СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АНТИФОСФОЛИПИДНОГО СИНДРОМА Российский патент 1998 года по МПК G01N33/86 

Изобретение относится к медицине, в частности к исследованию крови, и может быть использовано для лабораторной диагностики иммунных тромбофилий, а также других патологических состояний, связанных с присутствием в крови антифосфолипидных антител.

Известно, что одной из причин тромбозов является антифосфолипидный синдром. Сущность его заключается в появлении в крови антител к отрицательно заряженным фосфолипидам и белково-фосфолипидным комплексам фрагментированных оболочек клеток. К этой группе антител относятся "антикоагулянты волчаночного типа" (АВТ), впервые обнаруженные и идентифицированные Conley C.L. и соавт. в 1952 г. Они появляются в крови при многих иммунных заболеваниях и синдромах (системная красная волчанка, ревматоидный артрит, аллергические заболевания и реакции, опухоли иммунной системы, СПИД, хронические гепатиты В и С, дельта и др.) Известны случаи выявления АВТ у больных без четких проявлений каких-либо других заболеваний. Появление АВТ в крови ухудшает течение предшествующего заболевания, часто приводит к рецидивирующим тромбозам и тромбоэмболиям, является одной из причин невынашивания беременности. Своевременное удаление из организма волчаночных антикоагулянтов позволяет избежать этих осложнений. Поэтому ранняя и точная диагностика антифосфолипидного синдрома является важной задачей. Однако поиск надежных методов диагностики связан со значительными трудностями, обусловленными морфологической и функциональной разнородностью этой группы антител.

Известен способ диагностики антифосфолипидного синдрома путем определения в крови иммунноглобулинов G, M и A, к которым принадлежит большинство АВТ, а также путем определения в крови антикардиолипинов, присутствие которых в плазме крови часто сочетается с наличием АВТ (Hаrris E.N., Gharavi A. E. , Patel S.A., Hughes G.R.V.: Evaluation of the anti - cardiolipin test: report of an international workshop held 4. April 1986. Glin. Exp. Immunol., 1987, 68, 215-22).

Недостатком известного способа является неспецифичность, поскольку он не выявляет АВТ, а только определяет иммунологические ситуации, при которых возможно присутствие в крови волчаночных антикоагулянтов.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ диагностики антифосфолипидного синдрома путем проведения коагуляционных тестов (Exner T., Triplett D.A., Taberner D., Machin S.J.: Guidelines for Testinq and Revised Criteria for Lupus Anticoagulants. SSC Subcommittee for Standardization of Lupus Anticoagulants, Thromb. Haemost., 1991, 65, 320-22).

В отечественной практике в этот способ было внесено дополнение, заключавшееся в применении в комплексном методе лабораторной диагностики коагуляционных проб с ядами змей отечественной фауны: гюрзы обыкновенной (Vipera lebetina turanica) и эфы многочешуйчатой (Echis multisquamatus). Высокая информативность этих тестов в ручном исполнении была установлена при исследовании больных с антифосфолипидным синдромом (Г.В.Сердюк, А.Е.Дорохов, Л.П. Цывкина. Динамика показателей ядовых коагуляционных тестов в плазме больных с волчаночными антикоагулянтами. Проблемы теоретической и прикладной токсикологии: Тез. докл. 1 Всесоюзн. токсикологической конф. - Ашхабад, 1991, с. 38. ; Barkagan Z.S., Serdyuk G.V., Tsyvkina L.P., Dorochov A.E., On unusual results of the phospholipid independent snake venom test in the patients with lupus anticoagulant (LA) and high thrombotic tendency. Lupues 3(4) Abst. 153, p. 35).

Способ-прототип заключается в следующем:
1. Получают бедную тромбоцитами плазму (БТП) здорового донора и больного.

2. Параллельно на образцах БТП здорового донора и больного выполняют ориентировочные коагуляционные тесты: каолиновое время свертывания, протромбиновое время с разведенным тромбопластином активностью 40-50 с при тестировании на референтной нормальной плазме, лебетоксовое время с ядом гюрзы обыкновенной 30-35 с активности на БТП здорового, эхитоксовое время с ядом эфы многочешуйчатой 30-35 сек активности на нормальной БТП.

3. При выявлении удлинения времени свертывания плазмы больного по сравнению с контрольной нормальной плазмой выполняют коррекционные тесты. В качестве исследуемого образца плазмы используют смесь БТП здорового и больного (1: 4). При этом укорочение времени свертывания в тестах до времени свертывания нормальной плазмы исключает присутствие в крови АВТ.

4. При отсутствии коррекции выявленных нарушений времени свертывания в коагуляционных тестах нормальной БТП выполняют следующую серию опытов.

Готовят смеси:
1. БТП здорового смешивают в равных объемах с суспензией отмытых и разрушенных тромбоцитов.

2. БТП больного смешивают в равных объемах с отмытыми и разрушенными тромбоцитами. На этих смесях параллельно выполняют коагуляционные тесты, нарушенные у исследуемого больного. При укорочении времени свертывания плазмы больного до нормальных значений коагуляционных тестов делают вывод, что выявленные у больного нарушения времени свертывания в лабораторных тестах коррегируются отмытыми и разрушенными тромбоцитами, что является специфическим признаком, характерным для АВТ.

Методика приготовления отмытых и разрушенных тромбоцитов
Цитратную кровь центрифугируют при 1500 об/мин (180 g) в течение 10 мин, затем богатую тромбоцитами плазму дополнительно центрифугируют при 3500 об/мин (900 g) в течение 20 мин. Надосадочный слой удаляют. Полученные тромбоциты дважды отмывают в буфере Михаэлиса (рН 7,3 ±0,1), доводя объем смеси до первоначального объема плазмы. Тромбоциты разрушают путем двухкратного замораживания в течение 30 мин при -20 ^oC.

Описанный способ, широко применяющийся в отечественной практике, является трудоемким, требует больших затрат времени. Однако даже при строгом соблюдении всех процедур степень разрушения тромбоцитов варьирует, не достигается достаточная очистка реагента от компонентов плазмы. Трудно контролировать концентрацию тромбоцитов и их фрагментов в реагенте, так как он годен в течение нескольких часов и для каждого исследования готовится из нового образца свежей плазмы.

Техническим результатом заявляемого способа является повышение точности исследования при одновременном упрощении способа диагностики антифосфолипидного синдрома путем применения вместо отмытых и разрушенных тромбоцитов в коррекционных тестах стандартизированного реагента - эритрофосфатида.

Эритрофосфатид - препарат, полученный из эритроцитов путем гипотонического гемолиза. В течение многих лет он применялся в отечественной лабораторной практике для исследования системы гемостаза в активированном парциальном тромбопластиновом, аутокоагуляционном тестах (Е.П.Иванов. Руководство по гемостазиологии. - Минск: Беларусь, 1991, с. 197-214; В.П.Балуда, З.С.Баркаган, Е.Д.Гольдберг, Б.И.Кузник, К.М.Лакин. Лабораторные методы исследования системы гемостаза. - Томск, 1980, с.135-142).

Применение эритрофосфатида в этих лабораторных методах было обусловлено свойством оболочек и стромы эритроцитов контактно активировать свертывающую систему крови и парциальной тромбопластиновой активностью реагента (С.С.Харамоненко, Е. Н.Хомич, А.А.Ракитянская. Роль эритроцитарных фосфатидов и полисахаридов в свертывании крови. Система свертывания крови и фабринолиз. - Киев, 1969, 432 с)
Однако с появлением отечественного кефалина для определения активированного парциального тромбопластинового времени применение эритрофосфатида в этих целях стало нецелесообразным, так как последний значительно уступает кефалину по чистоте и стандартности, а также в больших концентрациях оказывает антикоагулянтное действие. Имеются данные о биохимической структуре оболочек эритроцитов, которые во многом сходны с мембранами разрушенных тромбоцитов (Б.И.Кузник, В.П.Скипетров. Форменные элементы крови, сосудистая стенка, гемостаз и тромбоз. - М., 1974, с.74). Это дало основание применить эритрофосфатид вместо разрушенных тромбоцитов для коррекции удлиненного времени свертывания в лабораторных тестах у больных с волчаночными антикоагулянтами.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Реактивы и оборудование
1. Лимоннокислый натрий, трехзамещенный, 3,8% раствор.

2. Хлористый кальций (CaCL₂), 0,025 М раствор.

3. Суспензия легкого каолина 2,5 мг/мл в буфере Михаэлиса (pH 7,3 ± 0,1)
4. Человеческий мозговой тромбопластин активностью 40-50 с при тестировании на бедной тромбоцитами плазме (БТП) здорового.

5. Яд гюрзы обыкновенной (Vipera lebetina turanika) 30-35 с активности при тестировании на БТП здорового.

6. Яд эфы многочешуйчатой Echis multisquamatus 30-35 с активности при тестировании на БТП здорового.

7. Референтная нормальная плазма лиофилизированная. Разводится бидестиллированной водой перед исследованием до объема, предшествующего сушке. Все указанные реагенты выпускаются фирмой "Технология" (г.Барнаул).

8. Эритрофосфатид 3% (3 г на 100 мл) производства Беларусского НИИ гематологии и переливания крови, г.Минск.

9. Центрифуги ОПн-8 УХЛ 4.2., S 70 D.

10. Коагулометр оптический Коаг-а-Мате ХМ (Органон Текника).

Подготовка исследуемой плазмы больного и контрольной нормальной плазмы крови
Силиконированной иглой из вены набирают кровь в пробирку и смешивают ее с 3,8% лимоннокислым натрием в соотношении 9:1 (9 мл крови и 1 мл антикоагулянта), а затем центрифугируют при 1000 об/мин (200 g) в течение 5 мин. Полученную при этом богатую тромбоцитами плазму повторно центрифугируют при 3500 об/мин (900 g) в течение 20 мин. В результате получают бедную тромбоцитами плазму, которую используют для проведения анализа.

Ход определения
Первый этап. Параллельно выполняют коагуляционные тесты на БТП здорового и БТП больного. Для получения более точных результатов исследования выполняют на коагулометре.

Каолиновое время свертывания.

0,1 мл БТП прогревают в течение 1 мин при 37,5^oC, добавляют 0,1 мл суспензии каолина и инкубируют в течение 3 мин, по окончании времени инкубации добавляют в смесь хлористый кальций. Коагулометр регистрирует свертывание плазмы.

Протромбиновое время с разведенным тромбопластином.

0,1 мл БТП прогревают в течение 1 мин при 37,5^oC, добавляют 0,1 мл тромбопластина и инкубируют при указанной температуре 30 с, добавляют в смесь хлористый кальций.

Коагулометр регистрирует время свертывания плазмы.

Лебетоксовое время.

К 0,1 мл БТП добавляют 0,1 мл яда гюрзы обыкновенной и инкубируют смесь 30 с при 37,5^oC, добавляют 0,1 мл хлористого кальция. Коагулометр регистрирует свертывание плазмы.

Эхитоксовое время.

0,1 мл БТП прогревают при 37,5^oC в течение 1 мин, добавляют 0,1 мл яда эфы многочешуйчатой. Коагулометр регистрирует свертывание плазмы.

Второй этап. Готовят смесь БТП больного и БТП здорового (4:1). На этом образце смешанных плазм выполняют коагуляционные тесты, в которых у исследуемого больного было удлинено время свертывания, используя для каждого теста по 0,1 мл смешанного образца.

Третий этап. Готовят смеси из равных объемов: смесь N 1-БТП больного и эритрофосфатида в концентрации 1 мг/мл; смесь N 2-БТП здорового и эритрофосфатида в указанной концентрации. На этих образцах выполняют коагуляционные тесты, в которых у исследуемого больного было удлинено время свертывания, используя для каждого теста по 0,1 мл смешанного образца.

Эритрофосфатид готовят непосредственно перед исследованием, разводя готовый препарат, хранящийся в ампулах, в буфере Михаэлиса (pH 7,3 ±0,1) до концентрации 1 мг/мл.

Конечная концентрация препарата при выполнении тестов определения каолинового времени свертывания, протромбинового времени с разведенным тромбопластином 0,17 мг/мл, такая же концентрация достигается при выполнении теста определения лебетоксового времени свертывания, в котором используется препарат яда гюрзы обыкновенной с низкой коагуляционной активностью.

Заявляемый способ диагностики был применен у 8 больных с антифосфолипидным синдромом. Параллельно проводилась лабораторная диагностика антикоагулянтов волчаночного типа с применением отмытых и разрушенных тромбоцитов (см. табл. 1).

На первом этапе исследования у больных было выявлено удлинение времени свертывания плазмы в каолиновом, протромбиновом с разведенным тромбопластином, лебетоксовом тестах. Это нарушение свертывания не исправлялось при добавлении нормальной БТП. Результаты коррекции нарушения свертывания разрушенными тромбоцитами и эритрофосфатидом достоверно не отличались друг от друга. В обоих случаях достигалось укорочение времени свертывания плазмы больного до нормальных значений коагуляционного теста или укорочение времени свертывания было большим, чем на контроле.

Таким образом, эритрофосфатид можно использовать в коррекционных тестах для лабораторной диагностики антифосфолипидного синдрома. Это стандартизирует исследование, так как в нем используется готовый препарат с известной концентрацией, длительно хранящийся, очищенный от компонентов плазмы. Использование готового реагента значительно упрощает процедуру исследования, сокращает время его проведения. Появляется возможность в перспективе использовать эритрофосфатид при комплектовании набора реагентов для лабораторной диагностики антифосфолипидного синдрома.

Пример 1. Больная Х.Е.А., 25 лет (ист.бол. N 6-175) поступила в ревматологическое отделение АККБ 28.02.95. Клинический диагноз: системная красная волчанка, с поражением кожи, суставов, хроническое течение. Антифосфолипидный синдром.

При иммунологическом исследовании с помощью лазерной нефелометрии выявлено повышение концентрации иммунных комплексов -4,05 ед. (норма 0,00 - 2,70 ед. ), гиперпродукция иммуноглобулинов класса М-1,7 мг/мл (норма 0,9 - 1,5 мг/мл). При исследовании системы гемостаза получены следующие результаты ( см. табл. 2).

У больной было выявлено удлинение времени свертывания плазмы в каолиновом, протромбиновом с разведенным тромбопластином, лебетоксовом тестах, которое не коррегировалось при добавлении нормальной БТП. При коррекции нарушения свертывания разрушенными тромбоцитами и эритрофосфатидом время свертывания плазмы в коагуляционных тестах достигало нормальных значений или было короче нормальных показателей.

Пример 2. Больная Коваленко Н.И., 36 лет (ист.бол. N М-1222) находилась на лечении в терапевтическом отделении МСЧ АМЗ с 22.11.94 по 20.12.94. Установлен клинический диагноз: системная красная волчанка, с поражением кожи, суставов, хроническое течение. При иммунологическом обследовании выявлено повышенное количество иммуноглобулинов класса g-20,2 (норма 7,2-16,37), класса А - 12,96 (норма 1,92-5,38). Показатели коагуляционого гемостаза отражены в табл. 3. Добавление нормальной плазмы не приводило к нормализации времени свертывания у больной, а разрушенные тромбоциты и эритрофосфатид исправляли это нарушение.

Выявление циркулирующих волчаночных антикоагулянтов в крови заявляемым и известным способом осуществляют путем оценки влияния АВТ на систему коагуляционного гемостаза. Однако в заявляемом способе в качестве реагента для коррекционных тестов используют готовый, стандартный, длительно хранящийся реагент эритрофосфатид, что повышает точность исследования и упрощает диагностический процесс. Применение готового реагента дает возможность стандартизировать систему диагностики антифосфолипидного синдрома путем использования в лабораториях гемостаза лечебных учреждений различного типа комплексных наборов для выявления волчаночных антикоагулянтов.

Способ диагностики антифосфолипидного синдрома заключается в том, что выполняют ориентировочные коагуляционные тесты и проводят коррекционные пробы, в которых используют эритрофосфатид в концентрации 1 мг/мл вместо отмытых и разрушенных тромбоцитов. Способ может применяться для диагностики иммунных тромбофилий, а также других патологических состояний, связанных с присутствием в крови антифосфолипидных антител. 3 табл.

Способ диагностики антифосфолипидного синдрома путем выявления в коагуляционных тестах удлиненного времени свертывания бедной тромбоцитами плазмы и выполнения коррекционных тестов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения диагностики, в коррекционных тестах применяют эритрофосфатид в концентрации 1 мг/мл вместо отмытых и разрушенных тромбоцитов.