ШТАММ КР 95 № 114 ВИРУСА СИНДРОМА ГИДРОПЕРИКАРДИТА КУР ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2002 года по МПК C12N7/00 A61K39/235 C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств специфической профилактики синдрома гидроперикардита кур (СГПК).

СГПК (болезнь Ангара, болезнь Личи) - это остро протекающая инфекционная болезнь кур, наносящая значительный экономический ущерб развитому птицеводству многих стран мира.

Вирус СГПК вызывает заболевание кур преимущественно в возрасте от 10 до 50 суток, которое характеризуется внезапной гибелью птицы, скоплением избыточного количества жидкости в перикардиальной полости, поражением печени и почек, депрессией, диареей, а в некоторых случаях и анемией.

В августе 1987 года в Пакистане на бройлерной ферме в местности Angara Goth близ Карачи зарегистрировали болезнь с признаками гепатита с тельцами-включениями и поражением сердца (гидроперикардит). Заболевание отмечалось, как правило, у птиц 3-6-недельного возраста, но иногда встречалось у более молодых, либо более старших птиц, смертность достигала 50-70%. Первоначально заболеванию дали название "болезнь Ангара" в соответствии с географической местностью, где впервые зарегистрировали вспышку инфекции. Впоследствии заболеванию присвоили название "синдром гидроперикардита" в связи с тем, что при вскрытии трупов птиц отмечали скопление жидкости (до 20 мл) в сердечной сорочке, обусловленное нарушением кровообращения в сердечно-сосудистой системе. Позднее подобное заболевание было описано в Иране, Индии, Мексике, Кувейте, Австралии, Японии и Чили (1).

С начала 90-х гг. вспышки СГПК с высоким уровнем смертности регистрируются на территории Российской Федерации (2). Отсутствие в отечественной ветеринарной практике средств и методов диагностики и специфической профилактики СГПК нанесло значительный экономический ущерб птицехозяйствам. Экономические потери, которые несут птицеводческие хозяйства от вспышек СГПК, складываются из падежа птиц (от 10 до 60%), гибели развивающихся эмбрионов кур во время инкубации, снижения продуктивности и оплаты корма, а также средств, затраченных на проведение внеплановых ветеринарно-санитарных мероприятий и др. Вакцинопрофилактика СГПК занимает ведущее место в борьбе с этим заболеванием. Для профилактики СГПК применяют как живые, так и инактивированные вакцины, полученные из ткани инфицированной печени или из культуры тканей, зараженных вирусом. При выборе вакцинного штамма вируса СГПК учитывают то обстоятельство, что вирус СГПК имеет несколько серотипов, которые имеют значительные антигенные отличия. Из литературных источников известно об отсутствии перекрестной защиты между гетерологичными серотипами аденовирусов кур (3).

В связи с этим задача отбора и изучения эпизоотических изолятов данного возбудителя в целях получения новых производственных штаммов СГПК для изготовления вакцинных препаратов остается актуальной.

За рубежом известен ряд штаммов возбудителя СГПК, используемых для производства диагностических и вакцинных препаратов (4, 5).

Известен также отечественный штамм "АДВ" вируса СГПК для производства антигена и иммунной сыворотки для постановки реакции нейтрализации с целью лабораторной диагностики СГПК (6).

Однако в отечественной ветеринарной практике нет штамма, пригодного для производства высокоиммуногенной инактивированной вакцины против СГПК, способной защитить поголовье кур от эпизоотического возбудителя СГПК, циркулирующего на территории Российской Федерации.

В задачу создания настоящего изобретения входило получение нового производственного штамма вируса СГПК, обладающего высокой иммуногенностью и безвредностью после инактивации и обеспечивающего изготовление вакцинных препаратов для решения вопроса защиты птицеводства Российской Федерации от этой опасной болезни.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в получении нового производственного штамма вируса СГПК, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью и пригодного для изготовления средств специфической профилактики СГПК.

Указанный технический результат достигнут получением штамма КР95 114 вируса СГПК. Штамм КР95 114 является новым, ранее неизвестным. Исходный вирус для получения штамма КР95 114 выделен из печени цыплят, павших с явлениями гидроперикардита во время вспышки заболевания на птицефабрике "Красноярская" Красноярского края в 1995 году. Производственный штамм КР95 114 вируса СГПК получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных биологических системах.

Полученный штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов МСХ РФ 04.12.2000 под регистрационным КР95 114-ДЕП.

Штамм КР95 114 вируса СГПК обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена его возможность использования для приготовления инактивированной вакцины против СГПК. Штамм КР95 114 обеспечивает получение инактивированной вакцины против СГПК, создающей эффективную защиту кур против указанного возбудителя заболевания.

Штамм КР95 114 вируса СГПК характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства
Штамм КР95 114 вируса СГПК относится к семейству Adenoviridae, роду Aviadenovirus, группе 1, серотипу 4, обладает морфологическими признаками, характерными для аденовирусов: как у всех прочих вирусов этого семейства, лишенных суперкапсидной оболочки, диаметр вириона штамма КР95 114 и нуклеокапсида равны. Размер вириона равен 75-80 нм. Вирион обладает икосаэдрическим типом симметрии. Вирион представлен нуклеоидом, состоящим из нуклеиновой кислоты и сердцевинных белков, и капсидной белковой оболочкой. Капсид содержит 252 капсомера, которые расположены в 20 фасетках, имеющих форму равносторонних треугольников. На ребрах равносторонних треугольных граней, общих для соседних треугольников, лежит по шесть капсомеров; длина ребра составляет около 42 нм. Каждый из 240 капсомеров капсидной оболочки, формирующих равносторонние треугольники, находятся в окружении шести таких же капсомеров и носит название гексон. Каждый из 12 капсомеров, расположенных в вершинах икосаэдра, окружен лишь пятью соседними капсомерами и носит название пептона. Каждый капсомер (кроме сложно устроенного пептона) представляет собой призматическую частицу диаметром 6-7 нм с центральной полостью размером 1,5-2 нм. Способ укладки капсомеров в капсид является уникальным для вирусов с икосаэдрическим типом симметрии и отличается геометрической упорядоченностью. Гексоны представляют собой основной растворимый компонент возбудителя при его репродукции в чувствительных клетках.

С пептонами связывают их способность агглютинировать эритроциты, что обусловлено присутствием в их составе полного гемагглютина.

Сердцевина вириона содержит двухцепочную молекулу ДНК и два внутренних белка. ДНК имеет в своем составе около 60 генов, несущих информацию, которая достаточна для кодирования от 30 до 50 белков.

Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм КР95 114 относится к группе 1 птичьих аденовирусов. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. При вакцинации вирусный антиген индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РДП в разведении 1:2-1:64.

Биотехнологические характеристики
Штамм КР95 114 является вирулентным и обладает высокой биологической активностью в нативном виде, а также проявляет высокие антигенные и иммуногенные свойства после инактивации.

Штамм КР95 114 предназначен для использования в качестве сырья для изготовления инактивированной вакцины против СГПК. Штамм КР95 114 репродуцируется на цыплятах 5-90-суточного возраста. В течение 48-120 часов инкубирования вирус накапливается в печени цыплят в титре 3,25-5,0 lg ЛД₅₀/0,2 мл. Штамм КР95 114 является стабильным и сохраняет свои свойства на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).

Хемо- и генотаксономическая характеристика
Сердцевина вириона содержит двухцепочечную молекулу ДНК и два внутренних белка. Масса нуклеиновой кислоты достигает 17,3% массы вириона.

Основная масса белков вируса СГПК сосредоточена в капсидной оболочке вириона. На долю сердцевинных белков приходится до 20% всех протеинов вируса. Сердцевинный белок "1" с молекулярной массой 46•10³ г/моль легко отделяется от внутреннего нуклеопротеида, содержащего ДНК в комплексе с богатым аргинином сердцевинным белком "2".

Гексон, основание пептона и его нить (фибер) вируса К95 114 построены из полипептидов с молекулярными массами 120•10³, 70•10³, 62•10³ г/моль соответственно.

Белковые структуры вируса штамма КР95 114 формируют несколько антигенов. В составе структурного вирусного антигена у них обнаружены типоспецифические, группоспецифические, подгруппоспецифические и типоспецифические антигены нити пептона. В составе структурного вирусного антигена выявлено три основных компонента, обозначенных А, В и С. Антиген А структурно связан с гексоном, антиген В - с пептоном, антиген С - с нитями вириона (фибер). Связанный с гексоном компонент А содержит группоспецифический антиген (α) и типоспецифический антиген (ε). Антигенный фактор, связанный с пептоном, назван антигеном (β), а с нитью вириона (фибер) - (γ).

Физические свойства
Масса вириона - 252•10³ г/моль. Плавучая плотность 1,32-1,35 г/мл в градиенте С₃Сl. Константа седиментации зрелого вириона равна 810•10^-13 - 910•10^-13 c.

Устойчивость к внешним факторам
Штамм КР95 114 устойчив к действию эфира, хлороформа, сапонина и дезоксихолата натрия, чувствителен к формальдегиду, β-пропиолактону, гидроксиламину, производным этиленимина, УФ-облучению, γ-облучению.

Штамм КР95 114 довольно устойчив к нагреванию и к изменению рН среды в широком интервале, резистентен к действию 0,25% раствора трипсина, 2% раствора фенола и 50% раствора этилового спирта. Абсолютный этанол, как и его йодный раствор, вызывает полную инактивацию вируса.

Штамм КР95 114 устойчив к многократному повторению циклов замораживания и оттаивания, не теряет инфекционных свойств при сублимационном высушивании.

Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - 100%
Патогенность выражена
Вирулентность выражена
Контагиозность выражена
Онкогенность отсутствует
Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и гемагглютинирующими вирусами.

На основании полученных данных можно утверждать, что штамм КР95 114 по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным изолятом вируса СГПК. Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная профилактика вновь возникающих очагов болезни, а для этого необходима высокоактивная и безвредная вакцина.

По мнению заявителя предлагаемый штамм обладает установленными Патентным законом России признаками патентоспособности "новизна" и "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемых изобретений пояснена примерами их исполнения.

Пример 1.

Исходный вирус для получения штамма КР95 114 выделен из печени цыплят, павших с явлениями гидроперикардита во время вспышки заболевания на птицефабрике "Красноярская" Красноярского края в 1995 году. Вакцинный штамм получен во ВНИИ защиты животных путем культивирования эпизоотического изолята в организме однодневных цыплят на протяжении трех последовательных пассажей. Вирус для пассирования получали путем внутримышечного заражения вируссодержащим гомогенатом печени цыплят, полученных из хозяйства безлейкозной птицы Онкологического научного центра РАМН (Москва). Из печени павших цыплят готовили 20% суспензию в буферном растворе (50 мМ трис - HCl рН 8,0; 100 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА), которую осветляли низкоскоростным центрифугированием с добавлением 20% хлороформа, концентрировали 7% ПЭГ, экстрагировали равным объемом хлороформа и очищали ультрацентрифугированием в преформированном градиенте плотности CsCl-сахароза. Полученный вирус использовали для последующего пассирования.

Полученный вирус был подвергнут всестороннему контролю в соответствии с руководством МЭБ по стандартным диагностическим методам и вакцинам (1996) и на уровне 3 пассажа заложен на хранение в качестве матровой расплодки. Вирус матровой расплодки с титром инфекционной активности 3,75-4,5 lg ЛД_50/0,2 мл, представленный в виде нативной 20% суспензии печени цыплят, павших от гидроперикардита, хранят при температуре -40^oС.

Полученному штамму вируса СГПК присвоено авторское наименование "КР95".

Пример 2.

Для получения вакцины из штамма КР95 114 матровым вирусом внутримышечно в объеме 1 см³ заражают 5-50-суточных цыплят, полученных из благополучных по инфекционным заболеваниям хозяйств. Цыплят содержат 120 часов после заражения. У больных и павших цыплят отбирают печень. Печень подвергают размолу на коллоидной мельнице в течение 10-12 минут, затем вируссодержащую массу смешивают с фосфатным буферным раствором, получая в результате 10-20% вируссодержащую суспензию. Вируссодержащую суспензию очищают от балластных примесей известным образом. Для этого можно использовать низкоскоростное центрифугирование, обработку суспензии различными детергентами (фреон-113, хлороформ) и флокулянтом высокомолекулярным полигексаметиленгуанидингидрохлоридом (ВПГ) в сочетании с низкоскоростным центрифугированием или сепарированием. Очистку вируссодержащей суспензии от балластных белков проводят при 6-12^oС. Очищенную суспензию подают в стерильный реактор. Для инактивации вируса используют димер этиленимина (ДЭИ). Предварительно готовят 10% раствор ДЭИ на деминерализованной воде рН 7,9-8,0. Затем в подогретую до 28-34^oС вируссодержащую суспензию вносят 10% водный раствор ДЭИ до концентрации 0,15-0,4%. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 35-36^oС в течение 24 часов. По окончании инактивации антигенный материал охлаждают до 2-8^oС. В качестве адъюванта-сорбента в вакцине используют стерильный 3-4% коллоидный раствор ГОА. рН ГОА устанавливают в пределах 7,5-7,6 и охлаждают до 2-8^oС. К охлажденному антигену при постоянном перемешивании добавляют ГОА до концентрации 0,1%. Затем к смеси дополнительно добавляют 10% водный раствор адъюванта сапонина из расчета 0,5 мг на дозу вакцины, доводя концентрацию сапонина в вакцине до 0,5-2%. После перемешивания смеси в течение часа определяют рН препарата и при необходимости доводят его значение до 7,4-7,6. Полученную вакцину контролируют на авирулентность, безвредность и стерильность, а затем фасуют в стерильные флаконы.

Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТом 28085-89.

Авирулентность и безвредность препарата определяют путем введения 10-15-суточным цыплятам вакцины в тройной дозе.

Полученная вакцина представляет собой жидкость розово-коричневого цвета с рыхлым осадком сорбента, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь.

Полученная вакцина против СГПК имеет оптимальный компонентный состав, мас.% (см. таблицу 1а.)
Содержание антигена в вакцине в указанных выше пределах является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающем достижение технического результата.

Антигенную активность каждой рецептуры полученной вакцины проверяли на 12-18-суточных цыплятах, свободных от антител к вирусу СГПК. Каждый образец вакцины вводили в дозе 0,3 см³ в мышцу бедра. Через 21 сутки после вакцинации у цыплят отбирали кровь, получали сыворотки и их использовали в РДП со специфической сывороткой, гипериммунной к вирусу СГПК. Результаты исследований представлены в табл. 1, 2 и 3. Представленные в табл. 1, 2 и 3 результаты свидетельствуют о высокоантигенной активности инактивированной вакцины против СГПК из штамма КР95 114.

При изучении иммуногенной активности инактивированной сорбированной вакцины против СГПК из штамма КР95 114 установлено, что у цыплят, привитых однократно внутримышечно в дозе от 0,3 до 0,5 см³, уже на 3 сутки после введения препарата индуцируется иммунный ответ, обеспечивающий 90-100% защиту при контрольном заражении. Следует отметить, что в группе цыплят, не привитых вакциной, смертность составила 100%. Экспериментально показано, что ИмД₅₀ сорбированной вакцины составила 0,012 см³, а одна прививная доза в объеме 0,3 см³ содержит не менее 25 ПД₅₀. Результаты исследований представлены в табл.4 и 5.

Пример 3.

Для приготовления эмульсионной вакцины против СГПК используют антигенный материал из штамма КР95 114, полученный так, как описано в примере 2. В качестве масляных адъювантов используют препараты фирмы "Сеппик" (Франция): Монтанид ИЗА 70 и Монтанид ИЗА 206. Масляный адъювант и инактивированный антиген смешивают на гомогенизаторе согласно следующим режимам:
1) при использовании масляного адъюванта Монтанид ИЗА 70 - гомогенизация в течение 4-5 мин при скорости вращения винта 3000 об/мин и температуре 10^oС. При этом получают однородную эмульсию белого цвета типа "вода-масло";
2) при использовании масляного адъюванта Монтанид ИЗА 206 - гомогенизация в течение 3-4 мин при скорости вращения винта 600 об/мин и температуре 30^oС. Тип получаемой эмульсии "вода-масло-вода". При изготовлении вакцин антиген соединяют с масляным адъювантом в следующем соотношении: с адъювантом Монтанид ИЗА 70-1:3, а с адъювантом Монтанид ИЗА 206 - 1:1 соответственно. Вязкость вакцин определяют на вискозиметре ВПЖ-2. Образцы вакцин контролируют на стабильность эмульсии центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин и хранением в термостате при 37^oС в течение 14 суток. Стабильная эмульсия в результате центрифугирования и хранения в термостате не должна расслаиваться на масляную и водную фазу.

Контроль эмульсионной формы инактивированной вакцины против СГПК осуществляют определением стерильности, полноты инактивации вируса, безвредности, антигенной, имуногенной активности и протективности препарата.

Результаты исследований представлены в табл. 6 и 7.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- штамм КР95 114 вируса СГПК, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- штамм КР95 114, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью и пригоден для изготовления инактивированной вакцины против СГПК.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации
1. Cowen B. S., Lu H. et al. Characterization studies of fowl adenoviruces associated with inclusion body hepatitis/hydropericardium syndrome in chickens. Presented at the 68-th Northeastern Conference in Avian Diseases. June 10-12 1996, p. 14.

2. Лагуткин Н.А., Арсентьев А.Р. и др. Массовый гидроперикардит у мясных цыплят раннего возраста. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: Материалы научн. конф. ВНИИВВиМ. - Покров, 1992, ч. 2, 248-251.

3. Winterfield R.W., Fadly A.M. et al. Immunisation of chicken against adenovirus infection. Poult. Sci., 1977, V. 56, 5, 1481-1486.

4. Cowen B. S. Inclusion body hepatitis-anaemia and hydropericardium syndromes: actiology and control. World's Poultry Science Journal, 1992, Vol. 48, November.

5. Chishti M.A., Afsal M. et al. Preliminari studies on the development of vaccine against the "hidropericardium syndrome" of poultry. Rev.Sci.tech. Off.int.epiz., 1989, 8(3), 797-801.

6. Патент РФ 2120993; MПK⁶ C 12 N 7/00, А 61 К 39/235; 02.08.96.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Новый вакцинный штамм КР95 114 обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью. Штамм используется для получения инактивированной вакцины против вируса синдрома гидроперикардита кур. 8 табл.

Штамм КР 95 114 вируса синдрома гидроперикардита кур сем. Adenoviridae, род Aviadenovirus, группа 1, серотип 4, ВГНКИ КР 95 114-ДЕП для изготовления вакцинных препаратов.