СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 2002 года по МПК A61K41/00 A61K35/78 A61L15/28 

Изобретение относится к способам получения биологически активных веществ, предназначенным для использования в биологии, медицине, фармакологии и т.д.

Посредством химической или физической модификации природных веществ, в частности полисахаридов и лектинов, можно достигать усиления их адаптогенных свойств и повышения специфической биологической активности.

Известен способ получения биологически активного вещества (модифицированного пектина) модификацией природного соединения (цитрусового пектина), состоящий в том, что раствор пектина подвергают следующей обработке: увеличивают рН до 10,0 с помощью NaOH (3N) в течение 30 мин и затем уменьшают рН до 3,0 с помощью НСl (3N) [Alberscheim et al, A Method for Analysis of Sugars in Plant Cell Wall Polysaccharides by Gas Liquid Chromatography. - Carbohydrate Research, 1967, 5, 340-346]. Химическая модификация цитрусового пектина приводит к появлению противоопухолевой активности, благодаря чему можно уменьшать метастазирование опухолей предстательной и молочной желез.

Химический метод представляется достаточно сложным, имеет большой разброс параметров выходного продукта и трудно реализуем в промышленных масштабах производства.

Известен способ активации лекарственных препаратов, в частности водного раствора бензил-пенициллина, путем воздействия низкочастотного ультразвука в кавитационной струе вблизи порога кавитации при плотности ультразвуковой энергии 0,05-2,0 Дж/мл в течение 30-300 с [патент Российской Федерации 2020961, А 61 К 41/00, опубл. 15.10.94]. Ультразвуковая модификация, осуществляемая этим способом, повышает биологическую активность водных растворов лекарственных препаратов, исключая разрушение структуры неустойчивых препаратов, типа антибиотиков, и одновременно оказывая влияние на тонкую структуру гидрофильно-гидрофобного взаимодействия молекул лекарственного препарата с растворителем.

Недостатком этого способа активации является малое поглощение водным растворителем ультразвука, что требует повышенных энергозатрат при проведении процесса. Кроме того, обработка выполняется непосредственно перед введением препаратов больному, что делает доступным предложенный метод только непосредственно в клиниках, оснащенных ультразвуковой техникой и владеющих этой, совсем не распространенной в среде врачей, технологией.

Известен способ получения биологически активного вещества модификацией природного соединения, состоящий в том, что исходное вещество (карбоксиметил-хитин-глюкан) подвергают воздействию волновой энергии ультразвукового излучения с мощностью 100 Вт при частоте 25 кГц в течение 10 мин в ледяной ванне. Из исходного вещества с молекулярной массой 2,5x10⁵ была получена фракция с молекулярной массой 0,19x10⁵ [D. Chorvatovicova, E. Machova, J. Sandula, Ultrasonication: the way to achieve anti-mutagenic effect of carboxymethyl-chitin-glucan by oral administration. - Mutation Research, 1998, v. 412, n.1, p. 83-89]. Низкомолекулярные гепариноиды, полученные с помощью ультразвуковой обработки хитина, обладают антиметастатической и иммуностимулирующей активностью.

Недостатком способа является нерациональное использование энергии при такой обработке. Это определяется тем, что для селективного расщепления больших молекул полисахаридов на меньшие по размерам, но биологически более активные соединения, чтобы исключить процессы обратной полимеризации, в обрабатываемый раствор необходимо быстро (без существенного нагрева массы раствора) вложить довольно большую энергию. Но из-за большой длины волны ультразвука невозможно быстро создавать высокие плотности энергии в малом объеме, поэтому для накопления практически значимых количеств целевого продукта приходится обрабатывать большие объемы сырья и увеличивать время воздействия. При этом растет температура реакционной смеси, скорость процессов обратной полимеризации и уменьшается выход реакции.

Известен патент "Способ лечения болезней пародонта, слизистой оболочки полости рта и губ и устройство для обработки воды, масла и масляных растворов (варианты)" [патент Российской Федерации 2148422, 7 А 61 N 2/00, 5/067, А 61 К 41/00 (заявка на патент Российской Федерации 98112193, опубл. 10.04.2000)] . В этом патенте описывается способ лечения стоматологических болезней путем применения больными ванночек, самостоятельной очистки полости рта активированным маслом, масляным раствором и ряда других последовательных лечебных действий. В этом патенте активирование масла или масляного раствора предложено осуществлять лазерным излучением. Там же описано устройство для обработки воды, масла и масляных растворов, в котором лазерный световод расположен перпендикулярно внутриканальному потоку жидкости.

В указанном способе обрабатываются вещества, необходимые для лечения узкого круга конкретных стоматологических болезней. При этом за рамками патента остался широкий круг возможных исходных веществ для активации, которые необходимы при лечении ряда иных заболеваний - онкологических, хронических вирусных инфекций и пр., а также оптимальные параметры процесса активизации для таких веществ.

Заявляемое изобретение решает задачу эффективного получения биологически активных веществ из природных соединений.

Сущность изобретения состоит в способе получения биологически активных веществ путем воздействия на исходное вещество лазерным излучением с длиной волны от 9 до 11 мкм и плотностью мощности в диапазоне 0,1-1 кВт/см². В частном случае реализации изобретения в качестве исходного вещества используют либо вещества, содержащие полисахариды или лектины, либо виноматериалы, или исландский мох Cetraria Islandica, или зостерин, или соединения, продуцируемые микроорганизмами Васillа Thuringiesis, например протоксин из супернатанта двухдневной культуры клеток Bacilla Thuringiesis. Исходное вещество может использоваться либо в виде суспензии из размельченного растительного или животного сырья в воде, или растительном масле, или этиловом спирте, либо в виде раствора природного соединения, при этом в качестве растворителя может применяться вода, или растительное масло, или этиловый спирт. Исходное вещество подают в зону лазерного воздействия либо в виде сплошной, либо капельной струи со скоростью истечения струи в пределах 0,05-10 м/с. Исходное вещество подают в зону лазерного воздействия либо в виде сплошной, либо капельной струи со скоростью истечения струи в пределах 0,05-10 м/с. Исходное вещество, облученное лазером, может смешиваться с ингибитором полимеризации, в частности этанолом, который добавляют в количестве не менее 10% по объему. Получаемые после лазерного воздействия вещества, например олигогалактизид из пектина морской травы Зостера, могут быть подвергнуты дополнительной химической модификации биологически активными соединениями, такими как антибактериальные пептиды, или производные триптофана, или триптофансодержащие пептиды, или гликопептиды.

Технический результат, достигаемый при использовании изобретения, состоит в повышении эффективности активации природных соединений при высокой селективности воздействия и хорошей управляемости процессом, что дает возможность создавать энергетически эффективные лазерные комплексы для получения биологически активных веществ, содержащие лазерную установку, систему подачи природного соединения в зону лазерного воздействия и систему транспортировки лазерного излучения в одну точку. Благодаря малой длине волны (9-11 мкм) лазерное излучение фокусируется до плотности мощности ~5х10⁴ Вт/см³ и более, а время взаимодействия с обрабатываемым веществом легко устанавливается менее 10^-1сек. Очевидно, что при таких условиях обработка будет выполняться без нагрева основной массы вещества. Предварительные эксперименты, выполненные сотрудниками НИИЭФА и Военно-медицинской Академии, Санкт-Петербург, выявили решающие преимущества лазерной модификации природного сырья, обусловленные большей концентрацией энергии излучения на обрабатываемом объекте, высокой селективностью воздействия и хорошей управляемостью процессом. В дополнение к чисто механическому энергетическому воздействию излучения на материал с формированием в объеме обрабатываемого материала мощных ударных волн, разрушающих длинные цепи молекул полимеров, лазерное излучение оказывает селективное воздействие на вещество. Лазерная технология позволяет также замедлять процессы обратной полимеризации образованных в результате облучения активных свободных радикалов, увеличивая, тем самым, выход целевых продуктов. Эксперименты, выполненные на установках Лазерного Центра НИИЭФА, подтвердили эффективность применения лазерного излучения для фотомодификации полисахаридов с целью придания им дополнительной биологической активности.

Изобретение поясняется чертежами, где на фиг.1 в табличной форме приведены данные по изменению молекулярного состава раствора исландского мха в результате воздействия лазерного излучения. На фиг.2 и 3 представлено изменение молекулярного состава раствора исландского мха в результате обработки его лазерным излучением в виде диаграмм. На фиг.4 - в виде диаграмм приведена динамика выживаемости лабораторных животных (мышей с привитой рабдомиосаркомой) под влиянием модифицированных лазерным излучением полисахаридов из морской травы Zostera и исландского мха.

На фиг.5 в виде диаграмм представлена цитотоксичность NK-клеток у мышей с рабдомиосаркомой. На фиг. 6 в качестве примера практической реализации способа приведена функциональная схема комплекса для получения биологически активных веществ.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Лазерное излучение с плотностью мощности в диапазоне (0,1-1) кВт/см² фокусируется на специально сформированную сплошную или капельную струю обрабатываемого материала. В качестве исходного сырья предлагается использовать вещества, содержащие полисахариды или лектины. Посредством лазерной модификации природных полисахаридов и лектинов можно достигать усиления их адаптогенных свойств и повышения специфической биологической активности. При лазерной обработке природного сырья, содержащего полисахариды, не только значительно увеличивается количество биологически активных низкомолекулярных фракций, но и появляются новые соединения, обладающие повышенной биологической активностью. Полученные в результате лазерной фотохимической деградации олигосахаридные смеси могут быть использованы для детоксикации, то есть выведения тяжелых металлов и иммунных комплексов, повышения функциональной активности макрофагов и NK-клеток, нейтрализации патогенетических эффектов эндогенных лектинов. Появление у модифицированных пектинов новых антигенных и иммуногенных свойств позволит использовать их также в процессе изготовления вакцин для иммунопрофилактики различных заболеваний, в частности брюшного тифа. В качестве сырья используются также такие природные соединения, как виноматериалы, исландский мох Cetraria Islandica, зостерин и онкотоксичные соединения, продуцируемые Васillа Thuringiesis, например протоксин из супернанта двухдневной культуры клеток Васillа Thuringiesis. Выбор этих объектов связан с наличием у них специфических биологических эффектов. Пигментсодержащие фракции мздры и проантоцианиды, экстрагированные из косточек винограда, обладают хемопротективными свойствами по отношению к свободным радикалам кислорода. В частности таблица, приведенная на фиг.1, демонстрирует изменение молекулярного состава в сторону замещения полисахаридов более низкомолекулярными олигосахаридами. Исландский мох используется в качестве противоязвенного средства при язвах желудка и двенадцатиперстной кишки. Из морской водоросли Zostera путем переработки выделяют полисахарид пектиновой природы - зостерин. Эксперименты по облучению лазерным лучом виноматериалов, исландского мха и зостерина, показали, что в результате такой обработки действительно происходит накопление представляющих практический интерес количеств низкомолекулярных олигосахаридов, обладающих повышенной биологической активностью. Противоопухолевые эффекты, проявляемые продуктами жизнедеятельности Bacilla Thuringiеsis, усиливаются, если их подвергнуть воздействию лазерного излучения и тем самым ковалентно связать имеющийся там онкотоксин с низкомолекулярным углеводным лигандом, типа галактозоамина. Исходный продукт подвергается лазерной обработке в виде суспензии из размельченного растительного и животного сырья в воде, или растительном масле, или этиловом спирте. При лазерной обработке наряду с усилением адаптогенных свойств продукта за счет фотохимической активации его компонентов, будет протекать и процесс экстракции целевых компонентов. Подвергать фотохимической модификации можно также и раствор исходного продукта в соответствующем растворителе. В настоящее время созданы лазеры, генерирующие излучение в широком диапазоне длин волн от ультрафиолета до инфракрасной области спектра, что позволяет подобрать излучение, наиболее хорошо поглощаемое применяемым растворителем, или в случае резонансной фотодиссоциации селективно воздействовать на выбранные химические связи для расщепления больших молекул на фрагменты, обладающие необходимыми свойствами. Эксперименты, проведенные авторами изобретения, показали высокую эффективность излучения СО₂-лазера (излучение в диапазоне длин волн от 9,0 мкм до 11,0 мкм) для описываемых процессов, а также тот факт, что излучение с длиной волны 1,06 мкм практически не оказывает необходимого действия, в то время, как излучение СО₂-лазера с длинами волн 9-11 мкм дает высокий выход активированного продукта. Экспериментально определен диапазон мощности лазерного излучения, наиболее эффективный для модификации исходных материалов - 0,1÷1 кВт/см².

На фиг.2 и 3 на примере исландского мха показана зависимость выхода модифицированного продукта от плотности мощности лазерного излучения. При плотности мощности более 1 кВт/см² наблюдается сгорание заметного количества органических веществ, что, как правило, не приемлемо. Для предотвращения процессов обратной полимеризации модифицированного соединения оно смешивается с ингибитором полимеризации. Это приводит к значительному повышению эффективности использования как энергии излучения, так и исходного природного соединения. В качестве ингибитора полимеризации предлагается этанол (этиловый спирт), хорошо сочетающийся с большинством лекарственных препаратов и являющийся для них консервантом, ингибирующее действие которого при деполимеризации полисахаридов экспериментально подтверждено авторами. Экспериментально определено минимально необходимое количество этанола - 10% по объему. Установлено, что этиловый спирт предотвращает полимеризацию олигосахаридов, полученных путем лазерной фотомодификации полисахаридов из исландского мха и морской травы Зостеры. В контрольных исследованиях содержание низкомолекулярных фракций (20-40 КДа) через час после лазерной модификации исходного сырья уменьшалось в 4,8-5,6 раза (с 26,8+2,6% до 5,4+1,8%) вследствие свободнорадикальной их полимеризации. Добавление 40% раствора этилового спирта в объемной пропорции от 1:100 до 1:10 к исходному сырью прямо пропорционально уменьшало или полностью предотвращало полимеризацию продуктов - низкомолекулярных олигосахаридов, полученных путем лазерной модификации исходного сырья. Механизм этой реакции - нейтрализация, "тушение" свободных радикалов. Подобным, но менее выраженным эффектом обладали другие антиоксиданты - эномеланины из мздры винограда и полифенолы из экстракта зеленого чая. Добавление антиоксидантов и нейтрализаторов свободных радикалов способствует уменьшению содержания целевых соединений в конечном продукте, полученном при лазерной модификации исходного сырья.

С целью придания дополнительной биологической активности веществам, полученным в результате лазерной обработки, производится их дополнительная химическая модификация биологически активными соединениями. Химическая модификация облученных смесей биологически активными веществами приводит к потенцирующему эффекту в результате рецепторопосредованной адгезии на клетках-мишенях этих биологически активных веществ с последующей реализацией их специфического эффекта. В качестве соединений для вторичной модификации облученных смесей предлагаются антибактериальные пептиды, производные триптофана или триптофансодержащие пептиды и гликопептиды. Предлагается ковалентно связать молекулу антибактериального пептида с соответствующими реакционно+= способными группами олигосахаридной смеси, полученной в результате облучения, создав, таким образом, соединение с усиленным биологическим эффектом, а также ковалентно связать с полученными олигосахаридами некоторые производные триптофана или содержащие его пептиды и гликопептиды. За счет ароматического характера индольного кольца триптофана, выражающегося в способности реализовывать электронные π-π взаимодействия между регулирующими молекулами, участвующими в физиологических процессах, наличие в молекуле биологически активного соединения остатка триптофана или его метаболитов увеличивает ее сродство к соответствующим рецепторам и усиливает ее специфическую активность. Влияние сахаридов, модифицированных лазерным излучением, на мышей с привитой рабдомиосаркомой прослеживается на трех кривых, приведенных на фиг.4. В контрольной группе из 25 особей (группа 1) животные получали лишь обычную пищу и питье. В дополнение к этому животные из группы 2 (также из 25 особей) получали с питьевой водой 5%-ный раствор модифицированных излучением СО₂-лазера полисахаридов из морской травы Zostera, а животные из группы 3 (также из 25 особей) получали с питьевой водой 5%-ный раствор модифицированных излучением СО₂-лазера полисахаридов из исландского мха Cеtraha Islandica. Кривая 1 показывает среднюю продолжительность жизни в контрольгой группе (группе 1), кривая 2 - среднюю продолжительность жизни в группе 2, кривая 3 - среднюю продолжительность жизни в группе 3. Видно, что как раствор модифицированных излучением СО₂-лазера полисахаридов из морской травы Zostera, так и раствор модифицированных излучением СО₂-лазера полисахаридов из исландского мха, оказывают существенное положительное влияние на выживаемость животных. В отличие от исходного сырья - полисахаридов низкомолекулярные продукты их лазерной модификации легко проникают через слизистые барьеры желудочно-кишечного тракта и оказывают иммуностимулирующее действие путем активации функциональной активности Т-лимфоцитов-натуральных киллеров), моноцитов и макрофагов, что иллюстрируется кривыми (фиг.5), где в группу 1 выделено воздействие на мышей 5%-ного раствора полисахаридов из морской травы Зостера, модифицированных лазерным излучением, а в группу 2 - воздействие 5%-ного раствора полисахаридов из морской травы Зостера, модифицированных лазерным излучением, а в группу 2 - мыши, получавшие с питьевой водой 5% раствора полисахаридов из Исландского мха, модифицированных лазерным излучением, при их приеме с питьевой водой.

В примере реализации способа (фиг. 6) выходящий из СО₂-лазера 1 луч транспортируется к фокусирующему устройству 2, которое фокусирует его на текущей в поперечном направлении струе обрабатываемого материала в пятно с плотностью мощности в диапазоне (0,1-1) кВт/м². Для контроля за процессом часть излучения (до 10%-ной мощности) с помощью плоскопараллельной пластинки 3 ответвляется на датчик мощности излучения 4. В устройстве формирования струи 5 с помощью профилированного сопла-конфузора создаются необходимые параметры (диаметр - 1,5 мм и скорость истечения - 2 м/с) сплошной струи водно-спиртового раствора экстракта исландского мха (10% массовых этанола и 5% массовых экстракта исландского мха). В зоне взаимодействия 6 происходит лазерная фотохимическая модификация исходного вещества, и оно поступает в сборник 7. Для визуального контроля за процессом взаимодействия луч Hе-Ne лазера 8, сформированный коллиматором 9, проецируется на экран 10. Массовый состав веществ анализируется методами жидкостной хроматографии, а биологические испытания выполняются на подопытных животных.

Изобретение относится к способам получения биологически активных веществ, предназначенных для использования в биологии, медицине, фармакологии. Способ включает воздействие на исходное вещество лазерным излучением, которое имеет длину волны от 9 до 11 мкм, плотность мощности в диапазоне 0,1-1 кВт/см². В качестве исходного вещества используют либо вещества, содержащие полисахариды или лектины, либо виноматериалы, или исландский мох Cetraria Islandica, или зостерин, или соединения, продуцируемые микроорганизмами Bacilla Thuringiesis. Исходное вещество используют либо в виде суспензии из размельченного растительного или животного сырья в воде, или растительном масле, или этиловом спирте, либо в виде раствора природного соединения. В качестве растворителя применяют воду или растительное масло, или этиловый спирт. Исходное вещество подают в зону лазерного воздействия либо в виде сплошной, либо капельной струи со скоростью истечения струи в пределах 0,05-10 м/с. Исходное вещество, облученное лазером, смешивают с ингибитором полимеризации, в частности этанолом, который добавляют в количестве не менее 10% по объему. Получаемые после лазерного воздействия вещества подвергают дополнительной химической модификации биологически активными соединениями, такими как антибактериальные пептиды или производные триптофана, или триптофансодержащие пептиды, или гликопептиды. Способ позволяет эффективно получить биологически активные вещества из природных соединений. 12 з.п.ф-лы, 1 табл. 6 ил.

1. Способ получения биологически активных веществ путем воздействия на исходное вещество лазерным излучением, отличающийся тем, что лазерное излучение имеет длину волны от 9 до 11 мкм, плотность мощности в диапазоне 0,1-1 кВт/см². 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве исходного вещества используют вещества, содержащие полисахариды или лектины. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве исходного вещества используют виноматериалы, или исландский мох Cetraria Islandica, или зостерин, или соединения, продуцируемые микроорганизмами Bacilla Thuringiesis. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что исходное вещество представляет собой суспензию из размельченного растительного или животного сырья в воде или растительном масле, или этиловом спирте. 5. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что исходное вещество представляет собой раствор природного соединения. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что растворитель представляет собой воду или растительное масло, или этиловый спирт. 7. Способ по любому из пп.4-6, отличающийся тем, что исходное вещество подают в зону лазерного воздействия в виде сплошной или капельной струи. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что скорость истечения струи составляет от 0,05 до 10 м/с. 9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что исходное вещество, подвергнутое лазерному облучению, смешивают с ингибитором полимеризации. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что в качестве ингибитора используется этанол. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что этанол добавляют в количестве не менее 10% по объему. 12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что вещества, полученные в результате лазерного воздействия, подвергают дополнительной химической модификации биологически активными соединениями. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что дополнительная химическая модификация производится антибактериальными пептидами или производными триптофана, или триптофансодержащими пептидами, или гликопептидами.