СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ N-ДЕАЦИЛИРОВАННОГО ЦЕФАЛОСПОРИНА Российский патент 2003 года по МПК C12P35/00 C12P35/02 C12P35/00 C12R1/82 

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к ферментативному получению N-деацилированных цефалоспоринов, таких как 7-ADCA.

Уровень техники
β-лактамные антибиотики составляют наиболее важную группу антибиотических соединений, имеющих длительную историю клинического применения. В этой группе выделяются такие антибиотики, как пенициллины и цефалоспорины. Эти соединения продуцируются в природе нитчатыми грибами Penicillium chrysogenum и Acrеmonium chrysogenum соответственно.

В результате усовершенствования классических методов со штаммами уровень получения антибиотиков в Penicillium chrysogenum и Acrеmonium chrysogenum существенно возрос за последние десятилетия. С увеличением объема знаний о биосинтетических путях метаболизма, ведущих к образованию пенициллинов и цефалоспоринов, и открытием технологии рекомбинантных ДНК стали доступны новые средства для усовершенствования производственных штаммов и дериватизации соединений in vivo.

Большинство ферментов, участвующих в биосинтезе β-лактамов, идентифицировано, и их соответствующие гены клонированы, что описано в Ingolia and Queener, Med. Res. Rev., 9 (1989), 245-264 (пути биосинтеза и ферменты) и в Aharonowitz, Cohen and Martin, Ann. Rev. Microbiol., 46 (1992), 461-495 (клонирование генов).

Первыми двумя стадиями при биосинтезе пенициллина в Р. chrysogenum являются конденсация трех аминокислот - L-5-амино-5-карбоксипентановой кислоты (L-α-аминоадипиновая кислота) (А), L-цистеина (С) и L-валина (V) до трипептида LLD-ACV и последующая циклизация этого трипептида с образованием изопенициллина N. Это соединение содержит типичную β-лактамную структуру.

Эти две первые стадии являются обычными при биосинтезе пенициллинов в грибах и бактериях, продуцирующих пенициллин, цефамицин и цефалоспорин.

Третья стадия заключается в замене гидрофильной боковой цепи D-α-аминоадипиновой кислоты изопенициллина N на L-5-амино-5-карбоксипентановую кислоту при воздействии фермента ацилтрансферазы (AT). Ферментативная реакция обмена, опосредованная AT, происходит внутри клеточной органеллы-микротельца, как описано в ЕР-А-0448180.

В микроорганизмах, продуцирующих цефалоспорин, третьей стадией является изомеризация эпимеразой изопенициллина N в пенициллин N, после чего пятичленная циклическая структура, характерная для пенициллинов, расширяется ферментом экспандазой до шестичленной структуры, характерной для цефалоспоринов.

Единственными непосредственно ферментируемыми пенициллинами промышленного значения являются пенициллин V и пенициллин G, получаемые путем добавления во время ферментации Р. сhrysоgenum предшественников гидрофобной боковой цепи - феноксиуксусной кислоты или фенилуксусной кислоты соответственно, причем таким образом боковые цепи природных β-лактамов заменяются на феноксиуксусную кислоту или фенилуксусную кислоту.

Цефалоспорины значительно дороже пенициллинов. Одна из причин этого состоит в том, что некоторые цефалоспорины (например, цефалексин) получают из пенициллинов путем многих химических превращений. Цефалоспорин С, безусловно, наиболее важное исходное вещество в этом отношении, хорошо растворяется в воде при любом рН, что, следовательно, предполагает длительный и дорогостоящий процесс выделения с использованием громоздкой и дорогой колоночной технологии. Цефалоспорин С, полученный таким путем, должен быть превращен в применяемые в терапии цефалоспорины посредством многих химических и ферментативных превращений.

Промежуточный цефалоспорин 7-ADCA в настоящее время получают посредством химической дериватизации пенициллина G. Необходимые химические стадии получения 7-ADCA включают расширение 5-членной пенициллиновой циклической структуры до 6-членной цефалоспориновой циклической структуры.

В последнее время появились сообщения о ферментативных способах получения 7-ADCA.

В ЕР-А-0532341 описывается применение в качестве исходного материала адипата (5-карбоксипентаноата), что приводит к образованию пенициллинового производного с адипильной боковой цепью, а именно адипил-6-аминопенициллановой кислоты. Это включение происходит благодаря тому факту, что ацилтрансфераза обладает доказанной широкой субстратной специфичностью (Behrens et al., J. Biol. Chem., 175 (1948), 751-809, Cole, Process. Biochem., 1 (1966), 334-338; Ballio et al. , Nature, 185 (1960), 97-99). Кроме того, когда к рекомбинантному штамму Р. chrysogenum, экспрессирующему экспандазу, загружают адипат, адипил-6-АРА расширяется до своего соответствующего цефалоспоринового производного. Наконец, предлагается удаление адипильной боковой цепи, причем в качестве конечного продукта получают 7-ADCA.

В заявке на патент ЕР-А-0540210 описывается подобный способ получения 7-АСА, включающий дополнительные стадии превращения 3-метильной группы кольца ADCA в 3-ацетоксиметильную группу АСА.

В WO 95/04148 и WO 95/04149 описывается загрузка из некоторых содержащих тиогруппу дикарбоновых кислот к экспрессирующему экспандазу штамму Р. chrysogenum, причем в результате эти предшественники включаются в пенициллиновый скелет и происходит последующее расширение до соответствующих производных 7-ADCA.

Вообще, полагают, однако, что экспандаза, которая может предоставить решающее связующее звено между пенициллином N и биосинтезом цефалоспорина, имеет узкую специфичность (Маеа et al., Enzyme and Microbial Technology (1955), 17: 231-234; Baldwin et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 374-375 (1987)), что предупреждает возможность катализа окислительного расширения кольца пенициллина N с неприродными боковыми цепями.

Настоящее изобретение относится к способу ферментативного получения цефалоспоринов с использованием новых предшественников боковой цепи, имеющему ряд преимуществ перед существующими способами в отношении выхода и в отношении пониженного уровня побочных продуктов.

Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к способу получения N-деацилированного цефалоспорина, включающему стадии:
*ферментации микробного штамма, способного к продуцированию β-лактама и экспрессии ацилтрансферазы, а также экспандазной активности и, необязательно, ацетилтрансферазной и/или гидроксилазной активности в присутствии предшественника боковой цепи формулы (1)
НООС - Х - СООН (1)
где Х представляет
(СН₂)_m-СН=А-(СН₂)_n или (СН₂)_m-С=С-(СН₂)_n,
где m и n, каждый по отдельности, представляют 0, 1, 2 или 3, и m+n=2 или 3, и
А представляет СН или N,
или
X представляет (CH₂)_p-CH=CH-CH=CH-(CH₂)_q, где
р и q, каждый по отдельности, представляют 0 или 1, и
p+q=0 или 1,
или его соли, эфира или амида, причем указанный предшественник боковой цепи дает производное ацил-6-АРА, включающее указанный предшественник, причем указанное производное ацил-6-АРА in situ расширяется до соответствующего производного ацил-7-ADCA и, необязательно, превращается затем в производное ацил-7-ADCA или ацил-7-АСА, и
* извлечения производного ацил-7-цефалоспорина из ферментационного бульона,
* деацилирования указанного производного ацил-7-цефалоспорина, и
* извлечения кристаллического N-деацилированного 7-цефалоспорина.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления
Настоящее изобретение относится к способу получения N-деацилированных цефалоспоринов (7-ADCA, 7-ADAC или 7-АСА) посредством ферментативного получения их N-ацилированных аналогов с применением загрузки из новых предшественников боковой цепи. При использовании этих предшественников образуются новые N-ацилированные цефалоспориновые производные.

В соответствии с изобретением ферментация микробного штамма, способного к продуцированию β-лактама и экспрессии ацилтрансферазы, а также экспандазной активности и, необязательно, гидроксилазной или как гидроксилазной, так и ацетилтрансферазной активности, в присутствии дикарбоновой кислоты с одной или двумя ненасыщенными связями приводит к улучшенному включению указанного предшественника боковой цепи в цефалоспориновый скелет. Как следствие, при способе изобретения можно обнаружить низкие уровни нежелательных производных ацил-6-АРА. Кроме того, настоящее изобретение показывает, что с ненасыщенным предшественником выход N-ацилированного цефалоспоринового производного выше по сравнению с выходом в случае адипиновой кислоты.

Предшественник боковой цепи по изобретению имеет строение, соответствующее формуле (1)
НООС - Х - СООН (1)
где Х представляет
(СН₂)_m-СН=А-(СН₂)_n или (СН₂)_m-С=С-(СН₂)_n, где
m и n, каждый по отдельности, представляют 0, 1, 2 или 3, и m+n=2 или 3, и
А представляет CН или N,
или
Х представляет (СН₂)_р-СН=СН-СН=СН-(СН₂)_g, где
р и q, каждый по отдельности, представляют 0 или 1, и
p+q=0 или 1.

По изобретению ферментация указанного микробного штамма в присутствии ненасыщенного предшественника боковой цепи формулы (1) или его соли, эфира или амида приводит, в результате, к образованию производного ацил-6-АРА, включающего указанный предшественник. Указанное производное ацил-6-АРА затем расширяется in situ до соответствующего производного ацил-7-ADCA.

В частности, в настоящем изобретении показывается, что соединение ацил-6-АРА с включенным предшественником изобретения является эффективным субстратом для последующей реакции расширения. Количество ацил-6-АРА, которое образуется в способе по изобретению, значительно ниже количества побочного продукта адипил-6-АРА, образующегося в способе получения адипил-7-ADCA с использованием предшественника боковой цепи - адипиновой кислоты.

В предпочтительном варианте воплощения изобретения в качестве предшественника боковой цепи используют соединение формулы (1), где m и n равны 1 и А представляет СH. Предпочтительнее, соединение формулы (1) представляет транс-β-гидромуконовую кислоту. Настоящее изобретение показывает, что ацил-6-АРА, содержащая транс-β-муконильную боковую цепь, весьма эффективно расширяется до соответствующего производного 7-ADCA, так как производное 6-АРА не обнаруживается или обнаруживается только в небольшом количестве. Кроме того, показано, что выход производного N-ацилированного цефалоспорина с этим предшественником лучше по сравнению с выходом с адипиновой кислотой.

Микробные штаммы, которые применимы в способе изобретения, представляют штаммы, способные продуцировать β-лактамы и экспрессирующие ацилтрансферазу, а также экспандазу. Необязательно, указанные микробные штаммы могут, кроме того, экспрессировать гидроксилазу или гидроксилазу вместе с ацетилтрансферазой. Первые штаммы делают возможным получение производных ацил-7-ADCA, в то время как последние штаммы делают возможным получение производных ацил-7-ADAC или ацил-7-АСА.

Примерами таких микробных штаммов являются пенициллинпродуцирующие штаммы, обеспеченные полигенным экспрессирующим кластером, обеспечивающим экспрессию экспандазы, и цефалоспоринпродуцирующие штаммы, обеспеченные полигенным экспрессирующим кластером, обеспечивающим экспрессию ацилтрансферазы.

Экспандазные гены, которые удобно использовать, могут происходить из Acremonium chrysogenum, Streptomyces clavuligerus, Streptomyces antibioticus или Nocardia lactamdurans. Ацилтрансферазный ген может происходить из Р. chrysolenum, P. nalgiovense или A. nidulans.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения используют пенициллинпродуцирующий грибной штамм, который рекомбинантно экспрессирует экспандазу. Предпочтительнее использовать гриб рода Aspergillus или Penicillium, наиболее предпочтительно - штамм Penicillium chrysogenum. Штамм Р. сhrуsоgеnum Panlabs P14-B10, DS 18541 (депонирован в CBS под регистрационным номером 455.95) является примером подходящего хозяина для экспрессии экспандазы.

Создание рекомбинантных экспрессирующих экспандазу штаммов находится в компетенции специалиста. Примеры полигенных экспрессирующих кластеров, которые можно использовать для создания рекомбинантных экспрессирующих экспандазу грибных штаммов, описываются в ЕР-А-0532341, Crawford et al. (Biotechnol., 13 (1995), 58-62) и WO 95/04148. Следует проявить внимание при отборе трансформированного штамма с достаточно высоким уровнем экспрессии экспандазы. Такие трансформанты можно отобрать, например, посредством проверки их способности продуцировать адипил-7-ADCA, как это описано в Crawford et al. (цит. выше).

В другом варианте воплощения изобретения используют цефалоспоринпродуцирующий штамм, который рекомбинантно экспрессирует ацилтрансферазу, например продуцирующий ацилтрансферазу штамм Acremonium chrysogenum. Штамм A. chrysogenum, рекомбинантно экспрессирующий ацилтрансферазу, будет, таким образом, продуцировать производное ацил-7-АСА, так как штамм по природе экспрессирует гидроксилазу и ацетилтрансферазу.

Эти предпочтительные варианты воплощения изобретения будут чрезвычайно содействовать снижению количества пенициллиновых побочных продуктов, присутствие которых в конечном продукте 7-ADCA не допускается регистрационными ведомствами.

Настоящее изобретение также относится к способу извлечения производного ацил-7-цефалоспорина из ферментационного бульона микробной ферментации по изобретению с использованием определенных растворителей, например к извлечению производного ацил-7-ADCA из ферментационного бульона экспрессирующего экспандазу штамма Р. chrysogenum.

Конкретно, производное ацил-7-цефалоспорина извлекают из ферментационного бульона путем экстракции бульонного фильтрата органическим растворителем, несмешивающимся с водой при рН примерно ниже 4, 5, и его обратной экстракции водой при рН от 4 до 10.

Бульон фильтруют и к фильтрату добавляют несмешивающийся с водой органический растворитель. Корректируют рН, чтобы экстрагировать производное ацил-7-цефалоспорина из водного слоя. Интервал рН должен быть ниже 4, 5; предпочтительно - от 4 до 1, предпочтительнее - от 2 до 1. При этом производное ацил-7-цефалоспорина отделяют от многих других примесей, присутствующих в ферментационном бульоне. Предпочтительно, используют меньший относительно объема водного слоя объем органического растворителя, например половину этого объема, и получают концентрированный раствор производного ацил-7-цефалоспорина, причем таким образом достигают уменьшение объемных скоростей потока. Другой возможностью является экстракция всего бульона при рН 4 или ниже. Предпочтительно, бульон экстрагируют органическим растворителем, несмешивающимся с водой при рН от 4 до 1.

Можно использовать любой растворитель, который не влияет на молекулу цефалоспорина. Подходящими растворителями являются, например, бутилацетат, этилацетат, метилизобутилкетон, спирты, такие как бутанол, и т.п. Предпочтительно используют 1-бутанол или изобутанол.

После этого производное ацил-7-цефалоспорина "обратно" экстрагируют водой при рН от 4 до 10, предпочтительно - от 6 до 9. И снова конечный объем можно уменьшить. Извлечение можно осуществлять при температурах от 0 до 50^oС, а предпочтительно - при температурах окружающей среды.

Производные ацил-7-цефалоспоринов, полученные способом по изобретению, удобно применять в качестве промежуточных соединений для химического синтеза полусинтетических цефалоспоринов, так как 7-аминогруппа адекватно защищена наличием соответствующей ацильной боковой цепи,
С другой стороны, производные ацил-7-цефалоспоринов деацилируют в одностадийном ферментативном процессе с использованием подходящего фермента, например ацилазы Pseudomonas SE83.

Предпочтительно используют иммобилизованный фермент, чтобы иметь возможность использовать фермент повторно. Методология получения таких частиц и иммобилизации ферментов пространно описана в ЕР-А-0222462. Величина рН водного раствора составляет, например, от 4 до 9, при которой сводится к минимуму реакция расщепления цефалоспорина и оптимизируется необходимое превращение ферментом. Так, фермент добавляют к водному раствору цефалоспорина, в то же время поддерживая рН на соответствующем уровне посредством, например, добавления неорганического основания, например раствора гидроксида калия, или применения катионообменной смолы. Когда реакция завершается, иммобилизованный фермент удаляют фильтрацией. Другой возможностью является применение иммобилизованного фермента в колонке с неподвижным или псевдоожиженным слоем или применение фермента в растворе и удаление продуктов посредством ультрафильтрации через полупроницаемую мембрану. Затем реакционную смесь подкисляют в присутствии органического растворителя, несмешивающегося с водой. После корректировки рН примерно до 0,1-1,5 слои разделяют и доводят рН водного слоя до 2-5. Затем отфильтровывают кристаллическое соединение цефалоспорина.

Деацилирование можно также осуществлять химически, как известно на сегодня в технике, например, через образование иминохлоридной боковой цепи посредством добавления пентахлорида фосфора при температуре ниже 10^oС, а затем изобутанола при температурах окружающей среды или более низких температурах.

Пример 1
Ферментация рекомбинантного Р. chrysogenum
В качестве штамма-хозяина для конструкций полигенного экспрессирующего кластера экспандазы используют штамм Р. chrysogenum Panlabs P14-B10, депонированный в CBS под регистрационным номером 455.95.

Используемый экспрессирующий полигенный кластер, содержащий ген экспандазы под сигналами регуляции транскрипции и трансляции гена IPNS P. chrysogenum, описывается в Crawford et al. (см. выше). Условия трансформации и культивирования такие же, как описано в Crawford et al. (см. выше). Трансформанты очищают и анализируют на экспрессию фермента экспандазы посредством проверки их способности продуцировать адипил-7-ADCA, как описано в Crawford et al. (см. выше).

Продуцирующие ацил-7-ADCA трансформанты инокулируют в количестве 2•10⁶ конидий на мл в среду для посева, состоящую из (г/л) 30 глюкозы; 10 Pharmamedia (мука из семян хлопчатника); 20 твердого вещества кукурузного экстракта; 20 (NH₄)₂SO₄; 5 СаСО₃, 0,5 КН₂РO₄; 10 лактозы; 10 дрожжевого экстракта, при рН перед стерилизацией 5,6.

Посевную культуру (20 мл в 250 мл колбе Эрленмейера, закрытой ватной пробкой) инкубируют при 25^oC при 220 об/мин. Через 48 часов используют 1 мл для инокуляции 15 мл производственной питательной среды, состоящей из (г/л) 0,5 КН₂PO₄; 5 K₂SO₄; 17,5 (NH₄)₂SO₄; 140 лактозы; 20 Pharmamedia; 10 СаСО₃; 10 лярда, при рН перед стерилизацией 6,6.

После инокуляции посевной культурой к ферментационной смеси добавляют 20% исходный раствор выбранного предшественника с рН, отрегулированным до 6,5 с помощью КОН, до достижения конечной концентрации 0,5-2,0%.

Продуцирующую культуру культивируют при 25^oC при 220 об/мин в течение 168 часов в 250-мл колбе Эрленмейера, закрытой молочным фильтром. Испарившуюся воду восполняют каждый второй день.

По окончании производственной ферментации мицелий удаляют центрифугированием или фильтрацией, а ацил-6-АРА и ацил-7-ADCA анализируют посредством ВЭЖХ.

Пример 2
Анализ продуктов ферментации
Продукты ферментации от трансформированных штаммов Реnicillinum анализируют посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Система ВЭЖХ состоит из следующих компонентов: системы доставки растворителя Р1000 (TSP), автоматического пробоотборника модели на основе непрерывного действия (Spark Holland) (инжекционный объем 3), детектора с переменной длиной волны UV150 (TSP) (установлен на 260 нм) и информационной системы РС1000 (TSP). Неподвижная фаза представляет набивку YMC, колонка ODS AQ 150*4,6 мм. Подвижная фаза состоит на 84% из фосфатного буфера, рН 6,0, к которому добавлено 0,17% гидросульфата тетрабутиламмония, и на 16% из ацетонитрила. Количество продуктов устанавливают посредством сравнения со стандартной кривой для ожидаемого ацил-7-ADCA.

Пример 3
Продуцирование производных N-ацилированных пенициллинов и цефалоспоринов
Осуществляют ферментацию Р. chrysogenum по примеру 1 в присутствии различных концентраций адипиновой кислоты (АА) или транс-β-гидромуконовой кислоты (ТНМА). Продукты - N-ацилированные β-лактамы анализируют ВЭЖХ по примеру 2.

ВЭЖХ-анализ показывает, что ТНМА включается в цефалоспориновый скелет при ферментации в присутствии этого предшественника, т. е. образуется транс-β-гидромуконил-7-ADCA.

Из результатов, приведенных в таблице 1, также видно, что транс-β-гидромуконил-7-АРА не обнаруживается, когда ферментация происходит в присутствии ТНМА. Кроме того, выход транс-β-гидромуконил-7-ADCA лучше по сравнению с выходом адипил-7-ADCA, в особенности, когда применяют более высокие концентрации предшественника.

Изобретение относится к способу получения N-деацилированных цефалоспоринов посредством ферментативного получения их 7-ацилированных аналогов. Способ предусматривает ферментацию пенициллин- или цефалоспоринпродуцирующего микробного штамма, способного к продуцированию β-лактама и экспрессии ацилтрансферазы и экспандазной активности, а также возможно ацетилтрансферазной и/или гидроксилазной активности. Ферментацию проводят в присутствии предшественника боковой цепи формулы НООС-Х-СООН (значения Х приведены в формуле) или его соли, эфира или амида. После ферментации извлекают производное ацил-7-цефалоспорина, деацилируют его и извлекают кристаллический N-деацилированный цефалоспорин. Способ позволяет повысить выход целевого продукта и снизить уровень побочных продуктов. 8 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения N-деацилированного цефалоспорина, включающий стадии:
ферментации микробного штамма, способного к продуцированию β-лактама и экспрессии ацилтрансферазы, а также экспандазной активности и, необязательно, ацетилтрансферазной и/или гидроксилазной активности, в присутствии предшественника боковой цепи формулы (I)
НООС-Х-СООН (I)
где Х представляет (СН₂)_m-СН=А-(СН₂)_n;
где m и n, каждый по отдельности, представляют 0,1,2 или 3, и
m+n составляют 2 или 3, или
Х представляет (СН₂)_р-СН=СН-СН= СН-(СН₂)_q, где p и q, каждый по отдельности, представляют 0 или 1 и р+q составляют 0 или 1,
или его соли, эфира или амида, причем указанный предшественник боковой цепи дает производное ацил-6-АРА, включающее указанный предшественник, причем указанное производное ацил-6-АРА in situ расширяется до соответствующего производного ацил-7-АDСА, и, необязательно, превращается затем в производное ацил-7-ADAC или ацил-7-АСА, и
извлечения производного ацил-7-цефалоспорина из ферментационного бульона,
деацилирования указанного производного ацил-7-цефалоспорина, и
извлечения кристаллического N-деацилированного цефалоспорина. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют ненасыщенный предшественник боковой цепи формулы (I), где m и n представляет 1, и А представляет СН. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанный ненасыщенный предшественник боковой цепи представляет транс-β-гидромуконовую кислоту. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что микробный штамм представляет пенициллинпродуцирующий штамм, снабженный полигенным экспрессирующим кластером, обеспечивающим экспрессию экспандазы. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что пенициллинпродуцирующий штамм представляет Penicillium chrysogenum. 6. Способ по п.4 или 5, отличающийся тем, что кристаллическим цефалоспорином является 7-ADCA. 7. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что микробный штамм представляет цефалоспоринпродуцирующий штамм, снабженный полигенным экспрессирующим кластером, обеспечивающим экспрессию ацилтрансферазы. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что цефалоспоринпродуцирующий штамм представляет Аcremonium chrysogenum. 9. Способ по п.7 или 8, отличающийся тем, что кристаллическим цефалоспорином является 7-ADAC или 7-АСА.