СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 7-АДЦК ПУТЕМ ВОЗДЕЙСТВИЯ АКТИВНОСТИ ЭКСПАНДАЗЫ НА ПЕНИЦИЛЛИН G Российский патент 2002 года по МПК C12P35/00 

Область изобретения и предшествующий уровень техники
Настоящее изобретение относится к биосинтетическому способу получения и выделения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК).

β-Лактамные антибиотики представляют наиболее важную группу антибиотических соединений, имеющую длительную историю клинического использования. Среди этой группы известными антибиотиками являются пенициллины и цефалоспорины. Эти соединения естественным путем производят гифомицеты Penicillium chrysogenum и Acremonium chrysogenum, соответственно. В результате классических способов улучшения штамма за последнее десятилетие уровень производительности антибиотиков в Penicillium chrysogenum и Acremonium chrysogenum значительно увеличился. С ростом знаний о биосинтетических способах, приводящих к пенициллинам и цефалоспоринам, и с появлением технологии рекомбинантной ДНК стали доступными новые инструменты для улучшения производительности штаммов и получения производных этих соединений in vivo.

Большинство ферментов, включенных в биосинтез β-лактамов, идентифицированы и их соответствующие гены клонированы, как найдено в работах Инголиа и Квинер, Med. Res. Rev., 9 (1989), 245-264 (способ биосинтеза и ферменты) и Аронович, Коэн и Мартин, Ann. Rev. Microbiol., 46 (1992), 461-495 (клонирование гена).

Первые две стадии биосинтеза пенициллина в Р.chrysogenum заключаются в конденсации трех аминокислот, L-5-амино-5-карбоксипентановой кислоты (L-β-аминоадипиновой кислоты) (А), L-цистеина (С) и L-валина (V) в трипептид LLD-ACV и в последующей циклизации этого трипептида в изопенициллин N. Это соединение имеет типичную β-лактамную структуру.

Третья стадия включает обмен гидрофильной боковой цепи L-5-амино-5-карбоксипентановой кислоты на гидрофобную боковую цепь действием фермента ацилтрансферазы (AT). Реакция ферментативного обмена с участием AT протекает внутри органеллы, микротельца, как описано в ЕР-А-0448180.

Цефалоспорины являются значительно более дорогими, чем пенициллины. Одна из причин заключается в том, что некоторые цефалоспорины (например, цефалексин) получают из пенициллинов серией химических превращений. Другой причиной является то, что до сих пор только цефалоспорины с боковой цепью D-5-амино5-карбоксипентаноила могут быть ферментированы. Цефалоспорин С, несомненно наиболее важный исходный материал в этом отношении, хорошо растворяется в воде при любом рН, что означает, таким образом, применение длительных и дорогостоящих процессов выделения с использованием громоздкой и дорогой колоночной технологии. Цефалоспорин, полученный таким путем, должен быть превращен в терапевтически полезные цефалоспорины серией химических и ферментативных превращений.

В настоящее время способы получения полупродукта 7-АДЦК, предпочитаемые промышленностью, включают сложные химические стадии, приводящие к расширению и дериватизации пенициллина G. Одна из этих необходимых химических стадий получения 7-АДЦК включает увеличение 5-членной пенициллиновой кольцевой структуры до 6-членной цефалоспориновой кольцевой структуры (см., например, патент США 4 003 894). Этот сложный химический процесс является дорогим и вредным для окружающей среды.

Следовательно, существует большое желание заменить такие химические процессы ферментативными реакциями, такими как ферментативный катализ, предпочтительно во время ферментации. Ключом к замене химического способа расширения биологическим способом является центральный фермент в биологическом способе получения цефалоспорина - деацетоксицефалоспорин С-синтетаза или экспандаза.

Найдено, что фермент из бактерий Streptomyces clavuligerus осуществляет in vitro, в некоторых случаях, расширение кольца пенициллина (Болдуин и др., Tetrahedron, 43 (13), 3009 (1987). У Кантвела и др., (Current Genetics, 17, 213-221 (1990)) описана экспрессия S.clavuligerus в P.chrysogenum. Экспрессия экспандазы не приводит к образованию цефалоспоринов при ферментации, как предполагали в публикациях. Только если вводят Р.chrysogenum вместе с изопенициллин N-эпимеразой ген S.clavuligerus, наблюдалось превращение кольцевой структуры пенициллина N (его природный субстрат) в цефалоспориновую кольцевую структуру дезацетоксицефалоспорина С (его природный продукт), как описано Кантвелом и др., Proc. R. Soc. Lond. В., 248 (1992), 283-289. Фермент экспандаза описан (ЕР-А-0366354) биохимически и функционально, так как имеет свой соответствующий ген. Описаны как исследование физических карт гена cefE (EP-A-0341892), так и исследование цепи ДНК и превращений в P. chrysogenum, вызываемых cefE.

Другим источником фермента увеличения кольца является бактерия Nocardia lactamdurans (ранее Streptomyces lactamdurans). Описаны как биохимические свойства фермента, так и последовательность ДНК гена (Кортес и др., J.Gen. Microbiol. , 133 (1987), 3165-3174; и Кок и др., Mol. Gen. Genet., 236 (1993), 453-458, соответственно). Так как экспандаза катализирует увеличение 5-членного тиазолидинового кольца пенициллина N в 6-членное дигидротиазиновое кольцо деацетоксицефалоспорина С, то этот фермент, конечно, должен быть логическим кандидатом для замены стадий расширения кольца в химическом процессе. Однако фермент действует на промежуточный пенициллин N способа биосинтеза цефалоспорина, но не на легкодоступные недорогие пенициллины, такие как производимые P.chrysogenum, включая пенициллин G. Пенициллин N не доступен из торговой сети и даже если кольцо увеличено, его боковая цепь D-аминоадипила не может быть легко удалена пенициллинацилазами.

Недавно найдено, что фермент экспандаза способен увеличивать кольцо пенициллинов с определенными боковыми цепями до соответствующего производного 7-АДЦК. В ЕР-А-268343 описан процесс in vitro увеличения кольца пенициллина с 3-карбоксифенильной или адипоильной боковой цепью действием деацетоксицефалоспорин С-синтетазы. Кроме того, это свойство экспандазы использовали в технологии, как описано в ЕР-А-0532341, ЕР-А-0540210, WО 95/04148 и WО 95/04149. В этих сообщениях химическое превращение пенициллина G в 7-АДЦК было заменено превращением in vivo определенных производных 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК) в рекомбинантных штаммах Penicillium chrysogenum, содержащих ген экспандазы.

Более определенно, ЕР-А-0532341 сообщает о in vivo использовании фермента экспандазы в Р.chrysogenum в комбинации с 5-карбоксипентаноильной боковой цепью в качестве сырья, которое является субстратом для фермента ацилтрансферазы в P.chrysogenum. Это приводит к образованию 5-карбоксипентаноил-6-АПК, которая превращается ферментом экспандазой, введенной в штамм Р. chrysogenum, давая 5-карбоксипентаноил-7-АДЦК. Наконец, предлагается удаление 5-карбоксипентаноильной боковой цепи с образованием 7-АДЦК в качестве конечного продукта.

В WО 95/04148 и WО 95/04149 описано, что 3'-карбоксиметилтиопропионовая кислота и 3,3'-тиодипропионовая кислота, соответственно, как найдено, являются субстратами для экспандазы, давая 2-(карбоксиметилтио)ацетил- и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7-АДЦК.

Однако способ настоящего изобретения обеспечивает больше преимуществ вследствие высокой способности синтеза пенициллина G штаммами, производящими пенициллин, и более благоприятным способом извлечения фенилацетил-7-АДЦК. Кроме того, фенилацетильная боковая цепь пенициллина G весьма подвержена ферментативному расщеплению пенициллин G-амидазами, производимыми несколькими типами микроорганизмов, давая 6-АПК, например, сепаразой G, как описано в ЕР-А-0453047.

Многочисленные публикации сообщали, что экспандаза не воспринимает пенициллин G как субстрат для увеличения кольца (Болдуин и Абрахам (1988), Natural Product Reports, 5(2), р. 129-145; Маэда и др., (1995), Enzyme and Microbial Technology, 17, 231-234; Кроуфорд и др., (1995), Bio/Technology, 13, р. 58-61; Ву-Куанг Е. и др., в 50 лет Penicillin Application (редакторы Клейнкауф и Ван Дорен), 209 (1991), см. особенно таблицу 3А).

Сейчас найдено, что P. chrysogenum, производящие пенициллин G, трансформированный геном, кодирующим экспандазу, способны производить фенилацетилдезатоксицефалоспорановую кислоту.

Сущность изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает способ получения и выделения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК):
а) трансформацией штамма Penicilium chrysogenum геном экспандазы при регуляции сигналов транскрипции и трансляции экспрессии грибка;
б) ферментацией указанного штамма в культуральной среде и добавлением в эту культуральную среду фенилуксусной кислоты или ее соли, или эфира, пригодных чтобы получить пенициллин G, который способен к увеличению кольца с образованием 7-АДЦК;
в) выделением фенилацетил-7-АДЦК из ферментативного бульона;
г) деацетилированием фенилацетил-7-АДЦК; и
д) выделением кристаллической 7-АДЦК.

Предпочтительно, стадия д) является стадией фильтрования.

Предпочтительно, фенилацетил-7-АДЦК выделяют из ферментационного бульона экстракцией фильтрата бульона органическим растворителем, не смешивающимся с водой, при рН ниже, чем примерно 4,5, и обратной экстракцией органического раствора водой при рН между 4 и 10. Более того, предложен рекомбинантный вектор ДНК, содержащий ДНК, кодирующую экспандазу, функционально связанную с элементами регуляции транскрипции и трансляции гена гриба, например, геном gpdA Aspergillus nidulans и геном glcA Aspergillius niger, и клетками хозяина, трансформированными ими.

Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к применению функциональных конструкций генов в P.chrysogenum для in vivo увеличения структуры кольца пенициллина G, чтобы получить производное ключевого полупродукта в биосинтезе цефалоспорина, 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты или 7-АДЦК. Это производное имеет такой химический состав, чтобы можно было выполнить эффективную экстракцию растворителем, тем самым обеспечивая экономически выгодный способ выделения.

Трансформация Р. chrysоgenum, в принципе, может быть достигнута разными способами доставки ДНК, такими как поглощение протопласта при участии ПЭГ-Са, электропорация или методы стреляющих частиц и выбор трансформантов. См., например, Ван ден Хондел ан Пунт, Gene Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, (Перенос гена и рост вектора в нитевидных грибах) in Applied Molecular Genetics of Fungi (Пеберди, Лейтен, Огден, Беннет, редакторы), Кембридж Юниверсити Пресс (1991). Описано применение доминантных и недоминантных селектированных маркеров (Ван ден Хондел, см. выше). Описаны селектированные маркеры как гомологичной (производные P.chrysogenum), так и гетерологичной (не являющиеся производными P.chrysogenum) природы (Гоука и др., J.Biotechnol., 20 (1991), 189-200).

Хорошо известно применение различных маркеров селекции трансформантов, одной или разной природы, в присутствии или отсутствии векторов, физически связанных или не связанных с ДНК, не поддающейся отбору в селекции трансформантов.

Реакция увеличения кольца с участием фермента экспандазы происходит и проявляется таким путем в P.chrysogenum, например, в штамме Panlabs Р14-В10, DS 18541 (депонированном в DPS с номером доступа 455.95). Ясно, что если реакцию увеличения кольца проводят в его мутанте, то условия среды должны быть приспособлены для достижения эффективного роста.

Кроме того, ген cefE помещают в условия транскрипционной и трансляционной регуляции элементами гена, выделенного из грибка (нитевидного или нет), являющегося предпочтительно производным гена Y P.chrysogenum (описанного в ЕР-А-0549062), гена Р.chrysogenum IPNS, гена β тубулина, гена gpdA грибка Aspergillius nidulans и гена g1сА грибка Aspergillius niger.

В итоге настоящее изобретение сообщает как активность фермента экспандазы, введенного в P. chrysogenum, может быть предназначена in vivo для увеличения кольца пенициллина G.

В соответствии с настоящим изобретением β-лактамный интермедиат, фенилацетил-7-АДЦК, получают в P.chrysogenum добавлением в среду фенилуксусной кислоты или ее соли или эфира. Подходящими солями являются, например, соли натрия или калия. 7-АДЦК эффективно выделяют из среды простой экстракцией, например, следующим путем.

Бульон фильтруют и к фильтрату добавляют органический растворитель, не смешивающийся с водой. Приводят рН к значению экстракции цефалоспорина из водного слоя. Интервал рН должен быть ниже 4,5; предпочтительно между 1 и 4, более предпочтительно между 1 и 2. Таким путем цефалоспорин отделяют от многих других примесей, присутствующих в ферментативном бульоне. Предпочтительно используют небольшой объем органического растворителя с получением концентрированного раствора цефалоспорина, тем самым достигая уменьшения объемных скоростей потока. Второй возможностью является экстракция всего бульона при рН 4 или ниже. Предпочтительно, бульон экстрагируют органическим растворителем, не смешивающимся с водой, при рН между 1 и 4.

Можно использовать любой растворитель, который растворяет молекулу цефалоспорина. Подходящими растворителями являются, например, бутилацетат, этилацетат, метилизобутилкетон, спирты, такие как бутанол и т.д. Предпочтительно применяют бутилацетат.

Затем цефалоспорин экстрагируют снова водой при рН между 4 и 10, предпочтительно между 6 и 9. Снова конечный объем значительно уменьшают. Выделение может быть проведено при температурах между 0 и 50^oС, предпочтительно при комнатной температуре.

Водный раствор цефалоспорина, полученный таким образом, обрабатывают подходящим ферментом для того, чтобы удалить фенилацетильную боковую цепь и получить целевую 7-АДЦК. Подходящим ферментом для этой цели является пенициллин G-ацилаза, как описано в ЕР-А-0453047, также называемая пенициллинамидазой.

Предпочтительно используют иммобилизованный фермент с целью его повторного использования. Методология использования таких частиц и иммобилизации ферментов хорошо описана в ЕР-А-0222462. Водный раствор имеет рН, например, 4-9, при котором практически не происходит разложение цефалоспорина, при этом целевое превращение ферментом осуществляется оптимально. Следовательно, фермент добавляют к водному раствору цефалоспорина, поддерживая соответствующий уровень рН, например, добавлением водного раствора неорганического основания, такого как раствор гидроксида калия, или использованием катионообменной смолы. Когда реакция заканчивается, иммобилизованный фермент отфильтровывают. Другой возможностью является использование иммобилизованного фермента в колонне с неподвижным или псевдоожиженным слоем, или использование фермента в растворе или удаление продуктов мембранным фильтрованием. Затем реакционную смесь подкисляют в присутствии органического растворителя, не смешивающегося с водой.

После приведения рН к значению примерно 0,1-1,5 слои разделяют и рН водного слоя приводят к значению 2-5. Затем отфильтровывают кристаллическую 7-АДЦК.

Деацилирование также может быть проведено химическим путем, известным из предыдущего уровня техники, например, через образование иминохлоридной боковой цепи, добавлением пентахлорида фосфора при температуре ниже 10^oС и затем изобутанола при комнатной температуре или ниже.

Следующие примеры предлагаются для иллюстрации, но не ограничиваются ими.

Пример 1
Ферментативный способ получения фенилацетил-7-АДЦК
Штамм Panlabs P14-B10 Р.chrysogenum, депонированный в CBS с номером доступа 455,95, используют в качестве штамма-хозяина для конструкций кассеты экспрессии экспандазы.

Используемая кассета экспрессии, содержащая ген экспандазы с сигналами транскрипции и трансляции Р.chrysogenum IPNS описана Кроуфордом и др. (см. выше). Трансформанты очищают и анализируют на экспрессию фермента экспандазы испытанием их способности производить адипоил-7-АДЦК, как описано у Кроуфорда и др. (см. выше).

Трансформанты, продуцирующие адипоил-7-АДЦК, как, например штамм Р. chrysogenum PC100, депонированные в АТСС под номером 74182, инокулируют при 2,106 конидиа/мл в посевную среду, состоящую из (г/мл): глюкоза 30; Фармамедиа (мука семян хлопка) 10; взвесь замоченной кукурузы 20; (NH₄)₂SO₄ 20; СаСО₃ 5; КН₂РО₄ 0,5; лактоза 10; экстракт дрожжей 10, при рН перед стерилизацией 5,6.

Посевную культуру (20 мл в 250 мл колбе Эрлемейера, закрытой хлопковой пробкой) инкубируют при 25^oС при 220 об/мин. Через 48 часов 1 мл использовали, чтобы засеять 15 мл производительной среды, состоящей из (г/л): КН₂PО₄ 0,5; K₂SO₄ 5; (NH)₂SO₄ 17,5; лактоза 140; Фармамедиа 20; СаСО₃ 10; лярд-масло 10, при рН перед стерилизацией 6,6.

После инокулирования культуры к ней добавляют 0,15-0,75 мл 10% раствора фенилуксусной кислоты, приведенного к рН 7,0 КОН.

Полученную культуру инокулируют при 25^oС и 220 об/мин в течение 168 часов в 250 мл колбе Эрлемейера, закрытой молочным фильтром. Испарившуюся воду восполняют через день.

По окончании ферментации мицелий удаляют центрифугированием или фильтрованием и пенициллин G и фенилацетил-7-АДЦК анализируют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).

Пример 2
Анализ продуцированной фенилацетил-7-АДЦК
Продукты ферментации из трансформированных штаммов Penicillium анализировали ВЭЖХ. Система ВЭЖХ состоит из следующих компонентов Spectra Physics: системы подачи растворителя Р1500, инжектора AS 1000, детектора УФ1000 с переменной длиной волны (отрегулированного на 214 нм) и интегратора ISM 100 или ему подобного. Неподвижной фазой была колонка Хромпак Хромсфер С18. Подвижная фаза состояла из 75% фосфатного буфера с рН 2,6 и 25% ацетонитрила. Продукты были количественно определены сравнением со стандартной кривой фенилацетил-7-АДЦК и пенициллина G. Идентичность фенилацетил-7-АДЦК устанавливали ЯМР 600 МГц раствора в дейтерохлороформе, полученного кислотной экстракцией фильтрата культуры. Резонансные сигналы фенилацетил-7-АДЦК в кислотном экстракте оказались идентичны сигналам синтетического образца.

Пример 3
Ферментативный способ получения 7-АЦДК из фенилацетил-7-АЦДК
Фенилацетил-7-АДЦК получали из отфильтрованного ферментационного бульона, полученного в соответствии с описанным в Примере 1, путем экстракции бутилацетатом при значениях рН между 4 и 1. Фенилацетил-7-АДЦК вновь экстрагировали в воде при значениях рН между 6 и 9 и концентрировали с получением 8% (в/об) раствора фенилацетил-7-АДЦК. К водному раствору фенилацетил-7-АДЦК добавляли иммобилизованную ацилазу (Separase^®) в конечной концентрации 40 г/л, поддерживая при этом рН при 8,5. После инкубации указанной реакционной смеси при 30^oС в течение 4 часов смесь подвергали анализу методом ВЭЖХ, как описано в Примере 2. Почти все количество фенилацетил-7-АДЦК было в результате дезацилировано в 7-АДЦК. Ацилазу удаляли фильтрованием и оставшийся раствор подкисляли с помощью концентрированной (37%) соляной кислоты. Высвободившуюся фенилуксусную кислоту экстрагировали в 1/3 объема изобутанола после подкисления до значений рН от 1 до 2. Наконец, 7-АДЦК подвергали кристаллизации после нейтрализации при рН 4,0 путем добавления серной кислоты. Полученный продукт фильтровали и сушили для получения конечного продукта.

Идентификация 7-АДЦК была произведена при анализе конечного продукта методом ЯМР при 600 МГц в растворе D₂О/DC1.

Резонансы 7-АДЦК подтвердили идентичность этого продукта синтетическому образцу.

Изобретение относится к микробиологии и генетической инженерии и может быть использовано при промышленном получении антибиотиков цефалоспориновой природы. В результате ферментации штамма Penicillium chrysogenum, трансформированного экспрессионным вектором, содержащим ген экспандазы под контролем регуляторов транскрипции и трансляции, которые получены из гена грибкового происхождения, в культуральной среде с добавлением фенилуксусной кислоты получают фенилацетил-7-АДЦК. Выделенную из среды ферментации фенилацетил-7-АДЦК дезацилируют с получением 7-АДЦК, которую затем кристаллизуют. 3 з.п. ф-лы.

1. Способ получения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК), при котором осуществляют следующие стадии: (а) трансформацию штамма Penicillium chrysogenum геном экспандазы, функционально связанным с элементами транскрипционной и трансляционной регуляции, принадлежащими гену грибкового происхождения, (б) ферментацию указанного штамма в культуральной среде с последующим добавлением к этой культуральной среде фенилуксусной кислоты, ее соли или эфира с целью получения пенициллина G, способного в присутствии экспандазы образовывать фенилацетил-7-АДЦК, (в) выделение фенилацетил-7-АДЦК из среды ферментации, (г) дезацилирование фенилацетил-7-АДЦК и (д) получение кристаллической 7-АДЦК. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стадия (д) является стадией фильтрования. 3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что стадия (в) является стадией фильтрования и экстракции фильтрата органическим растворителем, не смешивающимся с водой, при рН ниже, чем примерно 4,5, и повторной экстракции органической фазы водой при значениях рН между 4,0 и 10,0. 4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что ген экспандазы выделяют из Streptomyces clavuligerus или Nocardia lactamdurans.