ЛИГАНД, СПЕЦИФИЧЕСКИ СВЯЗЫВАЮЩИЙ СТВОЛ РЕЦЕПТОРА ПОЛИМЕРНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА (pIgR) КЛЕТКИ, СПОСОБ ИНТРОДУКЦИИ ЛИГАНДА В КЛЕТКУ И СПОСОБ ПРИСОЕДИНЕНИЯ ЛИГАНДА К КЛЕТКЕ, ЭКСПРЕССИРУЮЩЕЙ РЕЦЕПТОР ПОЛИМЕРНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА Российский патент 2002 года по МПК C07K16/42 A61K39/395 

Изобретение в основном относится к лиганду и способам специфического связывания лиганда с участком ствола рецептора полимерного иммуноглобулина для интернализации в клетку или транспорта через нее.

Уровень техники
Одной из наиболее острых проблем, стоящих перед фармацевтической и биофармацевтической промышленностью, является доставка терапевтических агентов через различные полупроницаемые мембраны в организме. В частности, когда дело касается макромолекул, эффективному с точки зрения стоимости, а также удобному или подходящему методу лечения часто препятствует отсутствие адекватной системы доставки лекарственного вещества. В свою очередь данная проблема продиктована экономической осуществимостью производства лекарственного препарата. Таким образом, поиск альтернативных систем доставки часто конкурирует с поиском самих новых лекарственных веществ.

Способы переноса генов могут рассматриваться как пример доставки макромолекулярного лекарственного вещества. Данные способы можно разделить на три категории: физические (например, электропорация, прямой перенос гена и бомбардировка частицами), химические (например, протеиноиды, микроэмульсии и липосомы) и биологические (например, векторы на основе вирусов и обусловленное рецепторами поглощение). Среди биологических способов переноса обусловленное рецепторами поглощение является наиболее перспективным подходом. Направление лиганда на поглощаемый посредством эндоцитоза рецептор становится средством переноса (транспортировки) данного лиганда в клетку. Однако одним недостатком систем, связанных с рецепторами, является общая для них зависимость от внутривенного способа введения, что существенно ограничивает возможности их применения.

Клетки слизистого эпителия выстилают ряд легко доступных тканей, таких как ткани, имеющиеся в верхних дыхательных путях и желудочно-кишечном тракте. Доступность данных клеток делает их привлекательной мишенью для доставки лекарственного вещества. См., например, статьи Fercol и соавт. (J. Clin. Invest. 92: 2394-2400 (1993)); Fercol и соавт. (J. Clin. Invest. 95: 493-502 (1995)). В работе Breitfeld и соавт. (J. Cell Biology 109:475-486 (1989) описан ретроградный (по типу обратной связи) транспорт антитела из полости к базолатеральной поверхности эпителиальных клеток, хотя осуществляемый на очень низких уровнях. В данном исследовании обнаружено, что после продвижения через клетку антитело связывается с секреторным компонентом рецептора полимерного иммуноглобулина (pIgR). Касательно уровня транспорта с базолатеральной поверхности к апикальной Breitfeld и соавт. сообщили, что менее 5% транспорта было ретроградным по своей природе. Номинальный уровень противоположно направленного транспорта снижает до минимума использование секреторного компонента в качестве средства для доставки биологически активных композиций в клетку. Более того, вследствие преобладания в полости расщепленного pIgR связывание лиганда с расщепленным pIgR, а не с интактным pIgR клеточной поверхности, снижало бы возможность использования противоположно направленного транспорта pIgR в качестве механизма доставки лекарственного вещества.

Соответственно, в уровне техники настоятельно требуются средства для переноса лигандов внутрь клетки или насквозь через клеточную поверхность с высокой эффективностью. В частности, в уровне техники требуются средства для доставки макромолекул к клетке, выстилающей желудочно-кишечный тракт или дыхательные пути, в данную клетку или для прохождения через нее. Данное изобретение представляет указанные или иные преимущества.

Сущность изобретения
Согласно одному аспекту данное изобретение направлено на лиганд, который специфически связывает ствол рецептора полимерного иммуноглобулина pIgR клетки при таком условии, что лиганд практически не связывает секреторный компонент pIgR в физиологических условиях. В типичном случае антитело специфически связывает только ствол. В одном варианте осуществления лиганд является антителом, предпочтительно человеческим антителом. В другом варианте осуществления лиганд является фрагментом вариабельного участка рекомбинантного антитела из одной цепи. В еще одном варианте осуществления лиганд связывает внеклеточный эпитоп на участке из первых 33 аминокислот, которые в клеточной мембране являются проксимальными сайту расщепления рецептора.

Лиганд может содержать связывающий компонент для связывания со стволом и биологически активный компонент, такой как нуклеиновая кислота, белок, радиоизотоп, липид и углеводород. Биологически активные компоненты содержат противовоспалительные агенты, антисмысловые олигонуклеотиды, антибиотики и антибактериальные агенты. В одном варианте осуществления биологически активный компонент представлен нуклеиновой кислотой, кодирующей муковисцидозный регулятор трансмембранной проводимости дикого типа. В предпочтительном варианте осуществления клетка представлена эпителиальной клеткой, наиболее предпочтительно эпителиальной клеткой млекопитающего.

В другом аспекте данное изобретение направлено на способ интродукции лиганда в клетку, экспрессирующую рецептор полимерного иммуноглобулина, посредством присоединения лиганда к стволу рецептора полимерного иммуноглобулина клетки при условии, что лиганд практически не связывает секреторный компонент pIgR в физиологических условиях. В одном варианте осуществления лиганд присоединяется к стволу на апикальной поверхности клетки, а в других вариантах осуществления лиганд подвергается трансцитозу на базолатеральную поверхность клетки и высвобождается из ствола на базолатеральной поверхности.

В другом аспекте данное изобретение касается способа присоединения лиганда к клетке, экспрессирующей рецептор полимерного иммуноглобулина, который предусматривает стадию связывания лиганда со стволом рецептора при условии, что лиганд практически не связывает секреторный компонент pIgR в физиологических условиях. В одном варианте осуществления лиганд интродуцируют в клетку после связывания. Альтернативные варианты осуществления данного изобретения могут стать понятными при ссылке на различные аспекты данного изобретения.

Среди различных вариантов применения in vitro и in vivo данное изобретение может быть использовано для транспорта терапевтических и диагностических композиций на эпителиальные клетки слизистых оболочек, внутрь данных клеток или через них. Таким образом, изобретение представляет высоко эффективное и удобное средство для переноса нуклеиновых кислот или белков в эпителиальные клетки.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Данное изобретение направлено на лиганд, который специфически связывает рецептор полимерного иммуноглобулина (pIgR) клетки при условии, что лиганд практически не связывает секреторный компонент pIgR в физиологических условиях. Изобретение представляет среди прочего способы присоединения и интродукции лиганда в клетку, экспрессирующую PlgR.

После транспорта к апикальной поверхности эпителиальных клеток большая часть pIgR расщепляется с высвобождением секреторного компонента. Мы к своему удивлению неожиданно обнаружили, что расщепление интактного pIgR в полости сохраняет интактным остаточный экстрацеллюларный (внеклеточный) участок pIgR (т.е. "ствол") и более того, что ствол сохраняет способность к связыванию, несмотря на обилие протеаз, которые обычно присутствуют в среде полости. Способность к связыванию, эндоцитоз и трансцитоз лиганда, связанного со стволом pIgR, частично представляет изобретение, как описано и заявлено здесь.

Данное изобретение имеет применение как средство для транспорта терапевтических или диагностических композиций к клеткам, экспрессирующим pIgR, внутрь данных клеток (эндоцитоз) и через них (трансцитоз). Таким образом изобретение может быть использовано для транспорта биологически активных композиций, таких как белки, нуклеиновые кислоты или определяемые метки, конкретно к клеткам, экспрессирующим pIgR. Изобретение также представляет средство для мечения и распознавания эпителиальных клеток из смешанной клеточной популяции при исследованиях патологий. Далее, поскольку экспрессия pIgR в карциномах понижена относительно таковой у клеток нормального эпителия, мечение pIgR имеет применение в качестве диагностического вспомогательного средства в способах эндоскопии или радиологии. Кроме того, связывание терапевтических лигандов с pIgR может найти применение для увеличения периода их пребывания в полости различных путей и повышения их эффективности.

Определения
До тех пор, пока здесь не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в контексте заявки, имеют то же самое значение, что обыкновенно подразумевается специалистами, в области, к которой относится изобретение. Словари Singleton и соавт. (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, второе издание, John Wiley and Sons (New York)и Hale and Marham (1991) The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY предлагают специалисту словарную основу многих терминов, используемых в данном изобретении. Аминокислоты могут быть определены либо своими общеизвестными трехбуквенными символами, либо однобуквенными символами, рекомендованными Биохимической номенклатурной комиссией IUPAC-IUB. Нуклеотиды подобным образом могут быть определены общепринятыми однобуквенными обозначениями. Для целей данного изобретения ниже определены следующие термины.

Термины "лиганд" или "связывающая структура (часть) лиганда" означают все молекулы, способные к специфическому связыванию рецептора полимерного имуноглобулина (pIgR). Лиганды включают, но не ограничиваются антителами, белками, пептидами, нуклеиновыми кислотами, липидами и углеводами.

Термин "биологически активный компонент" означает соединение, которое in vivo непосредственно вызывает или ингибирует увеличение или уменьшение клеточной транскрипции, трансляции, связывание рецептора, активный или пассивный транспорт, клеточный сигнал, сигнальную трансдукцию, деление клетки, клеточную дифференциацию, гибель клетки, клеточную адгезию, движение клетки, морфологию клетки, метаболизм, ферментную активность, апоптоз, деградацию белков, продвижение белков (например, секрецию), стабильность белков или фосфорилирование. Биологически активные компоненты также содержат диагностические композиции, которые позволяют проводить оценку вышеупомянутых событий.

Термины "связывают(ет) специфически" или "специфически связывают(ет) или "связанный (присоединенный)" или "связывающий (присоединяющий)" означают предпочтительную ассоциацию лиганда (полностью или частично) с клеткой или тканью, несущей определенную молекулу-мишень или маркер, но не с клетками или тканями, в которых отсутствует данная молекула-мишень. Понятно, конечно, что может существовать определенная степень неспецифического взаимодействия между молекулой и клеткой или тканью-немишенью. Тем не менее, специфическое связывание может быть распознано и выделено, так как оно обусловлено специфическим узнаванием молекулы-мишени. Как правило, специфическое связывание приводит к гораздо более сильной ассоциации (связи) между доставленной молекулой и клетками, несущими молекулу-мишень, чем между связанной молекулой и клетками, у которых отсутствует молекула-мишень. Специфическое связывание обычно приводит к увеличению больше чем в 2 раза, предпочтительно больше чем в 5 раз, более предпочтительно больше чем в 10 раз и наиболее предпочтительно больше чем в 100 раз количества связанного лиганда (на единицу времени) на клетку или ткань, несущую молекулу-мишень, по сравнению с клеткой или тканью, у которых отсутствует молекула-мишень или маркер.

Термин "ствол" означает экстрацеллюларный (внеклеточный) компонент рецептора полимерного иммуноглобулина (pIgR), соответствующий участку pIgR, который связывается с клеткой после расщепления сегмента pIgR, образующего секреторный компонент. Ствол присутствует независимо от того, является ли сегмент pIgR, который соответствует секреторному компоненту, отщепленным или не отщепленным от pIgR.

Термин "pIgR" или "рецептор полимерного иммуноглобулина" означает рецептор, который экспрессируется в эпителиальных клетках слизистых оболочек, включая эпителиальные клетки дыхательных путей, железистые клетки подслизистых оболочек, клетки кишечника, эпителий носа, эпителий молочной железы, слизистой оболочки рта, мочевых и половых путей, а также конъюктивальной ткани, и участвует в трансцитозе димерного иммуноглобулина A (dIgA) и/или пентамерного IgM от базолатеральной к апикальной поверхности.

Термин "практически не связывает" означает, что не больше чем 15% лиганда, специфически связывающего молекулу-мишень, связывает определенную молекулу-немишень. Более предпочтительно, не больше 10% связывает молекулу-немишень, даже более предпочтительно менее 5% и наиболее предпочтительно менее 1%.

Термин "секреторный компонент" означает экстрацеллюларную часть pIgR, которая обычно отщепляется после завершения процесса трансцитоза от базолатеральной к апикальной поверхности. В типичном случае секреторный компонент содержит димерный связывающий фрагмент pIgR, именно IgA (dIgA). Секреторный компонент как правило выделяется в полость совместно или без связанного с ним dIgA.

Термин "физиологические условия" означает внеклеточную среду, имеющую условия (например, температуру, рН или осмолярность), которые обеспечивают питательные вещества или рост представляющей интерес клетки.

Термин "антитело" означает молекулу иммуноглобулина, полученную при генерации гуморального ответа in vitro или in vivo, и включает как поликлональные, так и моноклональные антитела. Термин также включает генно-инженерные формы, такие как химерные антитела (например, гуманизированные мышиные антитела), гетероконъюгированные антитела (например, биспецифические антитела) и рекомбинантные фрагменты Fv из одной цепи (scFv). Термин "антитело" также включает антиген-связывающие формы антител (например, Fab, F(аb)₂).

Термин "гуманизированное антитело" означает антитело, которое содержит аминокислотную последовательность нечеловека, константный участок которой был изменен с целью снижения иммуногенности у человека.

Термин "муковисцидозный регулятор трансмембранной проводимости дикого типа" означает функциональную (активную) форму муковисцидозного регулятора трансмембранной проводимости (CFTR). См. статью Riordan и соавт., Science, 245:1066-1073 (1989).

Термин "апикальная поверхность" означает ту поверхность клетки, к которой происходит трансцитоз интактного pIgR после эндоцитоза с базолатеральной поверхности. В основном апикальная поверхность клетки прилегает к полости, в которой интактный pIgR расщепляется с высвобождением секреторного компонента.

Термин "базолатеральная поверхность" означает ту поверхность клетки, с которой после синтеза в эндоплазматической сети и прохождения через аппарат Гольджи доставляется интактный pIgR.

Термин "поверхность ствола" означает экстрацеллюларный участок ствола.

Термин "высвобожденный (выделенный)" означает вмешательство в специфическую ассоциацию лиганда (в целом или частично) с его молекулой-мишенью.

Термин "подвергнутый трансцитозу" или "трансцитоз" означает перенос из одной плазматической мембраны клетки на другую внутриклеточным путем. Как правило трансцитоз происходит с базолатеральной на апикальную или с апикальной на базолатеральную плазматическую мембрану клетки.

Термин "проксимально клеточной мембране" означает около или вблизи клеточной мембраны.

Термин "экстрацеллюларный (внеклеточный)" означает участок, простирающийся наружу из двойного липидного слоя, окружающего клетку.

Идентификация pIgR
Последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот рецептора полимерного иммуноглобулина были идентифицированы у многих таксономически различных видов. См. работу Piskurich и соавт. Journal of Immunology 154:1735-1747 (1995). Идентификация pIgR из других видов может быть выполнена любым хорошо известным специалистам способом. Например, может быть сконструирован зонд нуклеиновой кислоты к pIgR с использованием опубликованных последовательностей pIgR. Зонд как правило следует создавать на основе консервативного участка pIgR. Гибридизация зонда с библиотекой геномной или кДНК может быть использована для идентификации pIgR у неизученных видов. Специалисту следует понимать, что последовательность нуклеиновой кислоты зонда pIgR должна быть в большинстве случаев последовательностью вида, который наиболее близок к виду, анализируемому зондированием. Обширный материал по гибридизации нуклеиновых кислот представлен в монографии Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Гибридизация с помощью зондов нуклеиновых кислот, часть 1, глава 2 "Обзор принципов гибридизации и стратегии анализов с помощью зонда нулеиновой кислоты", Elsevier, New York.

В альтернативном подходе pIgR или его пептидные фрагменты (например, секреторный компонент) могут быть использованы для скрининга экспрессирующих библиотек. См., например, статью Fercol с соавт., J. Clin. Invest. 95:493-502 (1995). Данные и иные способы, хорошо известные специалистам, могут быть обнаружены, например, в руководствах Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook с соавт. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2 изд.), тома 1-3 и Current Protocols in Molecular Biology, под ред. F.M. Ausubel с соавт., Current Protocols, объединение Greene Publishing Associates Inc. и John Wiley & Sons, Inc. (1994, Дополнение) (Ausubel). Подтверждение того, что нуклеиновая кислота (или белок) идентична той, которая кодирует pIgR, может быть выполнено с помощью таких подходов, как конструирование антител к предполагаемому белку pIgR и подтверждение способности данных антител связывать белок, которому присущи свойства pIgR (например, присутствие на поверхности эпителиальных клеток, связывание димерного IgA или пентамерного IgM и т.п.).

Идентификация ствола
Ствол может быть идентифицирован множеством хорошо известных специалистам способов. Была выявлена предполагаемая гептапептидная консенсусная последовательность, которая тождественна участку расщепления pIgR и определяет таким образом идентифицированный амино-конец ствола. Последовательность Phe-Ala-Xaa-Glu (SEQ ID No 1), где Хаа является полярной или заряженной аминокислотой, была идентифицирована как расположенная непосредственно перед данным предполагаемым участком расщепления. См. статью Piskurich с соавт. Journal of Immunology 154: 1735-1747 (1995). Расщепление по консенсусному участку высвобождает секреторный компонент и определяет его карбокси-конец. Карбоксильный конец секреторного компонента может быть изменен событиями вторичного расщепления (например, с помощью экзопептидазной или эндопептидазной активности), которые приводят к получению вторичных карбокси-концов. Однако амидная связь, которая изначально определяет амино-конец ствола и карбокси-конец секреторного компонента, может быть выявлена путем сравнительного анализа последовательности и идентификацией расщепляемой консенсусной последовательности.

Способы анализа последовательностей с целью их сравнения известны в уровне техники. Оптимальный сравнительный анализ последовательностей может быть выполнен с использованием алгоритма локальной гомологии, предложенного в работе Smith и Waterman (1981) Adv. Appl. Math., 2:482; алгоритма сравнительного анализа гомологий последовательностей Needleman и Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; способом поиска аналогий, предложенного в работе Pearson и Lipman (1988) Ргос. Natl. Sci. USA 85:2444; посредством компьютеризированного применения данных алгоритмов (включая, но не ограничиваясь CLUSTAL в программе PC/Gene Intelligenetics, Mountain View, California, GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr. Madison, Wisconsin, USA); программа CLUSTAL подробно описана в публикациях Higgins и Sharp (1988) Gene, 73:237-244 и Higgins и Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet и соавт. (1988) Nucleic Acids Research 16, 10881-90; Huang и соавт. (1992) Computer Applications in the Biosciences 8, 155-65 и Pearson и соавт. (1994) Methods in Molecular Biology 24, 307-31. Сравнительный анализ также часто проводят путем исследования и сравнения "вручную".

При другом подходе секреторный компонент может быть выделен из жидкостей в апикальной полости (например, из молока или желчи) и определен хорошо известными специалистам способами секвенирования аминокислотной последовательности, такими как деградация по Edman или масс-спектрометрия, как описано в статье Eiffert и соавт., Hoppe-Seyler's Z. Physiol Chem. 365:1489-1495 (1984). Среди различных вторичных карбоксильных концов, определенных с помощью событий вторичного расщепления, может быть идентифицирована карбокси-концевая аминокислота, которая прилегает к сайту расщепления.

Пептиды, которые соответствуют стволу pIgR выбранных видов, включают:
Мышиный: Glu-Arg-Glu-Ile-Gln-Asn-Val-Arg-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala-Ser- Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Gln-Ser-Arg-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys(SEQ ID No 2)
Крысиный: Glu-Arg-Glu-Ile-Gln-Asn-Ala-Gly-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala-Ser- Gly-Asn-Ala-Gly-Ser-Ala-Gly-Gly-Gln-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys (SEQ ID No 3)
Человеческий: Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser -Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg (SEQ ID No 4)
Бычий: Glu-Ser-Val-Lys-Asp-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Pro-Ala-Asp-Pro-Gly-Arg-Pro -Thr-Gly-Tyr-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys (SEQ ID No 5)
Кроличий: Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Val-Gln-Ser-Ala-Glu-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser -Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg-Ser-Lys (SEQ ID No 6).

Клетки, экспрессирующие pIgR
Несмотря на то, что данное изобретение в широком плане касается эукариотных клеток, pIgR-экспрессирующие клетки, соответствующие данному изобретению, предпочтительно являются клетками млекопитающих и более предпочтительно эпителиальными клетками млекопитающих, которые в норме секретируют IgA. Клетки млекопитающих могут быть трансфицированы нуклеиновой кислотой, кодирующей pIgR, выделенный, синтезированный или полученный иным образом из одного или более желаемых видов. Способы трансфекции и экспрессии генов в клетках млекопитающих известны в уровне техники. Трансдукция данных клеток вирусными векторами может включать, например, инкубирование вирусов с клетками из круга хозяев вирусов в условиях и концентрациях, которые необходимы для того, чтобы вызвать инфекцию. См., например, руководства Methods in Enzymology, том 185, Academic Press, Inc. San Diego, CA (под ред. D.V.Goeddel) (1990) или М. Krieger, Gene Transfer and Expression - A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, NY (1990) и цитированные здесь ссылки.

Культура клеток, которая может быть использована в данном изобретении, включающая клеточные линии и культивируемые клетки из образцов ткани или крови, хорошо известна в уровне техники. Руководство Freshney (Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3-е издание, Wiley-Liss, New York (1994)) и приведенные здесь ссылки дают основные указания для культивирования клеток. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие pIgR из желаемого вида, могут быть экспрессированы в ряде эукариотных клеток-хозяев, включая дрожжи и различные клетки высших эукариот, такие как клеточные линии COS, CHO и HeLa и клеточные линии миеломы, а также MDCK и клетки, выделенные из карциномы толстой кишки человека, такие как Сасо2. Ген рекомбинантного белка будет функционально связан с подходящими для каждого хозяина последовательностями контроля экспрессии. Для эукариотных клеток последовательности контроля будут включать промотор и предпочтительно энхансер, выделенные, например, из генов иммуноглобулина, SV40, цитомегаловируса и т.п., и последовательность полиаденилирования, а также могут включать донорную и акцепторную сплайс-последовательности.

Связывание лигандов со стволом
Специфический ствол-связывающий лиганд не является решающим для данного изобретения и могут быть использованы различные лиганды. Большинство способов конструирования и селекции лигандов, таких как нуклеиновые кислоты, белки или пептиды (обозначаемые общим термином "пептиды"), или антитела, или маленькие органические или неорганические молекулы (например, Патент США No 5143854; WO 90/15070; WO 92/10092; WO 96/11878) с желательными характеристиками специфического связывания хорошо известны в уровне техники. Предпочтительно лиганды, соответствующие данному изобретению, будут в физиологических условиях связывать ствол, практически не связывая секреторный компонент pIgR. Более предпочтительно, когда лиганды, соответствующие данному изобретению, специфически связывают только ствол в физиологических условиях. Обычно физиологические условия для разных тканей различны. Однако примером физиологических условий являются условия, встречающиеся в желудочно-кишечном тракте или дыхательных путях млекопитающих, включая, но не ограничиваясь человеком. Для связывания с экстрацеллюларным лиганд-связывающим сайтом ("эпитопом"), содержащимся в первых 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30 или 33 проксимальных мембране аминокислотах ствола, может быть выбран любой лиганд.

Для использования в качестве лигандов в данном изобретении могут быть сконструированы антитела, включая поликлональные, моноклональные или рекомбинантные антитела Fv из одной цепи. Способы получения поликлональных и моноклональных антител известны специалистам. См., например, публикации Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY и Harlow и Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stites и соавт. Basic and Clinical Immunology (4-е изд.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, а также приведенные в контексте изобретения ссылки; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2-е изд.) Academic Press, New York, NY и Kohler и Milstein (1975) Nature 256:495-497; см. Huse и соавт. (1989) Science 246:1275-1281 и Ward и соавт. (1989) Nature 341: 544-546; Birch и Lennox, Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, New York, New York (1995).

Другие подходящие способы получения лигандов в виде антител или пептидов включают селекцию библиотек рекомбинантных антител/пептидов в фаговых или подобных им векторах. Высокоаффинные в отношении ствола антитела или пептиды могут быть быстро выделены с использованием способов фагового воспроизведения для экспрессии рекомбинантных фрагментов Fv из одной цепи (scFv) или пептидных лигандов на поверхности фага. Вкратце, гены, кодирующие поверхностный белок фага, изменяют таким образом, чтобы это позволило провести инсерцию гена антитела или пептида, который экспрессируется в виде слитого белка на поверхности фага, несущего этот ген. Возможно селективное обогащение фага, экспрессирующего желаемое антитело или пептидный лиганд, и его выделение с использованием аффинности/авидности в отношении ствола. ДНК, кодирующую лиганд, упаковывают в этот же фаг, что позволяет выделить ген, кодирующий лиганд. Ряд подобных способов подробно описан в литературе и хорошо известен специалистам. См., например, статьи Winter и соавт. Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994); Marks и соавт. J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Vaughan и соавт. Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996), Патенты США No 4642334, 4816397, 4816567, 4704692, WO 86/01533; WO 88/09344, WO 89/00999, WO 90/02809; WO 90/04036, ЕР 0324162, ЕР 0239400.

В химическом синтезе пептидов способ, называемый "Разделение, Связывание и Рекомбинация" ("Divide, Couple and Recombine" (DCR)) был использован для получения комбинаторных пептидных библиотек. См. статьи Furka и соавт. Int. J. Pept. Protein Res. 37: 487-493 (1991) и Houghten и соавт. Nature 354: 84-86 (1991). В качестве альтернативы DCR пептидные смеси также готовили прямым связыванием мономерных смесей. См. Патент США Rutter и соавт. No 5010175. Было предложено применение данных способов для приготовления смесей других линейных полимеров, таких как "пептоиды". См. публикацию Simon и соавт. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371 (1991). При синтезе олигонуклеотидов "дегенерированные" или "неустойчивые" смеси олигонуклеотидных продуктов могут быть получены, например, путем подачи эквимолярных смесей мономеров на определенных стадиях синтеза к олигонуклеотидному полимеру. См. работу Atkinson и Smith в "Oligonucleotide Synthesis. A Practical Approach", 1984, IRL Press, Oxford, под ред. М. Gait, с. 35-81. Данные способы синтеза пептидов или олигонуклеотидов представляют значительное число соединений для тестирования, которые легко могут быть идентифицированы, если они являются активными.

Предпочтительным будет конструирование лигандов с целью снижения иммуногенности у хозяина, например, путем максимального увеличения числа аутологичных (собственных) последовательностей в лиганде. Соответственно химерные антитела, имеющие нексеногенные вариабельные участки, являются предпочтительными. Особенно предпочтительно применение антител, у которых ксеногенные участки отсутствуют или существенноограничены участками, определяющими комплементарность, как в гуманизированных антителах.

Связывание и тестирование лигандов
Связывание (т.е. присоединение) лиганда к стволу pIgR может происходить перед или одновременно с расщеплением секреторного компонента, и лиганд может быть связан с базолатеральной или апикальной поверхностью. Таким образом, эндоцитоз лиганда может происходить базолатерально или апикально, или лиганд может быть объектом трансцитоза от апикальной к базолатеральной или от базолатеральной к апикальной поверхности. Судьба лиганда или какого-либо его элемента будет различной в зависимости от его физико-химических характеристик. Соответственно, свойства лиганда могут быть выбраны или сконструированы для реализации желаемой функции на поверхности клетки, в эндосоме или после трансцитоза. Например, варьируя чувствительность лиганда к средам, вызывающим протеолиз или восстановление, можно определять распределение связанного, интернализованного или транспортируемого через клетку лиганда. Если желательно, может быть создан лиганд, сохраняющий специфическое связывание с клеткой после присоединения или трансцитоза или, альтернативно, высвобождающийся в окружающую среду. Таким образом, свойства любого из различных элементов лиганда, включая связывающий компонент, биологически активный компонент или линкер, могут быть сконструированы или выбраны с целью обеспечения различных степеней аффинности, стабильности или активности в отношении различных внутриклеточных отделов или поверхностей клетки так, как это желательно.

А. Тестирование связывания лиганда ex vivo
Для оценки связывания лиганда со стволом in vitro удобно измерять эндоцитоз или трансцитоз связанного лиганда в эпителиальных клетках млекопитающих. Термин "эндоцитоз" в основном относится к феномену поглощения материала клеткой, например, посредством фагоцитоза или пиноцитоза. Опосредованный рецепторами эндоцитоз представляет собой эффективное средство, побуждающее клетку поглотить материал, который связывается с рецептором клеточной поверхности. См. работы Wu и Wu (1987) J.Biol.Chem. 262:4429-4432; Wagner и соавт. (1990) Proc. Natl. Sci. USA 87:3410-3414 и ЕР-А1 0388758. Для оценки связывания может быть использован любой из числа известных способов анализа эндоцитоза. Например, анализы связывания, трансцитоза и интернализации подробно описаны в статье Breitfeld и соавт. J. Cell Biol. 109:475-486 (1989).

Апикальный эндоцитоз удобно измерять по связыванию лиганда, такого как фрагмент Fab, со стволом на апикальной поверхности клеток почки собаки Madin-Darby (MDCK) при 4^oС, нагревании до 37^oС на короткое время (0-10 мин) и охлаждении клеток снова до 4^oС. Способы экспрессии pIgR в клетках MDCK известны в уровне техники (статья Breitfeld и соавт. Methods in Cell Biology 32: 329-337 (1989)). Оставшиеся на поверхности Fab удаляют, разрушая их при рН 2,3. Внутриклеточными Fab являются Fab, которые сохраняют ассоциацию с клетками после разрушения, тогда как связанными с поверхностью Fab являются Fab, которые удаляются путем кислотного промывания. Контроли для неспецифического связывания включают использование преиммунного Fab и/или клеток MDCK, не трансфицированных pIgR.

Трансцитоз можно легко оценить, позволяя клеткам MDCK связывать Fab на апикальной поверхности при 4^oС, нагревая их до 37^oС на 0-240 мин и определяя затем количество Fab, доставленного в базолатеральную среду. Данные базолатерально доставленные Fab сравнивают с суммой Fab, которые сохраняют ассоциацию с клетками (внутриклеточную или разрушенную кислотой), и Fab, выходящих обратно в апикальную среду. Альтернативно, трансцитоз может быть оценен с помощью непрерывной обработки клеток Fab в апикальной среде и измерения накопления Fab в базолатеральной среде. Данный способ исключает стадию охлаждения клеток, но не обеспечивает кинетику транспорта одной группы лиганда. В обоих способах деградация Fab может быть оценена путем анализа подвергнутых трансцитозу Fab с помощью SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия) и использования зондирования противокуриных антител в вестерн-блоттинге. Неспецифический транспорт (например, обусловленный жидкофазным эндоцитозом и трансцитозом или парацеллюларным просачиванием между клетками) может контролироваться посредством использования клеток MDCK, не трансфицированных pIgR и/или преиммуным Fab.

В. Тестирование связывания лиганда in vivo
Для оценки трансцитоза in vivo удобно использовать не содержащих патогены экспериментальных животных, таких как крысы Sprague-Dawley. Меченый лиганд (например, антитело, меченное радиоактивным иодом) может быть введен в ноздри. Как будет понятно специалистам, "метка" является композицией, определяемой спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электромагнитными, радиохимическими или химическими средствами, такими как флуоресценция, хемофлуоресценция или хемолюминесценция. Трансцитоз с апикальной к базальной поверхности может быть легко определен измерением доставки лиганда в систему кровообращения, что устанавливают по присутствию метки. Целостность лиганда, выделенного из кровотока, может быть оценена с помощью анализа лиганда электрофорезом в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия.

Биологически активный компонент
Биологически активный компонент лиганда может быть ковалентно или нековалентно связан с лигандом. Например, для связывания различных изотопов могут быть использованы хелаторы, или нуклеиновые кислоты могут быть связаны с лигандом водородными связями. Биологически активные компоненты могут также находиться в эмульсиях, протеиноидах или липосомах. Специалистам будет ясно, что такие структуры могут быть ковалентно связаны с лигандом посредством дериватизированных полярных головных групп или целых белков мембраны. Связывающие компоненты лиганда могут также содержать биологически активный компонент.

Биологически активные компоненты содержат любое число соединений, известных специалистам как противовоспалительные агенты, цитокины, антиинфекционные агенты, активаторы или ингибиторы ферментов, аллостерические модификаторы или антибиотики. Таким образом, биологически активный компонент включает такие соединения, как нуклеиновые кислоты, белки, пептиды, аминокислоты или производные, гликопротеины, радиоактивные изотопы, липиды, углеводороды или рекомбинантные вирусы. Термин "нуклеиновая кислота" означает дезоксирибонуклеотидный или рибонуклеотидный полимер в однонитевой или двунитевой форме и до тех пор, пока не ограничено иным образом, охватывает известные аналоги природных нуклеотидов. Нуклеиновые кислоты включают антисмысловые нуклеиновые кислоты, дериватизированные олигонуклеотиды для ковалентного перекрестного связывания с однонитевой или двунитевой ДНК, образующие триплекс олигонуклеотиды или нуклеиновые кислоты, кодирующие белки или пептиды. Нуклеиновые кислоты также включают композиции для генотерапии, такие как нуклеиновые кислоты, кодирующие муковисцидозный регулятор трансмембранной проводимости дикого типа.

Присоединение биологически активных композиций к лиганду
Способ присоединения биологически активного компонента к лиганду будет меняться в соответствии с химической структурой компонента. В основном лиганды будут содержать ряд функциональных групп, которые доступны для реакции с подходящей функциональной группой на биологически активной молекуле для связывания посредством нее агента. Альтернативно лиганд и/или биологически активный компонент могут быть дериватизированы таким образом, что они имеют или присоединяют дополнительные реактивные функциональные группы. Дериватизация может включать присоединение любой из числа линкерных молекул, таких какие поставляются Pierce Chemical Company, Rockford Illinois. Термин "линкер" в контексте заявки относится к молекуле, используемой для ковалентного или нековалентного связывания лиганда и биологически активного компонента. Подходящие линкеры хорошо известны специалистам и включают, но не ограничиваются линкерами с разветвленной или неразветвленной углеродной цепью, гетероциклическими углеводородными линкерами или пептидными линкерами. См. , например, монографию Birch и Lennox, Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, глава 4, Wiley-Liss, New York, New York (1995); Патенты США No 5218112, 5090914; руководство Hermanson Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA (1996).

В случае, когда обе молекулы являются полипептидами, линкеры могут быть связаны с составляющими их аминокислотами посредством боковых групп (например, дисульфидными связями с цистеином). Для получения желаемого конъюгата может быть использован бифункциональный линкер, имеющий одну группу, реактивную с группой определенного биологически активного компонента, и другую группу, реактивную с лигандом. Альтернативно дериватизация может включать химическую обработку компонента, например гликолевое расщепление сахарной структуры гликопротеинового антитела периодатом с образованием свободных альдегидных групп. Свободные альдегидные группы антитела могут реагировать со свободными аминными или гидразиновыми группами агента, связывая таким образом агент (См. Патент США No 4671958). Способы получения свободных сульфгидрильных групп на антителах или фрагментах антител хорошо известны (См. Патент США No 4659839). Известно множество способов и линкерных молекул для присоединения различных соединений, включая хелаты радионуклидных металлов, токсины и лекарственные вещества, к белкам, таким как антитела. См., например, Европейскую Патентную заявку No 188256, Патенты США No 4671958, 4659839,4414148, 4699784, 4680338, 4569789 и 4589071 и статью Borlinghaus и соавт., Cancer Res. 47:4071-4075 (1987)).

В некоторых случаях является желательным высвобождение конъюгированной молекулы, когда она доходит до участка-мишени. Вследствие этого могут быть использованы конъюгаты, содержащие связи, которые расщепляются вблизи участка-мишени. Расщепление связи для высвобождения биологически активного компонента из антитела может быть обусловлено активностью ферментов или условиями, воздействию которых подвергается конъюгат либо внутри клетки-мишени, либо вблизи участка-мишени. Когда участок-мишень является опухолью, может быть использован линкер, который расщепляется в условиях, существующих в области опухоли (например, под воздействием ассоциированных с опухолью ферментов или кислого рН). Спейсер из цис-аконитовой кислоты используют для высвобождения биологически активных компонентов в эндосомах. Подобным образом дисульфидные связи расщепляются в восстановительной среде эндосом.

Специалистам известен ряд различных расщепляющихся линкеров. См. Патенты США No 4618492, 4545225 и 4625014. Механизмы высвобождения агентов из данных линкерных групп включают, например, облучение фотолабильной связи и катализируемый кислотой гидролиз. В Патенте США No 5141648 описаны иммуноконъюгаты, содержащие линкеры специфической химической структуры, в которых связь расщепляется in vivo, высвобождая таким образом связанное соединение (радиотерапевтический агент, лекарственное вещество, токсин и т.п.). Считают, что линкер, чувствительный к расщеплению при слабокислом рН, расщепляется при транспорте в цитоплазму клетки-мишени, высвобождая таким образом биологически активное соединение внутри клетки-мишени. Патент США No 4671958 включает описание иммуноконъюгатов, содержащих линкеры, которые расщепляются в области-мишени in vivo под действием протеолитических ферментов системы комплемента пациента. В большом числе способов, которые были описаны для присоединения ряда радиодиагностических соединений, радиотерапевтических соединений, лекарственных веществ, токсинов и других компонентов к лигандам, специалист способен определить подходящий способ для присоединения данного компонента к лиганду, соответствующему данному изобретению.

Выход лиганда из эндосомы
Ряд способов, хорошо известных специалистам, может быть использован для транспорта лиганда или какой-либо его части из эндосомы.

Для эффективной трансфекции может быть использован комплекс поли-L-лизин/нуклеиновая кислота, связанный слигандом, который специфически присоединяется к стволу (см. статьи Fercol и соавт., J. Clin. Invest., 92:2394-2400 (1993) и J. Clin. Invest., 95:493-502 (1995).

При другом подходе поли-L-лизин может быть связан путем генетического слияния или химическими линкерами с лигандом, который специфически взаимодействует со стволом pIgR. В свою очередь данный комплекс может быть связан с дефектным аденовирусом. Curiel и соавт. продемонстрировали, что "обнаженная" (депротеинизированнная) ДНК, электростатически связанная с поли-L-лизином или поли-L-лизин-трансферрином, которые были связаны с дефектными мутантами аденовируса, может быть доставлена в клетки при эффективности трансфекции, приближающейся к 90%. Конъюгат аденовирус-поли-L-лизин-ДНК связывает нормальный аденовирусный рецептор и затем интернализуется посредством обусловленного рецептором эндоцитоза. Данный подход был использован для получения не менее чем 1000-кратного повышения экспрессии генотерапевтических векторов. Подобными свойствами обладают вирусы герпеса. См. работы Curiel и соавт. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8850-8854; Gotten и соавт. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6094-6098; Curiel и соавт. (1992) Hum. Gene Ther. 3:147-154; Wagner и соавт. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6099-6103; Michael и соавт. (1993) J. Biol. Chem. 268:6866-6869; Curiel и соавт. (1992) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 6:247-252, а также Harris и соавт. (1993)Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9:441-447; Gao и соавт. (1993) Hum. Gene Ther. 4:17-24; Curiel и соавт. Патентная заявка США SN 07/768039.

В еще одном подходе с использованием вируса гриппа гидрофобный пептид в гемагглютинине может действовать как слитый пептид при низком рН, вызывая слияние вируса с мембраной эндосомы и доставляя вирус в цитоплазму. Данный пептид был использован в комплексах трансферрин/пептид/поли-L-лизин/ДНК для переноса генов с помощью трансферринового рецептора, и он значительно повышал эффективность экспрессии. См. статью Wagner и соавт. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7934-7938 (1992). Данный пептид может быть инженерными способами введен в лиганд с целью транспорта лиганда или его фрагмента из эндосомы.

Следующий подход предлагает использование рицина А. Цепь рицина А способна к выходу из эндосомы и в цитозоль. См. статью Beaumell и соавт. J. Biol. Chem. 268: 23661-23669 (1993). Лиганд, соответствующий данному изобретению, может быть связан с рицином А посредством генетического слияния и химическими линкерами.

Несмотря на то, что данное изобретение было детально описано посредством иллюстраций и примеров в целях ясности понимания, является очевидным, что определенные изменения и модификации могут быть реализованы в объеме прилагаемой формулы изобретения.

Пример 1
В примере 1 описывают способ получения и анализа куриных антител и фрагментов Fab, которые специфически присоединены к участку ствола pIgR кролика.

Соединяющий с мембраной сегмент pIgR кролика начинается с остатка валина в положении 630. Последовательность из двадцати четырех экстрацеллюларных остатков pIgR кролика, которая находится перед связывающимся с мембраной сегментом, является следующей: 607-AspProAlaSerGlySerArgAlaSerValAspAlaSerSerAlaSerGlyGlnSerGlySerAlaLys-629 (SEQ ID No 7).

Синтезировано два пептида (Immuno-Dynamics, Inc. , La Jolla, CA), представляющих экстрацеллюларные проксимальные мембране фрагменты из 16 и 23 аминокислот pIgR. С-концевой цистеин добавляют для конъюгации. Пептидные последовательности (в однобуквенном коде) являются следующими: DPA SGS RAS VDA SSA SGQ SGS AKC (SEQ ID No 8) для первичного пептида и для пептида, представленного субпоследовательностью: ASV DAS SAS GQS GSA КС (SEQ ID No 9). Половину каждого образца пептида конъюгируют с гемоцианином из морского моллюска-блюдечка (keyhole limpet семейства Fissurellidae) KLH (выпускаемого фирмой Immuno-Dynamics, Inc.).

KLH-конъюгированные пептиды посылают в Lampire Biological Laboratories (Pipersville, PA) для получения куриных антител от двух кур на каждый пептид. После иммунизации кур по стандартной методике проводят сбор преиммунных яиц и отбор преиммунной крови для анализа; внутримышечную инъекцию 2 мг пептида с суспензией полного адъюванта Freund при проектной стимуляции, внутримышечную инъекцию 0,5 мг пептида с неполной суспензией Freund на неделе 1; внутримышечную инъекцию 0,25 мг пептида с неполной суспензией Freund на неделе 2; перерыв на неделе 3; внутримышечную инъекцию 0,25 мг пептида с неполной суспензией Freund на неделе 4; перерыв на неделе 5 и отбор крови на анализ на неделе 6. Ежедневный сбор яиц начинают приблизительно на неделе 6 и ежемесячно отбирают кровь на анализ. Яйца доставляют ежемесячно.

При получении желтки яиц тщательно отделяют от белков и хранят при 4^oС в 50-80 мл основного буфера (0,01 М фосфата натрия, рН 7,5, 0,1 М NaCl, 0,01% азида) на яичный желток до обработки с целью экстракции куриного антитела ("IgY"). IgY экстрагируют из партий хранящихся яичных
желтков путем серии осаждений с использованием PEG (полиэтиленгликоля) с последующей серией осаждений сульфатом аммония в соответствии со способом Polson и соавт., описанном в журнале Immunol. Commun. 9:475 (1980)). В нескольких словах, твердый PEG (полиэтиленгликоль мол. массы 8000) добавляют к желткам в основном буфере до 3,5 мас.% PEG на объем разведенного желтка и перемешивают при комнатной температуре до растворения. Раствор центрифугируют при 14000 g в течение 10 мин при 20^oС и декантируют через воронку, содержащую незакрепленный слой хлопковой марли в качестве абсорбента. EG в большем количестве добавляют к прозрачному фильтрату для получения конечной концентрации PEG 12% с целью осаждения IgY. После седиментации осадка центрифугированием при 14000 g в течение 10 мин при 20^oС осадок растворяют в 60 мл основного буфера/желток и добавляют равный объем 24% PEG в основном буфере с целью улучшения осадка. Осадок еще два раза центрифугируют при 14000 g в течение 10 мин при 20^oС для полного удаления остаточного раствора PEG. Осадки растворяют в 30 мл основного буфера/яичный желток и осаждают белок в 50% насыщенном (NH₄)₂SO₄ путем медленного добавления равного объема (NH₄)₂SO₄ и перемешивания в течение ночи при 4^oС. Осадок центрифугируют при 14000 g в течение 10 мин при 4^oС и полученный осадок промывают равным объемом холодного 50%-ного раствора (NH₄)₂SO₄. Осадок снова центрифугируют при 14000 g в течение 10 мин при 4^oС, растворяют в PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) без кальция или магния, рН 7,5 и экстенсивно диализуют в PBS для полного удаления (NH₄)₂SO₄. Чистоту препарата IgY подтверждают с помощью SDS-PAGE (приблизительно 90-95%), а количество IgY определяют измерением поглощения при 280 нм с использованием коэффициента экстинкции 1,3.

Аффинную очистку IgY цыплят, которым инъецирован первичный пептид SEQ ID No 8, выполняют посредством первого ковалентного связывания пептида со связывающим гелем SULFOLINK (Pierce Chemical Company), который обеспечивает специфическое связывание с сульфгидрильными группами, такими как на С-концевом цистеине пептида. В соответствии с инструкциями изготовителя готовят колонку объемом 3 мл с 3 мг пептида. Вкратце, колонку объемом 3 мл уравновешивают 6 объемами колонки (далее: объемами) 50 мМ Трис, 5 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), рН 8,5, а затем наносят на колонку 3 мг первичного пептида SEQ ID No 8 в 3 мл 50 мМ Трис, 5 мМ EDTA, рН 8,5 для перемешивания при комнатной температуре в течение 15 мин. Гель колонки и пептид инкубируют еще в течение 30 мин без перемешивания. Буфер пептида удаляют из геля и сохраняют для последующего тестирования с целью подтверждения эффективности связывания с использованием реагента Ellman (DTNB (5-5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота) Pierce Chemical Company), который определяет сульфгидрильные группы. Первичный пептид SEQ ID No 8 не содержит никакие ароматические группы и не может быть определен спектрофотометрически или стандартными способами анализа белка, такими как способ анализа по Bradford. Использование реагента Ellman в соответствии с инструкциями изготовителя с целью сравнения аликвоты раствора пептида перед и после связывания геля подтверждает 100% эффективность связывания. Колонку с гелем промывают 3 объемами 50 мМ Трис, 5 мМ EDTA, pH 8,5 перед блокированием участков неспецифического связывания с использованием 3 мл раствора цистеина в 50 мМ Трис, 5 мМ EDTA, pH 8,5 путем перемешивания в течение 15 мин при комнатной температуре с последующим выдерживанием в течение 30 мин, без перемешивания. Колонку осушают и промывают 16 объемами 1 М NaCl, a затем 16 объемами дегазированного 0,05% азида натрия.

IgY получают аффинной очисткой на данном связанном с пептидом геле SULFOLINK в соответствии с модифицированным вариантом способа Rosol и соавт. (Veterinary Immunology and Immunopathology, 35:321-337, 1993). Колонку при комнатной температуре промывают 10 объемами PBS. IgY рециркулируют на колонке в течение 2 часов. Затем колонку промывают 10 объемами PBS и 10 объемами забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) с 0,5 М NaCI. Пептид-специфический IgY элюируют 500 мМ глицина при pH 2,5 и нейтрализуют 1 М Трис, pH 9,5. УФ-спектрофотометр и графическое устройство используют при промывании и элюции белка с колонки. Образцы, имеющие сигнал при OD (оптической плотности) 280 нм, концентрируют в устройстве centriprep 30 (Amicon) до объема 500-600 мкл.

Фрагменты Fab ("фрагменты Yab") готовят из полученного аффинной очисткой IgY, инкубированного с иммобилизованным пепсином (Pierce Chemical Company) в соответствии с инструкциями изготовителя и модифицированным способом Akita и Nakai (Journal of Immunological Methods. 162:155-164, 1993). Пепсиновую массу дважды промывают 16 объемами 50 мМ буфера на основе ацетата натрия pH 4,2 и ресуспендируют в двух объемах буфера на основе ацетата натрия. Полученный аффинной очисткой IgY инкубируют с иммобилизованным пепсином при 37=ВОС и перемешивают в течение 5 час. Одномолярный Трис-НС рН 8,0 добавляют до получения конечного рН 7,5. Пепсиновую смесь центрифугируют при 1000 g в течение 5 мин и супернатант, содержащий фрагменты, наносят на фильтр CENTRICON 10 (Amicon) с целью удаления маленьких фрагментов Fc. Полноту расщепления подтверждают с помощью SDS-PAGE.

Куриную сыворотку из положительных анализов крови и IgY, экстрагированный из партий объединенных яичных желтков, анализируют с помощью ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) с целью подтверждения распознавания пептида. Полученные аффинной очисткой IgY и фрагменты Fab'(''Yab'') тестируют на способность распознавать интактный pIgR с помощью вестерн-блоттинга. Клеточные лизаты готовят из клеток почки собаки Madin-Darby (MDCK) и клетки MDCK трансфицируют pIgR кролика ("pWe") в соответствии со способом, описанным Breitfeld и соавт. (Methods in Cell Biology 32:329-337 (1989)), используя 10% лизирующий буфер NP40, содержащий 1 мкг/мл ингибиторов протеазы и фторид фенилметилсульфонила (PMSF). Лизаты клеток прогоняют на 10% геле в восстанавливающих условиях и переносят на мембрану PVDF (поливинилдифторид) (Millipore, Bedford, МА). Мышиное моноклональное антитело к цитоплазматическому участку pIgR, SC166 (см. статью Solari и соавт. Cell, 36:61-71 (1984)) используют в качестве антитела для положительного контроля, а IgY, выделенный из преиммунных желтков, используют в качестве отрицательного контроля. В качестве вторичных антител используют HRP-конъюгированный кроличий противокуриный IgY (Jackson Immunochemicals) и HRP-конъюгированный кроличий противомышиный (Biorad). IgY из кур, которым инъецируют первичный пептид, и IgY из кур, которым инъецируют пептид, представленный субпоследовательностью, распознают интактный pIgR, но IgY из одной из кур, которой инъецируют антитело в виде субпоследовательности, не распознают его. Исследования иммунофлуоресценции фрагментов IgY и Yab (из кур, которым инъецируют первичный пептид) с помощью клеток MDCK и pWe, выращенных на покровных стеклах, фиксированных 4% параформальдегидом и обработанных сапонином для проницаемости, показывают, что pIgR-трансфицированные клетки более специфически окрашиваются (FITC-конъюгированные антитела кролика против курицы и мыши, получаемые от Jackson Immunochemicals). ЕLISА для клеток (модификация способа M. Hahne и соавт., описанного в Journal of Cell Biology, 121:655-64, 1993) на фиксированных обработанных для проницаемости клетках показывает, что фрагмент Yab окрашивается в 5 раз сильнее с клетками pWE, чем с клетками MDCK. Данные результаты демонстрируют успешное получение поликлональных антител против пептида ствола pIgR кролика и распознавание ими интактного pIgR.

Пример 2
В примере 2 описывают селекцию фрагмента из одной цепи вариабельного участка человеческого рекомбинантного антитела (scFv) с помощью воспроизведения на фагах.

Для селекции scFv путем воспроизведения на фагах требуется растворимый биотинилированный антиген или антиген, иммобилизованный на твердом носителе. Поскольку scFv, отобранные с помощью воспроизведения на фагах, чаще являются низкоаффинными связывающими агентами и поскольку использование растворимого антигена может обеспечивать селекцию высокоаффинных scFv (статья R. Schier и соавт. J. Mol. Biol. 255:28-43, 1996), выбирают селекционный подход с использованием растворимого антигена. Первичный пептид ствола pIgR, описанный в Примере 1, который соответствует 23 аминокислотам проксимального мембране экстрацеллюларного участка pIgR кролика, конъюгируют с биотином через сульфгидрильную группу остатка цистеина, используя биотин-ВМСС ((1-биотинамидо-4-(4'[малеимидометил] циклогексан-карбоксамидо)бутан) Pierce Chemical Company, Rockford, IL) на основе способа, описанного в инструкции изготовителя. Для того, чтобы убедиться, что пептид не димеризуется по сульфгидрильным группам, его сначала восстанавливают 1% борогидридом натрия в 0,1 М Трис, 5 мМ EDTA, рН 8,0. рН раствора снижают до 5,0 добавлением 1 н. HCl. Когда заканчивается шипение раствора, добавляют 1 М Трис до получения рН 7,0. 8,5 мМ раствор биотина-ВМСС готовят растворением биотинилированного реагента в ДМСО (диметилсульфоксид). К восстановленному пептиду добавляют биотин-ВМСС в 5-кратном избытке и инкубируют в течение ночи при 4^oС. Биотинилированный пептид отделяют от свободного биотина с помощью HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) на колонке С18 с градиентом CH₃CN, изменяющимся в диапазоне от 10 до 50%, в течение 30 мин с УФ-детекцией при 215 нм. Точный пик, соответствующий биотинилированному пептиду, идентифицируют масс-спектрометрией с использованием электроспрея и LSIMS (жидкостная вторичная ионная масс-спектрометрия).

Биотинилированный первичный пептид инкубируют с фаговой библиотекой, кодирующей большое число различных человеческих scFv (приблизительно 10¹⁰). Данную фаговую библиотеку готовят, как ранее описано в работах J.D. Marks и соавт. J. Mol. Biol. 222:581-97, 1991; J.D. Marks и соавт. Bio/Technology 10: 779-783, 1992; J.D. Marks и соавт. Bio/Technology 11:1145-1149, 1993; A. D.Griffits и соавт. ЕМВО J. 12:725-734, 1993). Общий процесс из четырех циклов селекции, накопления фагемида и экспансии в штамме-супрессоре TG-1 Eschericha coli проводят, как описывают Marks и соавт. (J. Mol. Biol. 222: 581-97, 1991) со следующими модификациями. Известно, что используемая фаговая библиотека содержит несколько агентов, связывающих стрептавидин, поэтому первые три цикла селекции включают стадию предварительной очистки, предусматривающую два инкубирования фага по 30 минут с агарозой с добавлением стрептавидина (Sigma). Затем фаг инкубируют с 5 мкг биотинилированного первичного пептида в течение 1 час. Для связывания биотинированного пептида с присоединенным фагом раствор пептида и фага инкубируют с авидиновыми магнитными частицами в первом и третьем циклах в течение 15 и 5 минут соответственно и со стрептавидиновыми магнитными частицами во втором и четвертом циклах в течение 10 и 5 минут соответственно. Накопленным фагом из четвертого цикла селекции инфицируют несупрессорный штамм НВ2151 Eschericha coli и индуцируют с помощью IPTG индивидуальные фагемидные клоны с целью образования растворимых фрагментов scFv, как описывают Marks и соавт. (J. Mol. Biol. 222:581-97 (1991)).

Бактериальные супернатанты из индивидуальных клонов анализируют в отношении экспрессии растворимых фрагментов scFv с помощью дот-блоттинга и в отношении связывания с биотинилированным первичным пептидом способом ELISA (см. статью Finnern и соавт. , Clin. Exp. Immunol., 102:566-574, 1995). Способ ELISA, однако, модифицируют следующим образом: 96-луночные планшеты для микротитрования (lmmulon-4) покрывают авидином (10 мкг/мл в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS)) в течение ночи при 4^oС, трижды промывают в PBS, блокируют 2% молоком в PBS и связывают с биотинилированным первичным пептидом (5 мкг/мл в PBS). Раствор ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидина) (Kirkegaard и Perry) используют в качестве субстрата (100 мкл/лунку) и реакцию останавливают добавлением 0,18 М H₂SO₄ перед определением цветной реакции с использованием устройства для чтения планшетов ELISA при длине волны 450 нм. Дот-блоттинг показывает, что 66% из 96 выбранных колоний НВ2151 инфицированных фагом, накопленным в четвертом цикле селекции, продуцируют scFv. Способ ELISA показывает, что 43 из 96 колоний продуцируют scFv, который связывает пептид.

Различия всех положительных клонов устанавливают ПЦР(полимеразная цепная реакция)-скринингом. Вставку scFv в тяжелой и легкой цепи сначала амплифицируют с использованием праймеров LMB3 и fd-Seq1 (см. статью Marks и соавт., J. Mol. Biol. 222: 581-97 (1991)), а затем расщепляют рестриктазой BstN1. Клоны с различными образцами фингерпринтов ДНК секвенируют, используя набор для циклического секвенирования SequiTherm Long-Read (Epicentre Technologies) и аппарат Licor. Идентифицируют пять уникальных последовательностей.

Для получения больших количеств очищенного scFv для дальнейшей характеризации и применения пять уникальных scFv субклонируют в экспрессионный вектор pUC119 Sfi-NotmycHis, который вводит гексагистидиновую метку в С-конец scFv (см. работу Schier и соавт. J. Mol. Biol. 255:28-43, 1996).

Пример 3
В Примере 3 описывают направленную доставку гена муковисцидозного регулятора транспроводимости (CFTR) дикого типа в клетки млекопитающего, экспрессирующие pIgR, с использованием ряда способов, описанных в работах Fercol и соавт. , J. Clin. Invest. 92:2394-2400 (1993) и Fercol и соавт., J. Clin. Invest. 95:493-502 (1995), каждая из которых введена в заявку в виде ссылки.

Фрагмент Fab, реактивный по отношению к участку ствола pIgR, получают и очищают способами, описанными в Примере 1. Fab связывают с поли(L-лизином) (мол. масса 20000 Да), используя гетеробифункциональный перекрестно сшивающий реагент N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) в соответствии со способом, описанным в работе Fercol и соавт. (1993).

Плазмиду, содержащую ген CFTR, лигируют с ранним промотором цитомегаловируса и вводят в вектор рСВ6 (см. статью Thomas и соавт., J. Biol. Chem., 268: 3313-3320 (1993)). Комплексы Fab-полилизин-ДНК готовят путем смешивания плазмидной ДНК с Fab-полилизином в 3М NaCl.

Комплекс вводят, растворяя его в 0,1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора и помещая в ноздри не содержащих патоген крыс Sprague-Dawley (250-300 г), находящихся под слабым ингаляционным наркозом с помощью Metofane дыхательной анестезии. Микропипеткой вносят 100 мкл плазмиды в PBS непосредственно в ноздри крыс, которых вручную удерживают в положении на спине. Крыс удерживают в данном положении, пока они не вдохнут раствор. Данный способ, как показывают, эффективен для нанесения образца на слизистую оболочку носа. См. работы Shahin и соавт. Infection and Immunity 60:1482-1488 (1992); Gizurarson и соавт., Vaccine 10:101-106 (1992). Транскрипцию трансфицированного гена оценивают с помощью иммунофлуоресцентного анализа образования белка CFTR.

Пример 4
В Примере 4 описывают средства направленной доставки in vivo экзогенных белков в клетки, экспрессирующие pIgR.

В эффективном способе, обеспечивающем выход белков из эндосом, используют комплекс белок-Fab, связанный с аденовирусом. Данный способ используют с рядом рецепторных систем, получая в результате не менее чем 1000-кратное повышение экспрессии. См. статьи Curiel и соавт. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 6: 247-252 (1992); Curiel и соавт. Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8850-8854 (1991); Gao и соавт. Hum. Gene Ther. 4:17-24 (1993), каждая из которых включена в данную заявку в виде ссылки. Связывание выполняют путем биотинилирования аденовируса и Fab/полилизина с последующим перекрестным сшиванием с авидином. Полученный комплекс вводят, как описывают в Примере 3.

Пример 5
В примере 5 описывают трансцитоз антител, которые специфически связываются со стволом, от апикальной к базолатеральной мембране клетки MDCK (почки собаки Madin Darby), содержащей pIgR.

Фрагменты Yab, реактивные с pIgR, готовят, как описывают в Примере 1. В фрагменты Yab против ствола pIgR вводят радиоактивный иод способом с использованием монохлорида иода, предложенного Goldsein и соавт. (см. Meth. Enzymol. 96: 241-249, 1983). Радиоиодированный IgA используют в качестве контрольного лиганда. Радиоиодированные фрагменты Yab или IgA (10⁷ импульсов/мин в 100 мкл/лунку) добавляют на апикальную поверхность клеток MDCK или pWe, выращиваемых поляризованным образом в течение 4 дней на вкладышах для клеточных культур диаметром 12 мм с размером пор 0,4 мкм (Transwells, Costar). См. работу Breitfeld и соавт. в Methods in Cell Biology 32:329-337 (1989). Фрагменты Yab с радиоизотопной меткой добавляют к клеткам при предварительном инкубировании в течение 2 час с ингибитором протеазы леупептином (50 мкл/мл) или без него. Через 20 мин апикального поглощения при 37^oС несвязанный лиганд с радиоизотопной меткой быстро трижды промывают MEM (минимальная основная среда)/ВSА (бычий сывороточный альбумин) (одно промывание в течение 5 мин и два более коротких промывания). Апикальные и базолатеральные среды собирают и меняют в точках времени 7, 15, 30, 60 и 120 мин с целью количественного определения в счетчике γ-излучения (Beckman Instruments, Palo Alto, CA). Вкладыши для клеточных культур вырезают на 120-й минуте для количественного определения в счетчике γ-излучения и для вычисления общего исходного поглощения радиоактивности. Фоновое поглощение клетками MDCK вычитают из поглощения клетками pWe для подсчета специфического рециклинга и трансцитоза лигандов с радиоизотопной меткой. Результаты показывают, что 13-18% фрагментов Yab подвергаются трансцитозу с апикальной на базолатеральную поверхность клеток, предварительно обработанных леупептином, в противоположность 5-6% IgA.

Все публикации и патенты, упоминаемые в данном описании, включены в описание в виде ссылки в той же мере, как если бы для каждой отдельной публикации или патента было специально и индивидуально указано, что они включены здесь в виде ссылки.

Список последовательностей приведен в конце описания.

Изобретение относится к биотехнологии и касается лиганда и способов специфического его связывания со стволом рецептора полимерного иммуноглобулина (pIgR) клетки при условии, что лиганд практически не связывает секреторный компонент pIgR в физиологических условиях. Лиганд может быть направлен на клетку, в клетку или для прохождения через нее и может содержать биологически активные вещества. Данное изобретение может быть использовано для транспорта терапевтических и диагностических композиций на эпителиальные клетки слизистых оболочек, внутрь данных клеток или через них. 3 с. и 25 з. п. ф-лы.

1. Лиганд, специфически связывающий ствол рецептора полимерного иммуноглобулина (pIgR) клетки, отличающийся тем, что он представляет собой антитело, выбранное из группы, включающей моноклональные, поликлональные, химерные, гетероконъюгированные антитела на основе Ig, рекомбинантные фрагменты Fv из одной цепи и антигенсвязывающие формы антител, практически не связывающее секреторный компонент pIgR в физиологических условиях. 2. Лиганд по п. 1, отличающийся тем, что он является гуманизированным антителом. 3. Лиганд по п.1, отличающийся тем, что он является рекомбинантным фрагментом вариабельного участка одной цепи антитела. 4. Лиганд по п.1, отличающийся тем, что он связывает экстрацеллюларный эпитоп на участке из первых 33 аминокислот, которые являются проксимальными в клеточной мембране относительно участка расщепления рецептора. 5. Лиганд по п.1, отличающийся тем, что он связывает пептид, выбранный из группы:
Мышиный: Glu-Arg-Glu-lle-Gln-Asn-Val-Arg-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala-Ser-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Gln-Ser-Arg-Ser-Ser-Ser-Ser--Lys (SEQ ID No 2)
Крысиный: Glu-Arg-Glu-lle-Gln-Asn-Ala-Gly-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala-Ser-Gly-Asn-Ala-Gly-Ser-Ala-Gly-Gly-Gln-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys(SEQ ID No 3)
Человеческий: Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg (SEQ ID No 4)
Бычий: Glu-Ser-Val-Lys-Asp-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Pro-Ala-Asp-Pro-Gly-Arg-Pro-Thr-Gly-Tyr-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys (SEQ ID No 5)
Кроличий: Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Val-Gln-Ser-Ala-Glu-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg-Ser-Lys (SEQ ID No 6). 6. Лиганд по п.1, отличающийся тем, что он имеет связывающий компонент для селективного связывания со стволом рецептора и биологически активный компонент, причем биологически активный компонент выбран из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты, белка, радиоизотопа, липидов и углеводов. 7. Лиганд по п. 6, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота кодирует муковисцидозный регулятор трансмембранной проводимости дикого типа. 8. Лиганд по п.1, отличающийся тем, что он имеет связывающий компонент для селективного связывания со стволом рецептора и биологически активный компонент, причем биологически активный компонент выбран из группы, состоящей из противовоспалительных агентов, антисмысловых олигонуклеотидов, антибиотиков и противоинфекционных агентов. 9. Лиганд по п.1, отличающийся тем, что он специфически связывает только ствол. 10. Лиганд по п.1, отличающийся тем, что он связывает пептид, имеющий последовательность Ala-Asp-Ala-Ala-Pro-Asp-Glu-Lys-Val-Leu-Asp-Ser-Gly-Phe-Arg-Glu-lle-Glu-Asn-Lys-Ala-lle-Gln-Asp-Pro-Arg-Leu-Phe-Ala-Glu-Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg (SEQ ID No 10). 11. Способ интродукции лиганда по п.1 в клетку, экспрессирующую рецептор полимерного иммуноглобулина, заключающийся в том, что присоединяют лиганд к стволу рецептора полимерного иммуноглобулина клетки, при условии, что лиганд практически не связывает секреторный компонент pIgR в физиологических условиях. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что в качестве лиганда выбирают антитело. 13. Способ по п.11, отличающийся тем, что в качестве лиганда выбирают гуманизированное антитело. 14. Способ по п.12, отличающийся тем, что лиганд является рекомбинантным фрагментом вариабельного участка одной цепи антитела. 15. Способ по п.11, отличающийся тем, что лиганд связывает экстрацеллюларный эпитоп на участке из первых 33 аминокислот, которые являются проксимальными в клеточной мембране относительно участка расщепления рецептора. 16. Способ по п.11, отличающийся тем, что лиганд связывает пептид, выбранный из группы:
Мышиный: Glu-Arg-Glu-lle-Gln-Asn-Val-Arg-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala-Ser-Gly-Asp-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Gln-Ser-Arg-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys (SEQ ID No 2)
Крысиный: Glu-Arg-Glu-lle-Gln-Asn-Ala-Gly-Asp-Gln-Ala-Gln-Glu-Asn-Arg-Ala-Ser-Gly-Asn-Ala-Gly-Ser-Ala-Gly-Gly-Gln-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys (SEQ ID No 3)
Человеческий: Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg (SEQ ID No 4)
Бычий: Glu-Ser-Val-Lys-Asp-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Pro-Ala-Asp-Pro-Gly-Arg-Pro-Thr-Gly-Tyr-Ser-Gly-Ser-Ser-Lys (SEQ ID No 5)
Кроличий: Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Val-Gln-Ser-Ala-Glu-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Asp-Pro-Ala-Ser-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg-Ser-Lys (SEQ ID No 6). 17. Способ по п.11, отличающийся тем, что в качестве лиганда выбирают лиганд, имеющий связывающий компонент для селективного связывания со стволом рецептора и биологически активный компонент, причем биологически активный компонент выбран из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты, белка, радиоизотопа, липида и углеводорода. 18. Способ по п.17, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота кодирует муковисцидозный регулятор трансмембранной проводимости дикого типа. 19. Способ по п. 11, отличающийся тем, что в качестве клетки выбирают клетку млекопитающего. 20. Способ по п.19, отличающийся тем, что клетка является эпителиальной клеткой. 21. Способ по п.11, отличающийся тем, что лиганд присоединяют к стволу на апикальной поверхности клетки. 22. Способ по п.21, отличающийся тем, что лиганд с помощью трансцитоза перемещают на базолатеральную поверхность клетки. 23. Способ по п.22, отличающийся тем, что лиганд высвобождают из ствола на базолатеральной поверхности клетки. 24. Способ по п.11, отличающийся тем, что лиганд присоединяют к стволу на базолатеральной поверхности клетки. 25. Способ по п.11, отличающийся тем, что лиганд специфически связывает только ствол. 26. Способ по п. 11, отличающийся тем, что лиганд связывает пептид, имеющий последовательность Ala-Asp-Ala-Ala-Pro-Asp-Glu-Lys-Val-Leu-Asp-Ser-Gly-Phe-Arg-Glu-lle-Glu-Asn-Lys-Ala-lle-Gln-Asp-Pro-Arg-Leu-Phe-Ala-Glu-Glu-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Thr-Arg-Asp-Gln-Ala-Asp-Gly-Ser-Arg-Ala-Ser-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-Ser-Glu-Glu-Gln-Gly-Gly-Ser-Ser-Arg (SEQ ID No 11). 27. Способ присоединения лиганда по п.1 к клетке, экспрессирующей рецептор полимерного иммуноглобулина, заключающийся в том, что лиганд связывают со стволом рецептора при условии, что лиганд практически не связывает секреторный компонент pIgR в физиологических условиях. 28. Способ по п.27, отличающийся тем, что после связывания лиганд проникает в клетку путем эндоцитоза.