ЭКСТРАКЦИЯ РАСТВОРИТЕЛЕМ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ (РНА) ИЗ БИОМАССЫ, ОБЛЕГЧЕННАЯ ПРИМЕНЕНИЕМ МАРГИНАЛЬНОГО НЕРАСТВОРИТЕЛЯ ДЛЯ РНА Российский патент 2003 года по МПК C12P7/62 C08G63/89 C12N1/20 

Область техники.

Изобретение относится к способам экстрагирования определенных компонентов из других компонентов биомассы. Более конкретно, настоящее изобретение относится к экстракции полигидроксиалканоата из биологической системы, такой как растение или бактерии, путем осуществления экстракции с помощью растворителя; процесс экстракции облегчается применением маргинального нерастворителя для РНА.

Описание уровня техники.

Товарные полимеры обычно получают из нефтехимических источников с помощью хорошо известных синтетических способов. Однако последние успехи в технологии создают перспективу для новых источников товарных полимеров. Особенно перспективным является получение пластичных смол с использованием живых организмов ("биопластик"), включающее генетически управляемые бактерии и сельскохозяйственные культуры, которые предназначены для получения полимеров, таких как полигидроксиалканоат (РНА); ряд бактерий, естественно продуцирующих РНА, также являются перспективными источниками РНА (См., например, Poirier, Y. , D. Е. Dennis, К. Klomparens и С. Somerville. Polyhydroxybutyrate, a biodegradable thermoplastic, produced in transgenic plants. Science, т. 256, с. 520-523 (1992); публикация международной заявки на патент 95/05472, опубликована 23 февраля 1995; публикация международной заявки на патент 93/02187, опубликована 4 февраля 1993; Novel biodegradable Microbial Polymers, E. A. Dawes, ред. NATO ASI Series, Series E: Applied Sciences, т. 186, Kluwer Academic Publishers (1990)). При крупномасштабном производстве, например в области сельскохозяйственного производства, сбор и очистка такого биопластика от остатков биомассы является решающей стадией, определяющей практическую осуществимость такой технологии.

Выделение полимерных липидов, таких как РНА, из крупномасштабных биологических источников, таких как сельскохозяйственные культуры, является нетривиальной задачей. Традиционные способы разделения, широко используемые в экстракции низкомолекулярных липидов, нецелесообразно использовать в процессе выделения смолы. Так, например, использование простого механического пресса оказывается нецелесообразным, поскольку, в отличие от процесса выделения растительных масел из масличных семян, твердые пластики не могут быть выжаты из сельскохозяйственных культур путем механического прессования.

Выделение РНА методами седиментации, в принципе, может рассматриваться как возможный процесс. Однако простое гравитационное осаждение (сила в I-G) в жидком маргинальном нерастворителе для РНА фактически является совершенно неосуществимым процессом. Скорость осаждения чрезвычайно низка. Кроме того, такое медленное осаждение легко разрушается Броуновским движением мелких частиц РНА, которое вызывается термической флуктуацией суспендирующих жидких молекул, окружающих частицы. Кроме того, продолжительный период времени, требуемый для осаждения очень мелких частиц РНА, создает проблему бактериального загрязнения и последующего биоразложения суспензии частиц.

Известные способы экстракции растворителем также ограничены крупномасштабным выделением РНА из биомассы. Широко используемым растворителем для экстракции РНА из бактерий является хлороформ. Для такого применения описаны также другие галогенированные углеводородные растворители, такие как дихлорметан, дихлорэтан и хлорпропан (см., например, патент США 4562245, Stageman, выданный 31 декабря 1985 г.; патент США 4324907, Senior, Wright и Alderson, выданный 13 апреля 1982 г.; патент США 4310684, Vanlautem и Gilain, выданный 12 января 1982 г.; патент США 4705604, Vanlautem и Gilain, выданный 10 ноября 1987 г.; заявку на Европейский патент 036699, Holmes и Wright, опубликованную 3 сентября 1981 г. ; а также заявку на патент Германии 239609, Schmidt, Schmiechen, Rehm и Trennet, опубликованную 10 января 1986 г.) В процессе отгонки растворителя концентрированный раствор РНА часто образует очень высоковязкую жидкость или иногда даже гель, который чрезвычайно трудно поддается обработке. Кроме того, такие растворители потенциально вредны для здоровья и окружающей среды, если они не полностью удалены из РНА. Следовательно, применение большого количества таких растворителей, приводящее к образованию высоковязких растворов или гелей, особенно вблизи участка сбора, является нежелательным.

Альтернативные способы экстракции РНА из биомассы предложены в ЕР-А-479043 и ЕР-А-124309.

На основании сказанного выше, существует необходимость в простом и экономическом способе извлечения биопластиков из крупномасштабного биологического источника. Предпочтительно, чтобы такой процесс мог быть легко приспособлен для использования в стандартном производстве на основе ферментации бактериального РНА. Также предпочтительно, чтобы такой способ мог быть легко адаптирован в виде неотъемлемой части сельскохозяйственного производства родственных предметов потребления, например масла и муки, в случае переработки масляничных семян.

Следовательно, целью настоящего изобретения является обеспечение способа извлечения биопластиков из биомассы.

Эта и другие цели настоящего изобретения станут очевидными для специалиста в данной области из прочтения настоящего описания совместно с прилагаемой формулой изобретения.

Краткое изложение сущности изобретения.

Настоящее изобретение относится к способу выделения полигидроксиалканоата (РНА) из биомассы, содержащей РНА, причем способ включает: а) обработку биомассы растворителем РНА и маргинальным нерастворителем для РНА; b) удаление любой нерастворимой биомассы, после которого остается раствор РНА и маргинального нерастворителя для РНА, и с) удаление из раствора растворителя РНА, в результате чего образуется суспензия осажденного РНА в маргинальном нерастворителе для РНА. Необязательно, способ дополнительно включает удаление маргинального нерастворителя для РНА, после которого остается РНА. Кроме этого, настоящее изобретение также относится к суспензии и РНА, полученным таким способом.

Предлагаемый способ удовлетворяет потребность в относительно простом и экономичном процессе извлечение биопластиков из крупномасштабного биологического источника.

Краткое описание чертежей.

Чертеж изображает схему воплощения изобретения, согласно которому, для облегчения экстракции РНА, добавляют (и позже удаляют) маргинальный нерастворитель для РНА и внешнего источника.

Подробное описание изобретения.

Ниже приведен перечень определений терминов, используемых в тексте.

Термин "алкан" означает насыщенный углеводород, имеющий общую формулу C_nH_2n+2; предпочтительно n имеет значение от примерно 3 до примерно 20; более предпочтительно, n имеет значение от примерно 6 до примерно 16.

Термин "алкенил" обозначает углеродсодержащую цепочку, предпочтительно от примерно С₂ до примерно С₂₄, более предпочтительно от примерно С₂ до примерно C₁₉; которая может быть прямой, разветвленной или циклической, предпочтительно прямой или разветвленной, более предпочтительно - прямой; замещенной (моно- или поли-) или незамещенной; мононенасыщенной (т. е. содержать одну двойную или тройную связь в цепи), или полиненасыщенной (т. е. содержать две или более двойных связей в цепи, две или более тройных связей в цепи, или одну или более двойных связей и одну или более тройных связей в цепи), предпочтительно мононенасыщенной.

Термин "алкил" обозначает углеродсодержащую цепочку, содержащую предпочтительно от примерно 1 до примерно 24 углеродных атомов, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 19 углеродных атомов; которая может быть прямой, разветвленной или циклической, предпочтительно прямой или разветвленной, более предпочтительно, прямой; замещенной (моно-или поли-) или незамещенной; и насыщенной.

Термин "включающий" обозначает, что могут быть добавлены другие стадии и другие ингредиенты, не оказывающие влияния на конечный результат. Этот термин охватывает термины "состоящий из" и "по существу состоящий из".

Термин "экстракция полигидроксиалканоата из биомассы" в дополнение к тому, что он относится к экстракции конкретного РНА, производимого биомассой, которая производит единственный РНА, также относится к экстракции одного или более типов РНА, когда биомасса производит более одного типа РНА.

Термин "полигидроксиалканоат" и "РНА" обозначает полимер, содержащий следующее повторяющееся звено:

в котором R предпочтительно представляет собой Н, алкил или алкенил; и m имеет значение от примерно 1 до примерно 4. Термины "полигидроксиалканоат" и "РНА" включают полимеры, содержащие одно или более различных повторяющихся звеньев.

РНА, экстрагируемые способом настоящего изобретения, предпочтительно имеют температуру плавления (Т_m) примерно 80^oС или выше. Предпочтительно такие РНА содержат по крайней мере два статистически повторяющихся мономерных звена, в которых первое статистически повторяющееся мономерное звено имеет структуру

в которой R¹ представляет собой Н или C₁-С₂ алкил, и n равно 1 или 2; второе статистически повторяющееся мономерное звено имеет структуру

в которой R² представляет собой С₃-C₁₉ алкил или С₃-С₁₉алкенил и где по крайней мере 50 % статистически повторяющихся мономерных звеньев имеют структуру первого статистически повторяющегося мономерного звена. Более предпочтительно примеры РНА с высокой степенью кристалличности, экстрагируемых способом настоящего изобретения, включают те, которые раскрыты в WO 95/23788, WO 95/20614, WO 95/20621 и WO 95/20615, и в патенте США 5292860, Shiotani и Коbayashi, выданном 8 марта 1994 г.

Термин "растворитель" обозначает вещество, способное растворять другое вещество (растворенное вещество) с образованием однородно диспергированной смеси (раствор) с размером частиц на молекулярном или ионном уровне.

Термин "нерастворитель" обозначает вещество, неспособное в заметной степени растворять другое вещество.

Термин "маргинальный нерастворитель" обозначает вещество, являющееся, само по себе, нерастворителем, однако, когда смешано с растворителем, становится способным растворять растворенное вещество.

Термин "осадитель" обозначает вещество, которое способно индуцировать осаждение другого вещества и/или ослаблять сольватирующую способность растворителя. Хотя осадитель также считается нерастворителем, однако нерастворитель не всегда является осадителем. Так, например, метанол и гексан являются осадителями РНА и нерастворителями РНА; тогда как масло является нерастворителем РНА, но не очень эффективным осадителем РНА (хотя при очень высоких концентрациях масло будет вызывать осаждение РНА из раствора).

Все проценты даны в мольном выражении от общего на весь состав, если не имеется специальных оговорок.

Если специально не указано, то все соотношения даны в весовом выражении.

Далее подробно описаны аспекты настоящего изобретения, касающиеся продукта и способа.

Биомасса.

Источники, из которых экстрагируют РНА способом настоящего изобретения, включают одноклеточные организмы, такие как бактерии или грибки, и высшие организмы, такие как растения (далее в тексте на них совокупно ссылаются, как на "биомассу"). Хотя такая биомасса может быть организмами дикого типа, они предпочтительно являются генетически управляемыми видами, специально предназначенными для производства конкретной целевой РНА для производителя. Такие генетически управляемые организмы получают введением генетической информации, необходимой для получения одного или более типов РНА. Обычно такую генетическую информацию получают от бактерий, которые естественно производят РНА. Растения, полезные в настоящем изобретении, включают любое генетически сконструированное растение, предназначенное для производства РНА. Предпочтительные растения включают сельскохозяйственные культуры, такие как хлебные злаки, масличные семена и клубнеплодные растения; более предпочтительно, авокадо, ячмень, свеклы, кормовые бобы, гречиху, морковь, кокос, копру, кукурузу (маис), семя хлопка, тыкву, различные виды чечевицы, фасоль лимскую, просо, фасоль золотистую, овес, масличную пальму, арахис, картофель, тыкву обыкновенную, семя рапса (например, канола), рис, сорго, сою культурную, сахарную свеклу, сахарный тростник, подсолнечник, батат, табак, пшеницу и ямс. Такие генетически изменяемые плодоносящие растения, полезные в способе настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими, яблони, абрикос, банан, мускусную дыню, вишни, различные сорта винограда, кумкват, лимон, лайм настоящий, апельсин, папайю, различные сорта персиков, грушу, ананас, мандарины, томат и арбуз. Предпочтительно, растения подвергают генно-инженерной обработке с получением РНА в соответствии со способами, описанными в статье Poirier, Y. , D. E. Dennis, К. Klomparens и С. Somerville "Polyhydroxybutyrate, a biodegradable thermoplastic, produced in transgenic plants". Science, т. 256, с. 520-523 (1992); в публикации международной заявки на патент 95/05472, Somerville с сотр., опубликованной 23 февраля 1995 г.; и в публикации международной заявки на патент 93/02187, Somerville с сотр. , опубликованной 4 февраля 1993 г. Особенно предпочтительными растениями являются соевые бобы, картофель, кукуруза и кокосовые растения, подвергнутые генно-инженерной обработке для получения РНА; более предпочтительны соевые бобы.

Бактерии, полезные в настоящем изобретении, включают любые генно-инженерные бактерии, предназначенные для производства РНА, а также бактерии, естественно вырабатывающие РНА. Примеры таких бактерий включают те, что описаны в Novel Biodegradable Microbial Polymers, E. A. Dawes ред., NATO ASI Series, Series E: Applied Sciences - т. 186, Kluwer Academic Publishers (1990); в патенте США 5292860, Shiotani и Kobayashi, выданном 8 марта 1994 г., патенте США 5250430, Peoples и Sinskey, выданном 5 октября 1993 г.; патенте США 5245023, Peoples и Sinskey, выданном 14 сентября 1993 г.; патенте США 5229279, Peoples и Sinskey, выданном 20 июля 1993 г.

Экстракция растворителем, облегченная добавлением маргинального нерастворителя для РНА.

Настоящее изобретение относится к способу выделения полигидроксиалканоата (РНА) из биомассы, содержащей РНА, включающему: а) обработку биомассы растворителем РНА и маргинальным нерастворителем для РНА, b) удаление любой нерастворимой биомассы, после которого остается раствор РНА и маргинального нерастворителя, и с) удаление из раствора растворителя РНА, в результате чего образуется суспензия осажденного РНА в маргинальном нерастворителе для РНА. Необязательно, способ дополнительно включает удаление маргинального нерастворителя для РНА, после чего остается РНА. Раствор, образовавшийся на стадии b), состоит из маргинального нерастворителя для РНА, растворенного или диспергированного в растворителе РНА.

Кроме того, настоящее изобретение относится к суспензии и РНА, полученным таким способом.

Предпочтительно растворитель РНА представляет собой ацетон, ацетонитрил, бензол, бутилацетат, бутилпропионат, β-бутиролактон, γ-бутиролактон, сжиженный диоксид углерода, хлороформ, 1,2-дихлорэтан, диэтилкарбонат, диэтилформамид, диметилкарбонат, диметилсукцинат, диметилсульфоксид, диметилформамид, 1,4-диоксан, этилацетат, диацетат этиленгликоля, метилацетат, метилэтилкетон, 1,1,2,2-тетрахлорэтан, тетрагидрофуран, 1,1,2-трихлорэтан, 1,2,3-трихлорпропан, толуол, ксилол или их смеси.

Более предпочтительно растворителем РНА является ацетон, ацетонитрил, γ-бутиролактон, 1,4-диоксан, метилацетат, толуол, метилэтилкетон, этилацетат или их смеси.

В соответствии с более мягким в экологическом отношении способом, растворитель РНА предпочтительно представляет собой ацетон, бутилацетат, этилацетат, метилацетат или их смеси; более предпочтительно ацетон или этилацетат; еще более предпочтительно, ацетон.

Предпочтительно, растворитель РНА используют в способе при повышенной температуре, поскольку, как было установлено, скорость растворения РНА в растворителе РНА при повышенной температуре значительно увеличивается. Хотя экстракция РНА может проводиться при температуре от примерно 20^oС до температуры плавления РНА; более предпочтительно от примерно 20^oС до примерно 80^oС, более предпочтительно от примерно 45^oС до температуры кипения растворителя РНА; и еще более предпочтительно от примерно 50^oС до примерно 60^oС.

Предпочтительно, твердую массу, содержащую РНА, перемешивают в ходе экстракции растворителем РНА, поскольку это также увеличивает скорость растворения РНА.

Удаление растворителя РНА из раствора, содержащего РНА, в результате приводит к окончательному осаждению РНА в виде кристаллического твердого вещества. Однако, в процессе выпаривания растворителя, концентрированный раствор РНА часто образует очень высоковязкую жидкость или, иногда, даже гель, который может чрезвычайно трудно поддаваться обработке. Если раствор содержит маргинальный нерастворитель для РНА, являющийся относительно нелетучим, РНА будет осаждаться после удаления растворителя РНА и образовывать суспензию в маргинальном нерастворителе для РНА.

Пример настоящего изобретения схематически изображен на чертеже. Такой способ позволяет получить преимущества от использования маргинального нерастворителя для РНА (например, масла) для осаждения РНА, даже когда маргинальный нерастворитель для РНА отсутствует в исходной биомассе (например, биомасса на основе немасляничных семян или бактерий). Маргинальный нерастворитель для РНА действует как добавка для способа, препятствующая образованию чрезмерной вязкости или явлению гелеобразования в ходе выпаривания растворителя РНА из биомассы.

Маргинальный нерастворитель для РНА не должен существенно вредить сольватирующей способности растворителя РНА, поскольку он будет смешиваться с растворителем РНА в ходе процесса экстракции. Сам по себе маргинальный нерастворитель для РНА не должен в заметной степени растворять РНА, поскольку растворение РНА будет предотвращать суспензию РНА в виде дискретных частиц. Предпочтительно, маргинальный нерастворитель для РНА является менее летучим (т. е. имеет более низкую температуру кипения), чем растворитель РНА. Такая пониженная летучесть будет обеспечивать более легкое и чистое отделение растворителя РНА. Предпочтительно точка кипения маргинального нерастворителя для РНА по крайней мере примерно на 5^oС выше точки кипения растворителя РНА; более предпочтительно выше по крайней мере на 10^oС, более предпочтительно по крайней мере на примерно 20^oС; еще более предпочтительно выше по крайней мере на 40^oС.

Предпочтительно, маргинальный нерастворитель для РНА представляет собой С₃-С₂₀ спирт, С₁-С₂₀ алкан, жир, нейтральный липид, масло, воду или их смеси.

Предпочтительные алканы включают декан, додекан, гексадекан и октадекан.

Предпочтительные спирты включают гексанол, лауриловый спирт, октанол, олеиловый спирт и стеариловый спирт.

Предпочтительные жиры включают говяжий или бараний жир, сало и воск.

Предпочтительные нейтральные липиды включают моно-, ди- и триглицериды олеиновой кислоты, линолевой кислоты и линоленовой кислоты, лауриловой кислоты, стеариновой кислоты и пальмитиновой кислоты.

Предпочтительные масла включают минеральные масла и растительные масла (например, соевое масло, канола и т.п.).

Предварительно описанные воплощения настоящего изобретения обладают рядом неожиданных преимуществ, включающих возможность исключения образования высоковязкой жидкости или геля РНА, которые иначе могут быть чрезвычайно трудны для обработки. Такой результат достигается проведением экстракции РНА в присутствии маргинального нерастворителя для РНА. Маргинальный нерастворитель для РНА может вначале служить в качестве смешивающегося со-растворителя для промотирования экстракции РНА. Однако, после удаления относительно летучего растворителя РНА, маргинальный нерастворитель для РНА становится эффективной суспендирующей средой для осаждения РНА (в виде дискретных частиц) за счет его ограниченной РНА-сольватирующей способности. По сравнению с концентрированным раствором, суспензия твердого полимера в жидком нерастворителе обычно имеет значительно более низкую кажущуюся вязкость и, таким образом, обладает превосходной способностью к обработке. Устранение серьезной проблемы, связанной с гелеобразованием, часто встречающейся в ходе выпаривания растворителя из концентрированного полимерного раствора, является неожиданным и значительным достижением изобретения.

Другим неожиданным преимуществом настоящего способа является его способность производить суспензии РНА, которые могут использоваться, например, в качестве покрытий, связующих веществ, присадок к краскам, пищевых агентов, адгезивов, а также носителей для красителей, пигментов, биоактивных агентов и отдушек.

Дополнительное неожиданное преимущество обнаружено в некоторых воплощениях настоящего изобретения, в которых реализуется способность экстрагировать кристаллизуемый РНА с высокой температурой плавления (примерно 80^oС или выше) без использования галогенсодержащих растворителей. Относительно экологически безопасные растворители РНА, используемые в таких воплощениях изобретения, такие как ацетон и этилацетат, являются недорогостоящими, безопасными и легко доступными веществами, даже из возобновляемых источников. Такие растворители РНА также рассматриваются как гораздо менее вредные для окружающей среды, особенно озонового слоя земли, по сравнению с галогенсодержащими соединениями, обычно используемыми для экстракции РНА из бактерий.

Кроме того, обнаружение полезности некоторых веществ, используемых в способе изобретения, которые прежде были неизвестны, как полезные в качестве растворителей кристаллических полимеров с относительно высокими температурами плавления, не является тривиальной задачей. В отличие от большинства низкомолекулярных соединений и некристаллизуемых аморфных полимеров, растворимость кристаллических полимеров не может быть предсказана на основании традиционно используемых простых критериев, таких как подобие химической архитектуры или подбор показателей преломления, диэлектрических констант или параметров растворимости. Хорошим примером невозможности предсказать растворимость кристалличных полимеров является хорошо известная нерастворимость линейного полиэтилена в гексане, когда оба соединения состоят из идентичных углеводородных повторяющихся звеньев. Аналогично, такие кристаллические алифатические полиэфиры, как изотактический поли(3-гидроксибутират) и поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерат) в заметной степени нерастворимы в этилацетате или ацетоне, несмотря на то что химические структуры этих соединений могут предполагать некоторое молекулярное сродство. Таким образом, случайное открытие того факта, что кристаллический РНА, содержащий небольшое число ответвлений среднего размера, может легко растворяться в таких растворителях, несомненно является неожиданным.

Следующие ниже примеры дополнительно описывают и демонстрируют предпочтительные воплощения в рамках объема настоящего изобретения. Эти примеры приведены исключительно в целях иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничивающие настоящее изобретение, поскольку возможны многие его варианты, не нарушающие сущность и объем изобретения.

Пример 1.

Экстракция РНА из Aeromonas cavie.

Следующая ниже методика усовершенствует способ выделения РНА из Aeromonas cavie, изложенный в патенте США 5292860, Shiotani и Kobayashi, выданном 8 марта 1994 г. Ферментационную загрузку Aeromonas cavie центрифугируют, промывают водой и метанолом и сушат в вакууме с получением 120 г сухих клеток. Затем сухую клеточную биомассу помещают в закрытый контейнер со смесью, состоящей из 800 мл хлороформа и 200 мл додекана, на 5 ч при 50^oС. Затем нерастворимую твердую биомассу удаляют с использованием фильтра из проволочной сетки. Затем из смеси удаляют хлороформ при пониженном давлении при 50^oС и собирают с помощью охлаждаемого водой холодильника для дальнейшего использования. Удаление хлороформа приводит к образованию суспензии, содержащей твердые хлопья поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксигексаноата), диспергированных в оставшемся додекане. Хлопья отделяют из додекана с использованием мелкоячеистого фильтра, быстро промывают охлажденным хлороформом и сушат с получением 7 г поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксигексаноата).

Пример 2.

Экстракция РНА из Alcaliqenes eutrophus.

Следующая ниже методика усовершенствует способ выделения РНА из Alcaligenes eutrophus, описанный в патенте США 4562245, Stageman, выданном 31 декабря 1985 г. Высушенные распылением клетки Alcaligenes eutrophus, содержащие поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерат), нагревают с обратным холодильником в метаноле в течение 15 мин при атмосферном давлении с целью удаления растворимых липидов. Клетки сушат на поддоне при 30^oС в туннеле с подачей воздуха. 10 г высушенных клеток нагревают с обратным холодильником со смесью, состоящей из 250 мл хлороформа и 50 мл гексадекана, при атмосферном давлении в течение 30 мин для экстракции поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерата). Полученные в результате суспензии фильтруют для удаления клеточных остатков. Затем при пониженном давлении из экстракционного раствора удаляют хлороформ, в результате чего остается суспензия крепких твердых хлопьев поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерата), диспергированных в гексадекане. Затем хлопья собирают путем слива гексадекана с получением 6,2 г поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерата).

Пример 3.

Экстракция РНА из Pseudomonas cepacia.

Следующая методика является усовершенствованием способа выделения РНА из Pseudomonas cepacia, описанного в международной заявке на патент 92/18553, опубликованной 29 октября 1992 г. Клетки Pseudomonas cepacia, содержащие сополимер, состоящий, главным образом, из 3-гидроксиоктаноата, центрифугируют, декантируют и повторно суспендируют четырежды в воде, после чего сушат вымораживанием. 10 г высушенных клеток нагревают с обратным холодильником со смесью из 250 мл ацетона и 50 мл 1-гексанола при атмосферном давлении в течение 20 мин для экстракции 3-гидроксиоктаноатного сополимера. Полученные в результате суспензии фильтруют для удаления клеточных остатков. Затем при пониженном давлении из экстракционного раствора удаляют ацетон, в результате чего остается суспензия гибких твердых частиц 3-гидроксиоктаноатного сополимера, диспергированных в 1-гексаноле. После этого хлопья собирают путем сливания гексадекана с получением 4,8 г сополимера.

Пример 4.

Экстракция РНА из картофеля.

60 г трансгенного картофеля (полученного, например, по способу, описанному в международной заявке на патент 95/05472, Somerville с сотр., опубликованной 23 февраля 1995 г. ; или в международной заявке на патент 93/02187, Somerville с сотр. , опубликованной 4 февраля 1993 г., образец, содержащий поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксигептаноат), содержащего 7,5% 3-гидроксигептаноатных повторяющихся звеньев, помещают в закрытый контейнер, в который загружают 600 мл ацетона и 150 мл растительного масла, и содержимое перемешивают в течение 3 ч при 55^oС. Затем ацетоновый раствор, содержащий масло и РНА, сливают из картофеля с использованием фильтра из проволочной сетки. Экстракционный раствор, содержащий растительное масло, поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксигептаноат) и ацетон, помещают в обогреваемый паром аппарат с целью выпаривания летучего ацетона, который собирают с помощью охлаждаемого водой холодильника. После удаления ацетона твердые хлопья поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксигептанотата) появляются в оставшемся масле, которое сливают с использованием мелкоячеистого фильтра с получением 7 г чистого растительного масла. Полимерные хлопья промывают холодным ацетоном, предварительно собранным холодильником, с целью удаления остаточного увлеченного масла, и затем сушат с получением 6 г кристаллического твердого поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксигептаноата). Ацетон, используемый для промывки, объединяют с растительным маслом и затем используют для дальнейшей экстракции поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксигептаноата).

Все публикации, выданные патенты и заявки на патенты, упомянутые выше, во всей их полноте, включены в описание в качестве ссылок.

Следует понимать, что примеры и воплощения описаны лишь в целях иллюстрации и что специалисту в данной области, на их основании, могут быть предложены различные модификации или изменения, которые должны входить в настоящую заявку в части ее смысла и области, а также объем прилагаемой формулы изобретения.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ выделения полигидроксиалканоата (РНА) из биомассы включает: (а) обработку биомассы растворителем РНА и маргинальным нерастворителем для РНА; (b) удаление любой нерастворимой биомассы, в результате чего остается раствор РНА и маргинального нерастворителя для РНА, и (с) удаление растворителя РНА из раствора, в результате чего образуется суспензия осажденного РНА в маргинальном нерастворителе для РНА. Необязательно способ включает удаление маргинального нерастворителя для РНА, после которого остается РНА. Изобретение также относится к суспензии РНА, полученному таким способом. Таким образом, способ позволяет легко к экономично получить PHA. 3 с. и 6 з.п.ф-лы, 1 ил.

1. Способ выделения полигидроксиалканоата из биомассы, содержащей полигидроксиалканоат, характеризующийся: а) обработкой биомассы растворителем полигидроксиалканоата и маргинальным нерастворителем для полигидроксиалканоата; b) удалением нерастворимой биомассы, в результате чего остается раствор полигидроксиалканоата и маргинального нерастворителя для полигидроксиалканоата; указанный маргинальный нерастворитель представляет вещество, которое является само по себе нерастворителем для полигидроксиалканоата, и указанный маргинальный нерастворитель становится способным растворять полигидроксиалканоат при смешивании с растворителем, и с) удалением из раствора растворителя полигидроксиалканоата, в результате чего образуется суспензия осажденного полигидроксиалканоата в маргинальном нерастворителе для полигидроксиалканоата. 2. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся удалением маргинального нерастворителя для полигидроксиалканоата, после чего остается полигидроксиалканоат. 3. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором растворитель полигидроксиалканоата выбирают из группы, состоящей из ацетона, ацетонитрила, бензола, бутилацетата, бутилпропионата, β-бутиролактона, γ-бутиролактона, сжиженного диоксида углерода, хлороформа, 1,2-дихлорэтана, диэтилкарбоната, диэтилформамида, диметилкарбоната, диметилсукцината, диметилсульфоксида, диметилформамида, 1,4-диоксана, этилацетата, диацетата этиленгликоля, метилацетата, метилэтилкетона, 1,1,2,2-тетрахлорэтана, тетрагидрофурана, 1,1,2-трихлорэтана, 1,2,3-трихлорпропана, толуола, ксилола и их смесей. 4. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором маргинальный нерастворитель для полигидроксиалканоата выбирают из группы, состоящей из С₃-С₂₀ спирта, С₁-С₂₀ алкана, жира, нейтрального липида, масла, воды и их смесей. 5. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором биомасса представляет собой бактерии или растительный материал. 6. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором полигидроксиалканоат содержит повторяющееся звено

где R предпочтительно представляет собой Н, алкил или алкенил;
m = 1-4. 7. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором полигидроксиалканоат содержит, по крайней мере, два статистически повторяющихся мономерных звена, причем первое статистически повторяющееся мономерное звено имеет структуру

где R¹ представляет собой Н или С₁-С₂ алкил;
n = 1 или 2,
второе статистически повторяющееся мономерное звено имеет структуру

где R² представляет собой С₃-С₁₉ алкил или С₃-С₁₉ алкенил и где, по крайней мере, 50% статистически повторяющихся мономерных звеньев имеют структуру первого статистически повторяющегося мономерного звена. 8. Суспензия осажденного полигидроксиалканоата в маргинальном нерастворителе для полигидроксиалканоата, выделенная способом по любому из пп. 1, 3-7. 9. Полигидроксиалканоат, содержащий повторяющееся звено

где R предпочтительно представляет собой Н, алкил или алкенил;
m = 1-4,
выделенный способом по любому из пп. 1-7.