина человека.

5. Хлорид кальция 0,025 М раствор, производитель фирма "Технология-Стандарт".

6. Активатор протеина С (из яда Agkistrodon contortrix), лиофильно высушен, производитель "Biomereuox".

7. Центрифуга ОПН-8.

8. Стеклянные пробирки.

Приготовление реагентов и исследуемых образцов плазмы
Приготовление раствора кефалина. Во флакон с кефалином вносят 2,0 мл дистиллированной воды. Встряхиванием в течение 1-2 минут добиваются гомогенности эмульсии. В результате получают 1,5%-ную эмульсию, которую хранят при температуре +2...+8^oС и используют в течение месяца.

Приготовление АПТВ-реагента (каолин-кефалиновой смеси). Смешивают 0,1 мл эмульсии кефалина с 3 мл взвеси каолина (0,025 мг/мл).

Приготовление рабочего раствора активатора протеина С. Для приготовления рабочего раствора активатора разводят флакон с активатором протеина С в 2 мл дистиллированной воды.

Приготовление РНП-плазмы. Во флакон с РНП-плазмой вносят 1,0 мл дистиллированной воды и растворяют содержимое при комнатной температуре (+18... +25^oС) и легком покачивании в течение 3 мин.

Приготовление исследуемой плазмы. Кровь получают из локтевой вены силиконированной иглой в пластиковую пробирку, содержащую 3,8%-ный раствор цитрата натрия (соотношение крови и цитрата 9:1). Кровь центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин (200g). Полученную богатую тромбоцитами плазму повторно центрифугируют в течение 20 мин при 3500 об/мин (1200g). Полученную бедную тромбоцитами плазму (БТП) используют для проведения исследования.

Ход определения:
1) В первую стеклянную пробирку с 0,1 мл исследуемой БТП добавляют 0,1 мл АПТВ-реагента, 0,05 мл дистиллированной воды, инкубируют смесь на водяной бане 5 мин при температуре +37^oС, после чего к ней добавляют 0,1 мл раствора хлорида кальция. Регистрируют время свертывания (t₁) при непрерывном помешивании.

2) Во вторую стеклянную пробирку с 0,1 мл исследуемой БТП добавляют 0,1 мл АПТВ-реагента, 0,05 мл рабочего раствора активатора протеина С, инкубируют смесь на водяной бане 5 мин при температуре +37^oС, после чего к ней добавляют 0,1 мл раствора хлорида кальция. При непрерывном помешивании регистрируют время свертывания (t₂).

Аналогично определяют время свертывания в референтной нормальной плазме.

Оценка полученных результатов
Вычисляют отношение R для плазмы исследуемого больного по формуле:
R = t₂/t₁,
где R - показатель степени удлинения времени свертывания в тесте АПТВ после добавления активатора протеина С;
t₁ - время свертывания в АПТВ-тесте после добавления дистиллированной воды;
t₂ - время свертывания в АПТВ-тесте после добавления активатора протеина С.

При определении времени свертывания в референтной нормальной плазме отношение R находится в пределах 2,9-3,0. У здоровых доноров отношение R было всегда выше 2,1, а средние значения были равны 2,94±0,07 (n=35). Диапазон нормы 2,9±0,8 (X±2SD).

Диапазон нормальных значений 2,1-3,8.

Для оценки эффективности лечения ДВС необходимо определить отношение R данным методом дважды (до лечения и после лечения). У больных с острым ДВС-синдромом до лечения вследствие повышенного потребления антикоагулянтов (протеина С и/или протеина S) отношение R всегда ниже 2,1. После лечения ДВС-синдрома отношение R становится равным или выше 2,1, если лечение эффективно (так как при эффективном лечении восстанавливается нормальный уровень антикоагулянтов и прекращается их потребление), а при неэффективном лечении это отношение остается ниже 2,1, так как при низкой эффективности лечения концентрация антикоагулянтов не восстанавливается.

Воспроизводимость предлагаемого способа
Для оценки воспроизводимости способа использован коэффициент вариации (в %) при многократном исследовании одних и тех же образцов нормальной плазмы и плазмы больных с ДВС-синдромом. Заявляемый способ показал хорошую воспроизводимость. Коэффициент вариации не превышал 6%.

Апробация предлагаемого способа
Для апробации предлагаемого способа мы провели контроль эффективности лечения у 20 больных с острым ДВС-синдромом. Наблюдение проводилось за клиническими и лабораторными показателями больных до и после лечения, а для сравнения результатов определили показатель R у 35 здоровых доноров. Клинико-лабораторная характеристика групп больных с различной эффективностью лечения ДВС представлена в таблице 1. Как видно из таблицы 1, клинические и лабораторные показатели характеризуют больных до лечения (в обеих представленных группах) как тяжелых, требующих неотложной коррекции гемостаза (все больные из реанимационного отделения). Из таблицы 1 видно также, что у большинства больных имелись клинические и лабораторные признаки коагулопатии потребления, характерной для ДВС. Всем больным выполняли исследование системы гемостаза до и после стандартного лечения, которое включало применение гемопрепаратов в сочетании с прямыми антикоагулянтами и антиферментными препаратами. В таблице 2 представлена клинико-лабораторная характеристика групп больных после лечения. Как видно из таблицы 2, у 12 больных такое лечение было эффективно: в этой группе устранены клинические признаки ДВС, лабораторные показатели гемостаза после лечения были близки к нормативным. Из таблицы 2 видно, что после лечения у 8 больных положительного эффекта не получено: были выражены клинические признаки ДВС-синдрома, сохраняется коагулопатия потребления по данным исследования системы гемостаза. У этих больных была немедленно пересмотрено лечение, увеличены дозы применяемых препаратов, однако 4 больных из этой группы крайне тяжелых больных погибло.

Как было сказано выше, показатель R в контрольной группе здоровых людей был равен 2,94±0,07 (см. чертеж). При остром ДВС-синдроме показатель R был значительно снижен в обеих наблюдаемых группах (до 1,53±0,11, Р<0,001 в группе с эффективным лечением и до 1,46±0,12, Р<0,001 в группе с низкой эффективностью лечения) в сравнении с нормативными показателями. Снижение этого показателя обусловлено потреблением при ДВС-синдроме важнейших антикоагулянтов, а именно протеина С и/или протеина S. Как видно из гистограммы, после эффективного лечения гемопрепаратами у больных с ДВС показатель R становится достоверно выше 2,70±0,21 (Р<0,001) и не отличается от контрольных показателей, а при неэффективном лечении показатель R остается низким 1,65±0,19 (этот показатель статистически не отличается от аналогичного показателя до лечения, Р>0,5).

При эффективном лечении ДВС-синдрома показатель R повышается, так как происходит нормализация концентрации антикоагулянтов (протеина С и протеина S). При низкой эффективности применявшегося лечения регистрация низкого показателя R свидетельствует о сниженной концентрации этих антикоагулянтов, так как их концентрация в процессе лечения эффективно не пополняется. Последнее обстоятельство будет вынуждать лечащих врачей пересматривать применявшееся лечение ДВС (следует повысить дозировку и кратность применения гемопрепаратов и антикоагулянтов; пересмотреть инфузионную терапию, повысить дозировку антиферментных препаратов и др.).

Контролировать эффективность лечения больных с ДВС, используя предлагаемый способ, доступно большинству лабораторий в медицинских учреждениях, так как этот способ не требует специального импортного оборудования (выполняется мануально) и не требует применения дорогостоящих диагностических наборов.

Клинические примеры практического использования способа
Клинический пример 1.

Больная К. Л. 23 года поступила в отделение патологии беременности (10.09.1998) с диагнозом: Беременность 36 недель, тяжелый гестоз. Жалобы были на субъективные проявления высокого артериального давления, отеки на нижних конечностях, боли в животе после ходьбы, сильную слабость. При физикальном обследовании в приемном покое выявлены значительные отеки на нижних конечностях, увеличение веса тела на 16 кг в течение срока беременности. Дыхание везикулярное, хрипов нет, ЧД 18 в мин. Тоны сердца ритмичны, ЧСС 96 в мин. Выслушивается акцент II тона над аортой, артериальное давление 190/100. Размеры живота соответствуют сроку беременности. Дно матки достигает мечевидного отростка. ЧСС плода в пределах нормативных показателей.

Проведено лабораторное исследование:
Нb 114 г/л; РОЭ 43 мм/ч; лейкоциты 4,5•10⁹/л.

Лейкоцитарная формула: Б-1%, Э-2%, П-4%, С-56%, Л-31%, М-6%.

Биохимический анализ крови: креатинин 14 мкмоль/л; мочевина 11,0 ммоль/л; общий билирубин 14 мкмоль/л, прямой 3,5 мкмоль/л, непрямой 10,5 мкмоль/л; глюкоза 4,0 ммоль/л; общий белок 73,0 г/л, альбумины 58%, α₁ 3,7%, α₂ 9,9%, β 11,1%, γ 17,3%. RW - отр.

Общий анализ мочи: цвет с/ж, прозрачность полная, плотность 1011, глюкоза отр., белок 0,33г/л, лейкоциты - ед. в поле зрения, эритроциты - ед. в поле зрения.

Исследование системы гемостаза больной (12.09.1998) приведено в таблице 3.

После родов (23.09.1998) у женщины возникло массивное кровотечение (вследствие гипотонии матки). Oбщая потеря крови была около 1,0 литра. Появились клинические признаки тяжелого геморрагического шока, появились одышка, петехиальная сыпь.

Проведено лабораторное исследование показателей крови:
Нb 81 г/л; РОЭ 52 мм/ч; лейкоциты 9,5•10⁹/л.

Исследование системы гемостаза больной (23.09.1998) приведено в таблице 4.

Из представленного анализа гемостаза видно, что у больной вследствие массивной кровопотери развился острый ДВС-синдром с гипокоагуляцией, тромбоцитопенией, потреблением факторов свертывания и антикоагулянтов. Значительно снижен показатель R, что свидетельствует о потреблении протеина С и протеина S. Тактика ведения таких больных предусматривает применение заместительной терапии. Больная переведена в реанимационное отделение и назначено соответствующее ситуации лечение (свежезамороженная плазма, фраксипарин, полиглюкин, окситоцин, контрикал).

После проведения заместительной терапии вновь проведено лабораторное исследование крови:
Нb 91 г/л; РОЭ 45 мм/ч; лейкоциты 7,3•10⁹/л.

Исследование системы гемостаза больной (24.09.1998) приведено в таблице 5.

После лечения состояние больной значительно улучшилось. Устранены клинические проявления геморрагического шока, устранена дыхательная недостаточность, прекратилось маточное кровотечение. Как видно из представленного анализа гемостаза, лабораторных признаков ДВС нет.

Этот клинический пример демонстрирует применение показателя R для оценки эффективности заместительной терапии. Кроме того, показано, что при остром ДВС показатель R снижен, а это свидетельствует о целесообразности применения этого показателя в качестве лабораторного критерия при диагностике ДВС-синдрома. При этом следует отметить, что другой значимый критерий диагностики ДВС-синдрома - антитромбин III был в пределах нормативных показателей (хотя и значительно снизился в сравнении с исходными значениями) и поэтому показатель R является более надежным диагностическим критерием ДВС-синдрома, чем антитромбин III, так как показывает снижение двух антикоагулянтов (протеина С и/или протеина S). После заместительной терапии у больной показатель R был в пределах нормы, что свидетельствует об эффективности применявшегося лечения.

Клинический пример 2.

Больной К.М. 46 лет поступил в приемное отделение ГБ 12 1.03.1999 с жалобами на одышку в покое, высокую температуру, сильную головную боль и головокружение, кашель, боли в грудной клетке при дыхании. Болен в течение недели, заболевание началось с повышения температуры до 39,3^oС и появления других субъективных признаков интоксикационного синдрома. Квалифицированная медицинская помощь не оказывалась, самостоятельно применял нестероидные противовоспалительные препараты. При осмотре выявлен цианоз губ, в акте дыхания принимают участие вспомогательная мускулатура, дыхание значительно ослаблено с обеих сторон, выслушиваются справа крепитация, слева шум трения плевры, частота дыхания 32 в мин. Тоны сердца глухие, ритм правильный с ЧСС 110 в мин. АД 80/50. Живот мягкий, безболезненный. Печень не увеличена. Почки и селезенка не пальпируются. На обзорной R-грамме органов грудной клетки затемнение в нижних и средних легочных полях. На ЭКГ ритм синусовый, тахикардия с ЧСС 70-120 в мин. Положение ЭОС вертикальное. Проведены клинические анализы крови и мочи, биохимическое исследование крови, рентгенография органов грудной клетки, а также исследование системы гемостаза.

Нb 147 г/л; РОЭ 48 мм/ч; лейкоциты 12,3•10 ⁹/л.

Лейкоцитарная формула: Б-1%, Э-2%, П-9%, С-51%, Л-28%, М-9%.

Биохимический анализ крови: креатинин 10 мкмоль/л; общий билирубин 21 мкмоль/л, прямой 9 мкмоль/л, непрямой 12 мкмоль/л; глюкоза 4,9 ммоль/л; общий белок 65,0 г/л.

Общий анализ мочи: цвет с/ж, прозрачность полная, плотность 1014, глюкоза отр., белок отр., лейкоциты - ед. в поле зрения, эритроциты - ед. в поле зрения.

На обзорной R-грамме ОГК двусторонняя пневмония (справа субтотальная, слева нижнедолевая).

Исследование системы гемостаза больного до лечения (1.03.1999) приведено в таблице 6.

Сформулирован диагноз: Крупозная двусторонняя пневмония, тяжелое течение, дыхательная недостаточность III степени, инфекционно-токсический шок II степени, инфекционно-септический ДВС-синдром.

Больной переведен в реанимационное отделение и назначена заместительная терапия в сочетании с прямыми антикоагулянтами и антибиотиками. Через 4 суток после интенсивного лечения в реанимационном отделении (назначения свежезамороженной плазмы, гепарина, контрикала, антибиотиков, ИВЛ) состояние больного остается тяжелым. Сохраняются дыхательная недостаточность, высокая температура, нарушение гемодинамики. При R-графии ОГК обнаружена жидкость в плевральной полости до III ребра. Присоединилась полиорганная недостаточность, характерная для ДВС.

Нb 126 г/л; РОЭ 54 мм/ч; лейкоциты 10,1•10⁹/л; креатинин 19 мкмоль/л; общий билирубин 46 мкмоль/л, прямой 30 мкмоль/л, непрямой 16 мкмоль/л; глюкоза 4,6 ммоль/л; общий белок 54,0 г/л.

Исследование системы гемостаза больного после лечения (5.03.1999 приведено в таблице 7.

После исследования системы гемостаза было быстро пересмотрено лечение, увеличены дозы основного компонента заместительной терапии - свежезамороженной плазмы, была проведена лечебно-диагностическая плевральная пункция, изменены фармакологические группы и увеличена дозировка антибактериальных препаратов. В результате этого состояние больного улучшилось. Устранены нарушения гемодинамики, нет полиорганной недостаточности, нет одышки, но сохраняются субфебрильная температура и продуктивный кашель. При проведении R-графии выявлена хорошая положительная динамика. Ниже приведены лабораторные данные после повторного курса заместительной терапии.

Нb 136 г/л; РОЭ 34 мм/ч; лейкоциты 10,8•10⁹/л; креатинин 8 мкмоль/л; общий билирубин 18 мкмоль/л, прямой 9 мкмоль/л, непрямой 9 мкмоль/л; глюкоза 4,9 ммоль/л; общий белок 69,0 г/л.

Исследование системы гемостаза больного после лечения (9.03.1999) приведено в таблице 8.

Больной переведен из реанимационного отделения в терапевтическое для дальнейшего лечения.

Как видно из представленного клинического примера, показатель R показал себя как надежный лабораторный критерий для диагностики ДВС-синдрома. Следует отметить, что другой значимый критерий диагностики ДВС-синдрома - РФМК не был изменен в наиболее опасной для жизни больного фазе течения ДВС, а показатель R оказался более информативным и более надежным (для оценки тяжести состояния) лабораторным критерием ДВС-синдрома, чем другие показатели. При этом первый курс заместительной терапии оказался неэффективным, что и зарегистрировал показатель R, а повторный курс заместительной терапии с более высокими дозировками свежезамороженной плазмы оказался эффективным, что и зарегистрировал показатель R. После повторного курса заместительной терапии у больного показатель R в пределах нормы, что четко свидетельствует об эффективности применявшегося лечения.

Клинический пример 3.

Больной С. В. 34 года поступил в приемное отделение ГБ 3 с ожогами 3 степени. Общее состояние больного тяжелое, площадь ожогового поражения 60%, петехиальная сыпь на кожных покровах, дыхание жесткое, рассеянные сухие хрипы, частота дыхательных движений 38 в минуту. Тоны сердца глухие, ритм правильный, тахикардия с ЧСС 110 в мин, артериальное давление 70/30. Печень не увеличена, почки и селезенка не пальпируются. Больной переведен в отделение реанимации и интенсивной терапии. Проведены клинические анализы крови и мочи, биохимическое исследование крови, а также исследование системы гемостаза.

Нb 151 г/л; РОЭ 43 мм/ч; лейкоциты 14,9•10⁹/л.

Лейкоцитарная формула: Б-2%, Э-2%, П-10%, С-50%, Л-28%, М-8%.

Биохимический анализ крови: креатинин 14 мкмоль/л; общий билирубин 28 мкмоль/л, прямой 12,5 мкмоль/л, непрямой 15,5 мкмоль/л; глюкоза 4,9 ммоль/л; общий белок 61,0 г/л.

Общий анализ мочи: цвет с/ж, прозрачность полная, плотность 1011, глюкоза отр., белок 0,066 г/л, лейкоциты - ед. в поле зрения, эритроциты - ед. в поле зрения.

Исследование системы гемостаза больного до лечения (12.02.1998) приведено в таблице 9.

Как видно из таблицы 9, у больного до лечения показатели системы гемостаза свидетельствуют о тяжелом ДВС-синдроме: гипокоагуляция в коагуляционных тестах, гипофибриногенемия, значительно угнетен фибринолиз, тромбоцитопения, повышено содержание РФМК, снижена концентрация в крови антикоагулянтов. Из таблицы 9 видно также, что значительно снижен показатель R, что обусловлено сниженным уровнем протеина С и протеина S.

Через 5 суток после курса заместительной терапии в реанимационном отделении состояние больного значительно улучшилось.

Нb 145 г/л; РОЭ 24 мм/ч; лейкоциты 5,8•10⁹/л.

Исследование системы гемостаза больного после лечения (17.02.1998) приведено в таблице 10.

После лечения нет гемодинамических нарушений, нет дыхательной недостаточности. Как видно из таблицы 10, показатели системы гемостаза и показатель R не отличаются от нормативных. Нет других клинико-лабораторных признаков ДВС-синдрома после курса заместительной терапии.

Этот клинический пример также демонстрирует динамику показателя R при эффективном лечении ДВС-синдрома. Сниженный показатель R у больного с ожоговой болезнью применили в качестве критерия для диагностики ДВС и для оценки эффективности заместительного лечения. После лечения у больного нормализовался показатель R, что свидетельствует об эффективности применявшегося лечения.

Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии. Способ обеспечивает повышение эффективности лечения ДВС-синдрома за счет объективной оценки достаточности и результативности заместительной терапии. Проводят определение антикоагулянтов в плазме крови, при этом вычисляют показатель отношения времени свертывания в АПТВ-тесте после добавления активатора протеина С к времени свертывания в АПТВ без активатора и при значении этого показателя после лечения меньше 2,1 лечение считают неэффективным, а при значении показателя равным 2,1 или больше лечение считают эффективным. 10 табл., 1 ил.

Способ контроля эффективности лечения заместительной терапией при ДВС-синдроме путем определения антикоагулянтов в плазме крови, отличающийся тем, что вычисляют показатель отношения времени свертывания в АПТВ-тесте после добавления активатора протеина С к времени свертывания в АПТВ без активатора и при значении этого показателя после лечения меньше 2,1 лечение расценивают неэффективным, а при значении показателя равным 2,1 или больше лечение расценивают эффективным.