СПОСОБ ИНДУКЦИИ РАССАСЫВАНИЯ ОБРАЗОВАВШИХСЯ РУБЦОВ ИЛИ ФИБРОЗНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ В КРОВЕНОСНЫХ СОСУДАХ ИЛИ В СОСУДИСТОЙ СЕТИ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО Российский патент 2003 года по МПК A61K31/737 A61P9/00 

1. Область изобретения
Изобретение относится к способам и фармацевтическим композициям, применяемым для лечения хронических прогрессирующих сосудистых заболеваний.

2. Описание предшествующего уровня знаний
Хроническое прогрессирующее сосудистое заболевание (ХПСЗ) является осложнением некоторых наиболее обычных болезней, поражающих развитое общество, в том числе сахарного диабета, гипертензии, различных гиперлипидемий и т.п. Современные терапевтические способы воздействия, решающие проблемы ХПСЗ, нацелены на лежащие в их основе причины. К сожалению, для большей части ХПСЗ не существует способов лечения или их контроль является очень трудно осуществимым в общей массе населения. Кроме того, ХПСЗ часто является не только хорошо развившимся, но и далеко зашедшим (прогрессирующим) ко времени, когда лежащая в его основе причина становится объектом внимания медиков. Таким образом, остается лишь пытаться лечить вторичные осложнения, среди которых ХПСЗ является наиболее серьезным, поскольку оно ведет к почечной недостаточности, мозговым кровоизлияниям, сердечным болезням и слепоте.

Как правило, ХПСЗ характеризуется изменением в клетках гладких мышц сосудов. Одним из основных изменений является увеличение количества и изменение типов соединительной ткани, которую они синтезируют. Это приводит к рубцеванию и заметным изменениям функции. В кровеносных сосудах это приводит к потере эластичности, что ведет к тому, что сосуды не растягиваются и не сокращаются и имеют утолщенные стенки и суженные просветы. Конечным результатом является уменьшенный кровоток или полная его блокада. Примерами сосудистых заболеваний, характеризующихся этими патофизиологическими процессами, являются хроническое прогрессирующее гломерулярное заболевание, например вызываемый диабетом гломерулосклероз (рубцевание); прогрессирующая почечная недостаточность после трансплантации почек; окклюзия шунтов, применяемых для обеспечения доступа к сосудам у больных с конечной стадией почечной недостаточности, подвергаемых лечению посредством гемодиализа; другие хронические заболевания малых кровеносных сосудов (например, у некоторых больных с гипертензией); рецидив стеноза у больных, подвергнутых коронарному шунтированию и диабетическая ретинопатия.

Терапевтической целью любого способа лечения для ХПСЗ должно быть уменьшение уже образованного избытка экстрацеллюлярного матрикса (рубцевания) для восстановления нормальной проходимости сосудов и функции. Однако в настоящее время нет прямого способа противодействия нарушениям в метаболизме ткани гладких мышц или модулирования синтеза соединительной ткани, несмотря на их важность в хроническом прогрессирующем заболевании. Прогрессирование подобных заболеваний считается как неизбежным, так и необратимым.

Было обнаружено, что гепарин и некоторые его аналоги ингибируют пролиферацию клеток гладких мышц (см., например, Castellot et al., J.Cell Biol., 102: 1979-1984, 1986). Однако эти открытия применялись только для предотвращения сосудистых заболеваний, как правило, с использованием парентерального введения, но не для лечения и обратного развития установленных повреждений. Поскольку менее 50% больных подвержены опасности развития ХПСЗ и невозможно предсказать, кто из них действительно подвергнется этим заболеваниям и как быстро эти заболевания будут прогрессировать, профилактическая терапевтическая стратегия является непригодной. Кроме того, ежедневные инъекции для доставки лекарственных средств, кроме жизненно необходимых лекарственных средств (таких как инсулин), являются неприемлемыми для большинства больных. Поэтому особенно важно разработать режим лечения для ХПСЗ, предпочтительно с применением перорального введения фармацевтического средства низкой токсичности, которое эффективно в лечении и обратном развитии ХПСЗ посредством обратного развития и деградации развившихся повреждений.

Пентозанполисульфат (ППС) представляет собой высокосульфатированный полусинтетический полисахарид с молекулярной массой в диапазоне от приблизительно 1500 до 6000 дальтон в зависимости от способа выделения. ППС может находиться в том же самом общем классе, что и гепарины и гепариноиды, но имеется ряд различий в химической структуре, способах образования производных и физико-химических свойствах между ППС и гепарином. В то время как гепарин обычно выделяют из тканей млекопитающих, таких как говяжьи и свиные мышцы, печень и кишечник, ППС является полусинтетическим соединением, полисахаридный каркас которого - ксилан экстрагируют из коры бука или других растительных источников и затем обрабатывают сульфатирующими агентами, такими как хлорсуль-фоновая кислота или сульфурилтрихлорид и кислота. После сульфатирования ППС обычно обрабатывают гидроксидом натрия с получением соли натрия.

Как иллюстрируется следующими формулами,


гепарин представляет собой сульфатированный полимер повторяющихся двойных сахарных мономеров, (D)-глюкозамина и (D)-глюкуроновой кислоты (оба являются 6-углеродными гексозными сахарами) с аминогруппой на глюкозамине; ППС представляет собой сульфатированный линейный полимер повторяющихся одиночных мономеров (D)-ксилозы, 5-углеродного пентозного сахара в форме его пиранозного кольца. В то время как гепарин вращает плоскополяризованный свет в направлении правого вращения, ППС вращает свет в направлении левого вращения.

Что касается биологических свойств, ППС пролонгирует парциальное тромбопластиновое время и он был использован для предотвращения глубокого венозного тромбоза, однако он имеет только приблизительно одну пятнадцатую антикоагулянтной активности гепарина (см. для общего сведения Wardle, J.Int. Med.Res., 20:361-370, 1992). Было обнаружено, что ППС применим в лечении инфекций мочевых путей и интерстициального цистита (U.S. Pat. N 5180715) и в сочетании с ангиостатическим стероидом - в задержке развития кровеносных сосудов и капилляров, подтекания клеток или мембран (U.S. Pat. N 4820693).

Некоторые исследования показали, что ППС ингибирует пролиферацию клеток гладких мышц и уменьшает гиперлипидемию, и на этом основании предположили, что ППС может быть профилактически применим в ограничении атеросклеротического образования тромбоцитов, ингибировании пролиферации мезангиальных клеток и предотвращении образования коллагена и гломерулосклероза (Paul et al., Thromb.Res. 16:793-801, 1987; Wardle, ibid). Однако никто ранее не считал, что он пригоден для обращения развития рубцевания сосудов, т. е. ППС не рассматривался в этом контексте.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Цели изобретения
Целью данного изобретения является обеспечение способа лечения ХПСЗ не только для задержки развития болезни, но и для фактического обратного хода заболевания и обеспечения регресса существующего рубцевания или повреждений. Следующей целью данного изобретения является обеспечение способа лечения с использованием коммерчески доступного фармацевтического средства, которое можно вводить общепринятыми способами, которое является нетоксичным и не индуцирует серьезных побочных эффектов и является высокоэффективным в лечении ХПСЗ.

2. Краткое описание изобретения
В соответствии с этими целями и другими целями, которые станут очевидными в дальнейшем, данное изобретение заключается, вкратце, в способе лечения больного-млекопитающего, страдающего от ХПСЗ, для остановки прогрессирования заболевания и индуцирования рассасывания уже образованных рубцов или фиброзных образований в пораженном органе или сосудистой сети, причем этот способ состоит во введении больному фармацевтической композиции, содержащей эффективное для лечения сосудистого заболевания количество пентозанполисульфата или его фармацевтически приемлемой соли. Пероральное введение ППС, например, в форме таблеток, капсул или жидкостей является предпочтительным способом введения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
Фиг. 1 показывает количественное определение мРНК коллагена α₁IV при помощи конкурентной ПЦР на 1/10 клубочка из нормальной пятинедельной мыши (как описано в Примере 1 ниже) с изображением:
а) в верхней части - схемы реакции и соответствующего окрашенного этидийбромидом геля после ПЦР-амплификации;
и
b) в нижней части графического построения - отношения мутантной кДНК коллагена на клубочек в зависимости от количества мутантной кДНК, помещенного в каждую из девяти пробирок, содержащих все реагенты ПЦР.

Фиг.2 изображает:
a) в ее верхней части - окрашенные РАS срезы почки из двух образцов нефрэктомии с раком почки (А - гистология нормального клубочка; В - выраженный склероз);
b) в средней части (C-D) - иммунофлуоресцентную микроскопию, антитела к коллагену типа IV в тех же самых почках; и
с) в нижней части (Е) - диаграмму в виде столбцов, показывающую индекс склероза в тех же самых почках; кДНК коллагена α₂IV определяли количественно при помощи конкурентной ПЦР в пулах из 50 микропрепарированных клубочков (величины: 145±22 против 1046±74•10-4 attomoles/ клубочек).

Фиг. 3 является диаграммой в виде столбцов, изображающей индекс склероза в почках пяти больных людей без гломерулосклероза по сравнению с пятью больными со склерозом, выраженный в виде относительных количеств гломерулярных клеток и в виде уровней кДНК коллагена α₂IV.
Фиг. 4 является диаграммой в виде столбцов, изображающей отношения мРНК коллагенов α₂α₃IV из больных людей с мембранозным гломерулонефритом (MN) и диабетической нефропатией (DM) и из нефрэктомий с гломерулосклерозом(NX GS) и без гломерулосклероза (NX N 1).

Фиг. 5 является диаграммой в виде столбцов, изображающей действие ППС на синтез ДНК в нормальных мезангиальных клетках, определенный по включению меченного тритием тимидина (24 часа инкубации) и представленный в виде количества импульсов в минуту на 10³ клеток против концентрации ППС в мкг/мл.

Фиг. 6 является диаграммой в виде столбцов, изображающей действие ППС на клеточный рост в нормальных мезангиальных клетках, построенной в виде числа клеток после трех дней инкубации против добавленной концентрации ППС в мкг/мл.

Фиг. 7 является диаграммой в виде столбцов, изображающей сравнение действий ППС и гепарина (с необработанной контрольной группой) на клеточный рост в нормальных мезангиальных клетках после трех и пяти дней инкубации.

Фиг. 8 является диаграммой в виде столбцов, изображающей пролиферацию нормальных мезангиальных клеток во времени в клетках, инкубированных с сывороткой и ППС, в сравнении с контрольными клетками, инкубированными только с сывороткой.

Фиг. 9 является таблицей величин мРНК из слоев нормальных мезангиальных клеток, экспонированных с ППС (100 мкг/мл) в течение различных периодов времени и обратнотранскрибированных, отражающих увеличение, уменьшение или отсутствие изменения в уровнях мРНК коллагенов α₁IV и α₁I, мРНК коллагеназ (металлопротеиназ) 72 кДа и 92 кДа мРНК фактора роста TGF-β и мРНК клеточного белка β-актина.

Фиг. 10 является диаграммой в виде столбцов, изображающей индекс гломерулярного мечения (в процентах меченых клеток) в почечных клубочках GH-трансгенных мышей, которым вводили ППС с водой для питья, по сравнению с клубочками из контрольных мышей, получавших необработанную воду.

Фиг.11 изображает результаты конкурентных ПЦР-анализов с различными типами коллагена, коллагеназами и гликопротеинами базальной мембраны в клубочках получавших ППС GH-трансгенных мышей, полученные с использованием лазерного денситометра.

Фиг. 12 изображает результаты конкурентных ПЦР-анализов с различными факторами роста и белками актина в клубочках получавших ППС GH-трансгенных мышей, полученные с использованием лазерного денситометра.

Фиг. 13 является диаграммой в виде столбцов, изображающей сравнение относительных количеств мРНК коллагена α₁IV, выделяемых клубочками GH-трансгенных мышей, которым вводили ППС в воде для питья, с контрольной группой необработанных (не получавших ППС) мышей.

Фиг.14 является диаграммой в виде столбцов, изображающей сравнение относительных количеств мРНК ламинина В₁,выделяемых клубочками (а) четырех GH-трансгенных мышей, получавших ППС в воде для питья (2 в течение двух недель и 2 в течение 4 недель), b) контрольной группы необработанных мышей и с) двух мышей, получавших ППС в течение 4 недель.

Фиг.15 является диаграммой в виде столбцов, изображающей сравнение относительных количеств мРНК тромбоцитарного фактора роста PDGF-B, выделяемых клубочками GH-трансгенных мышей, которым вводили ППС в воде для питья, с группой необработанных (не получавших ППС) мышей.

Фиг.16 является диаграммой в виде столбцов, изображающей сравнение относительных количеств мРНК фактора роста TGF-β, выделяемых клубочками GH-трансгенных мышей, которым вводили ППС в воде для питья, с группой необработанных мышей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к способу лечения пациента-млекопитающего, страдающего от хронического прогрессирующего сосудистого заболевания (ХПСЗ), характеризующегося рубцеванием и/или фиброзом пораженного органа или сосудистой сети, для остановки прогрессирования этого заболевания и индукции рассасывания уже образованных рубцов и фиброзных образований. Рассматриваемый способ состоит во введении больному фармацевтической композиции, содержащей эффективное для лечения сосудистого заболевания количество пентозанполисульфата (ППС) или его фармацевтически приемлемой соли.

К заболеваниям, которые можно лечить в соответствии с новым способом, относятся, но не ограничены ими, хроническое прогрессирующее заболевание почечных крубочков, в том числе индуцируемый диабетом гломерулосклероз (рубцевание); прогрессирующая почечная недостаточность после трансплантации почек; окклюзия шунтов, применяемых для обеспечения доступа к сосудам, у больных с конечной стадией болезни почек, подвергаемых лечению посредством гемодиализа; другие хронические заболевания малых кровеносных сосудов (например, у некоторых больных с гипертензией); рецидив стеноза у больных, подвергнутых коронарному шунтированию и диабетическая ретинопатия.

Фраза "эффективное для лечения сосудистого заболевания количество" в применении здесь относится к количеству ППС или его соли, включенному в фармацевтическую композицию, которое эффективно при введении один или несколько раз в день в течение предписанного периода времени в остановке и обратном развитии прогрессирующих симптомов ХПСЗ, характеризующегося рубцеванием. В случае больных людей общая суточная доза от около 50 до около 1200 мг и более предпочтительно от около 100 до около 600 мг, ППС, вводимая в виде 1-4 поровну разделенных доз, является эффективной в достижении терапевтической цели лечения и обратного развития ХПСЗ. В более мелких млекопитающих диапазон доз может быть снижен в соответствии с весом тела, видом животного и характером патологического состояния. Однако данное изобретение не ограничено в отношении какого-либо специфического диапазона доз ППС, а вместо этого включает в себя в общем введение ППС в качестве активного фармацевтического агента для лечения ХПСЗ у млекопитающих.

Предпочтительным вариантом нового способа лечения является введение больному фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество ППС и по меньшей мере одного фармацевтически приемлемого инертного ингредиента. Композиция может быть в любой стандартной фармацевтической дозированной форме, но предпочтительно в перорально вводимой дозированной форме.

Дозированные формы для пероральной доставки могут представлять собой обычные таблетки, таблетки с оболочкой, капсулы или миникапсулы, таблетки, капсулы или миникапсулы с замедленным высвобождением активного начала, лепешки, жидкости, эликсиры или любая другая дозированная форма для перорального введения, известная в фармацевтике.

В качестве фармацевтически приемлемых инертных ингредиентов рассматриваются наполнители, связующие вещества, растворители и т.д., которые не препятствуют активности ППС в лечении ХПСЗ. Могут быть также использованы, если желательно, такие наполнители, как глины и кремнийсодержащая земля (кремнезем), для придания требуемого размера дозированной форме.

Дальнейшие ингредиенты, такие как заполнители и носители, могут быть необходимыми для придания желательных физических свойств дозированной форме. Такими физическими свойствами являются, например, скорость высвобождения, структура и размер. Примерами заполнителей и носителей, применимых в пероральных дозированных формах, являются воски, такие как пчелиный воск, касторовый воск, гликовоск и воск карнаубы, целлюлозные соединения, такие как метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, ацетатфталат целлюлозы, гидроксипропилцеллюлоза и гидроксипропилметилцеллюлоза, поливинилхлорид, поливинилпирролидон, стеариловый спирт, моностеарат глицерина, соединения метакрилата, такие как полиметакрилат, метилметакрилат и этиленгликольдиметакрилат, полиэтиленгликоль и гидрофильные камеди.

Желательно, чтобы в композициях данного изобретения активный ингредиент ППС присутствовал в количестве между приблизительно 50 и приблизительно 300 мг на стандартную дозу. Точная доза, вводимая каждому пациенту, будет зависеть от состояния, которое подвергается лечению, и физических характеристик пациента, таких как возраст и вес тела.

Активным фармацевтическим ингредиентом может быть ППС или его фармацевтически приемлемая соль, например натриевая соль. Одной из предпочтительных пероральных дозированных форм для использования в способе данного изобретения являются желатиновые капсулы Elmiron^R (Baker Norton Pharmaceuticals, Inc., Miami, Florida), которые содержат 100 мг натриевой соли ППС и в качестве наполнителей - микрокристаллическую целлюлозу и стеарат магния.

Хотя пероральный путь введения является предпочтительным, данный способ лечения включает также введение ППС или его соли парентеральным, трансдермальным способами, через слизистую оболочку или другими способами введения, известными и обычно применяемыми в области медицины и фармацевтики. Подобным образом композиции данного изобретения могут включать ППС в фармацевтически приемлемых парентеральных, трансдермальных, трансмукозных или других общепринятых носителях и дозированных формах вместе с пригодными инертными растворителями, наполнителями и добавками. Много примеров таких фармацевтически приемлемых носителей можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences (17th edition (1985)) и других стандартных руководствах. Какой бы путь введения или тип фармацевтической дозированной формы не использовали, диапазон доз для ППС в качестве активного ингредиента равен от приблизительно 50 до приблизительно 1200 мг/день и предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 600 мг/день, хотя при парентеральном введении, возможно, приемлемыми были бы дозовые количества, приближающиеся к нижней границе этого диапазона.

Фармацевтические композиции, применяемые в способе данного изобретения, могут включать активные ингредиенты, иные, чем ППС или соль ППС, например другие агенты, которые могут быть ценными в лечении ХПСЗ.

Новый способ делает возможным удобное, безопасное и эффективное лечение пациентов, страдающих от различных форм ХПСЗ, которые во многих случаях могут быть угрожающими для жизни или для органа. При помощи обсуждаемого способа фармацевтический агент, имеющий доказанную низкую токсичность и низкую частоту побочных эффектов, может быть использован не только для остановки неумолимого, как считали ранее, прогрессирования хронического сосудистого заболевания, но и для фактической деградации уже образованных рубцов и повреждений для восстановления нормального раскрытого состояния сосудов и функции.

Следующие далее примеры включают (а) описания экспериментов, уже опубликованных в медицинской литературе, которые подтверждают возможность использования некоторых способов конкурентной ПЦР (полимеразной цепной реакции) для определения количества мРНК коллагена рубцового типа и родственных факторов в клубочках и которые демонстрируют, что относительные количества гломерулярных клеток не коррелируют с уровнями коллагена рубцового типа, и (b) эксперименты, проведенные заявителями или под руководством заявителей, которые демонстрируют in vitro u in vivo эффективность ППС в отрицательной регуляции образования коллагена рубцового типа и факторов роста клеток и положительной регуляции активности коллагеназы в отношении деградации существующих отложений коллагена рубцов. Однако эти примеры не предназначены для изложения материалов, способов или диапазонов доз, которые должны быть использованы в практике данного изобретения или для какого-либо ограничения изобретения.

ПРИМЕР 1
Определение количества коллагена
Как описано в Peten et al., Am.J.Physiol., 32: F951-957 (1992), коллаген α₁IV и α₂IV в мышиных почечных клубочках может быть определен количественно следующим способом: определенное количество кДНК, представляющее мРНК в 1/10 клубочка из нормальной пятинедельной мыши, и стандартное количество праймеров коллагена α₁IV и α₂IV добавляли к каждой из нескольких пробирок, содержащих все реагенты ПЦР из набора для амплификации ДНК GeneAmp (Реrkin-Elmer Cetus, Norwalk, Connecticut). Серийные разведения мутированной кДНК, содержащей либо новый сайт расщепления рестриктазой, либо делецию, добавляли к этой смеси перед амплификацией (схема, показанная в верхней части Фиг.1). Концентрации мутанта определяли в предварительном эксперименте, спланированном для включения в него зоны эквивалентности (y=1).

После ПЦР-амплификации всю реакционную смесь наносили непосредственно на 4% агарозный гель (NuSieve:Seakem (3:1) (FMS Bioproducts, Rockland, ME) в приборе для гелей Н5 Horizon (Life Technologies) и подвергали электрофорезу. Полосы ДНК визуализировали окрашиванием этидийбромидом и трансосвещением ультрафиолетовым светом. Были сделаны фотографии с позитивной/негативной пленками 55 Поляроида (Polaroid, Cambridge, МА) (см. среднюю часть Фиг.1). Негативы гелей сканировали при помощи одномерной лазерной денситометрии для конкурентных ПЦР-анализов (Shimadzu; Scientific Instruments, Columbia, MD).

Рассчитывали денситометрические величины тест-полосы и мутантной полосы (полос), и их отношение для каждой реакционной пробирки строили в виде графика в зависимости от количества добавленной мутантной матрицы (нижняя часть Фиг. 1). Для мутанта коллагена α₂IV измеренную интенсивность денситометрической полосы корректировали при помощи фактора 562/479 перед построением отношения мутант/тест-полоса. Для полос мутанта α₁IV их денситометрические величины прибавляли перед делением на величину полосы дикого типа (тест-полосы). Была начерчена прямая линия с применением линейного регрессионного анализа. Было рассчитано, что количество кДНК в тест-пробе равнялось количеству, при котором отношение плотность полосы мутанта/плотность тест-полосы было равно 1. Конкуретные ПЦР-анализы проводили в двух или трех повторностях.

ПРИМЕР 2
Изменения в склеротических клубочках
Как описано в Peten et al., Exp.Med., 176:1571-1576 (1992), пациенты-люди получали образцы односторонней нефрэктомии с раком почек. Пациенты не имели в анамнезе диабета, гипертензии или других системных заболеваний, связанных с гломерулярным заболеванием. Пробы кортикальной ткани, удаленной от явной опухоли, помещали в фиксатор Карноя, заливали в метакрилат или парафин и срезы окрашивали периодной кислотой-реактивом Шиффа (РАS). Присутствие гломерулосклероза, определяемое как расширение мезангиального матрикса, оценивали независимо гистологическим исследованием окрашенного РАS материала (верхняя часть Фиг.2) и иммунофлуоресцентной микроскопией замороженных срезов после экспонирования с антителами к коллагену типа IV (РНМ-12, Silenus, Westbury, NY) (средняя часть Фиг.2).

Конкурентный ПЦР-анализ проводили, как описано в Примере 1, для определения количества коллагена экстрацеллюлярного матрикса α₂IV (рубцового типа). Определяли относительные концентрации коллагена этого типа в клубочках, для которых предварительно было определено, являются ли они нормальными или склеротическими, как показано в нижней части Фиг.2.

Относительные количества клеток в клубочках пяти пациентов без гломерулосклероза (нормальных) сравнивали с пятью пациентами, имеющими склероз. Как изображено в Фиг.3, различие между группами в относительном количестве гломерулярных клеток не было значимым (Р>0,8), тогда как для уровней кДНК коллагена α₂IV различие было статистически значимым (0,01<Р<0,025).

ПРИМЕР 3
Сравнительные отношения мРНК коллагена в клубочках из нормальных и больных почек
С использованием методологии, описанной в Примерах 1 и 2, определяли количественно сравнительные отношения мРНК коллагенов α₂/α₃IV в клубочках, взятых из диагностических биопсий пациентов с мембранозным гломерулонефритом (MN) и диабетической нефропатией (DM) и из нефрэктомий с гломерулосклерозом (NX GS) и без гломерулосклероза (NX N1). Как изображено в Фиг.4, отношения мРНК коллагенов α₂/α₃IV были значимо выше в DM и в NS GS, чем в NX N1(**P= 0,0002, *Р=0,02).

ПРИМЕР 4
Исследование А
Построение эксперимента:
Нормальные мезангиальные клетки (8) высевали в базальную среду плюс 20% плодная телячья сыворотка (Gibco, Grand Island, NY) в 24-луночных планшетах (Nunc, PGC Scientific Corp. , Gaithersburg, MD) при плотности 2-2,5•10⁴ клеток на лунку. При 24 часах среду выбрасывали, клетки промывали дважды при помощи РВS и инкубировали в течение 24-72 ч в бессывороточной среде с 0,1% бычьим сывороточным альбумином (RIA grade, Sigma). Среду заменяли свежей базальной средой плюс 20% плодная телячья сыворотка с или без 5-100 мкг/мл ППС или для сравнения со стандартным гепарином (100 мкг/мл). Клетки в лунках с двумя повторностями трипсинизировали и считали в цитометре Elzone^R (Particle Data Inc. , Elmhurst, IL) в дни +3 и +5. В параллельных лунках определяли включение тимидина путем добавления 1 мкКи на лунку [³H]-тимидина ([метил-³H] -тимидина); 2,0 Ки/мМ; DuPont NEN, Boston, МА). Количество определяли в день 1 или в день 3.

Результаты:
В первый день (24 часа) максимум эффекта в зависимости от дозы выходил на плато при 50 мкг/мл (Фиг.5), тогда как на третий день максимальную ингибиторную реакцию отмечали при 25 мкг/мл (Фиг.6).

Сравнение между вариантом без добавления (контроль) и вариантом с гепарином (100 мкг/мл) и ППС (100 мкг/мл) обнаруживает, что на молярной основе ППС примерно вдвое сильнее, чем нативный гепарин (Фиг.7). Ответные реакции являются вполне воспроизводимыми (столбики ошибок очень близки).

Суммирующий график (Фиг.8) сравнивает действие ППС, добавленного к сыворотке, с контрольными клетками, которые экспонировались только с сывороткой.

Исследование В
Слои нормальных мезангиальных клеток экспонировали с ППС (100 мкг/мл) в течение различных периодов времени и проводили обратную транскрипцию. Уровни мРНК измеряли для выбранных молекул в первый день и сравнивали с уровнями на 3-ий день и на 5-ый день (см. Фиг.9). Не было изменений в мРНК коллагена типа IV, мРНК коллагена типа Т существенно уменьшалась в количестве, мРНК TGF-β уменьшалась на 50% и активность фермента 92 кДа увеличивалась больше чем на 50%. Контролем был β-актин, который был неизмененным, что согласовалось с отсутствимем пролиферации в обработанных клетках.

ПРИМЕР 5
Исследования с ППС на животных
Построение эксперимента
12-20-недельные GH-трансгенные животные были идентифицированы ПЦР-анализом экстрагируемого с детергентом материала из хвостовых биопсий с использованием специфических праймеров для кДНК бычьего гормона роста, которые не реагируют перекрестно с последовательностью мыши GН. 4 мыши GH получали перорально ППС в воде для питья (2 в течение двух недель и 2 в течение 4 недель) и четыре мыши GH того же возраста получали водопроводную воду в течение таких же периодов времени. Количество ППС в воде для питья (500 мг/мл) рассчитывали таким образом, чтобы каждая мышь получала эквивалент 50 мк ППС в день.

Выделение клубочков и обратная транскрипция in situ
Клубочки выделяли микропрепарированием в присутствии ингибиторов РНКазы. Левую почку перфузировали солевым раствором, а затем раствором коллагеназы, содержащим растворимые ингибиторы РНКазы. Нижний полюс удаляли перед перфузией коллагеназы и моментально замораживали на сухом льду для зимографии. После коллагеназного расщепления 40-60 клубочков выделяли при 4^oС в присутствии ванадилрибонуклеозидного комплекса для обратной транскрипции (RT). Обратную транскрипцию in situ выполняли, как описано выше, за исключением того, что клубочки подвергали замораживанию-оттаиванию один раз в смеси ацетона с сухим льдом и обрабатывали ультразвуком при 2^oС в течение 5 минут в присутствии 2% Тритона и 4 единиц/мкл ингибитора РНКаз из плаценты человека (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) перед добавлением компонентов для обратной транскрипции (RT). Ультразвуковой микродезинтегратор клеток (Kontes, Vineland, NJ) использовали для охлаждения проб во время обработки ультразвуком.

Стандартный и конкурентный ПЦР-анализы
Праймеры для мРНК мышиного коллагена α₁IV и коллагена α₁I, актина клеток гладких мышц, β-актина, ламинина В1, тенасцина, мРНК металлопротеиназ 92 кДа и 72 кДа и для геномной ДНК бычьего гормона роста синтезировали на PCR-Mate (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Идентичность каждого амплифицированного продукта подтверждали анализом размера и рестрикционным ферментативным анализом. Специфичность праймера для мРНК определяли путем исключения фермента обратной транскриптазы. ПЦР проводили с использованием набора для амплификации ДНК GeneAmp (Perkin Elmer Cetus, Norfolk, CT). кДНК, полученные из пула 40-60 клубочков на мышь, первоначально анализировали при помощи стандартной ПЦР с применением логарифмической-линейной части ПЦР-амплификации. Это делало возможной быструю, неколичественную оценку уровней мРНК. После этого использовали конкурентные ПЦР-анализы для измерения кДНК коллагена PDGF-B, α-актина клеток гладких мышц, β-актина и кДНК ламинина В1 путем конструирования мутанта кДНК для каждой молекулы с небольшой внутренней делецией или новым сайтом рестриктазы. Анализ продуктов ПЦР проводили с применением денситометра PDI, снабженного программным обеспечением Quantity One^R image analysis. Конкурентные ПЦР-анализы проводили в двух или трех повторностях.

Статистический анализ
Для сравнений между группами использовали односторонний t-критерий Стъюдента с методом аппроксимации Уэлча и величину Р<0,05 считали значимой. Все данные выражали в виде среднего ±SEM (стандартная ошибка среднего).

Результаты
Фиг. 10 изображает уменьшение индекса мечения клубочков в получавших ППС мышах (Контроль 0,97±0,17%, ППС 0,64±0,05%, р<0,05).

Гели, показывающие результаты конкурентных ПЦР-анализов с различными типами коллагена, металлопротеиназами, гликопротеинами базальных мембран, факторами роста и белками актина представлены на Фиг.11 и 12.

Фиг. 13 показывает, что мРНК коллагена α₁IV уменьшалась в результате лечения ППС (Контроль 982±106, ППС 738±75, р<0,01) (attomoles на клубочек).

Фиг.14 показывает, что мРНК ламинина В₁ уменьшалась в результате лечения ППС (Контроль 1403±453, ППС 861,5±18,3, р=0,05) (attomoles на клубочек).

Фиг. 15 показывает, что мРНК PDGF-B уменьшалась в результате лечения ППС (Контроль 53,97±17,21, ППС 28,9±9,4, р<0,04).

Фиг. 16 показывает, что мРНК TGF-β снижалась в результате лечения РРС (Контроль 181±35,7, ППС 102,85±21,61, р<0,05) (attomoles на клубочек).

Уровни β-актина были по существу стабильны в получавших ППС мышах, подтверждая, что уменьшение в других факторах не было результатом сниженной пролиферации клеток.

Предшествующие данные, полученные при помощи научно-надежных экспериментальных способов, демонстрируют эффективность ППС в снижении синтеза избыточного коллагена экстрацеллюлярного матрикса и некоторых клеточных факторов роста и в одновременном увеличении активности разрушающих коллаген ферментов. Эти эффекты указывают на то, что ППС должен быть высокоэффективным в клинической терапии и обратном развитии ХПСЗ, характеризующегося рубцеванием.

Таким образом, показано, что обеспечены способы и композиции, которые позволяют достичь различных целей данного изобретения и которые хорошо приспособлены для удовлетворения условий практического применения.

Поскольку различные возможные варианты воплощения могут быть созданы на основании описанного изобретения и поскольку различные изменения могут быть введены в варианты, представленные выше, должно быть понятно, что все вопросы, описанные здесь, должны интерпретироваться как иллюстративные, а не в ограничивающем смысле.

То, что заявлено как новое и должно быть защищено патентной грамотой, изложено в следующей далее формуле изобретения.

Предложен новый способ индукции рассасывания образовавшихся рубцов или фиброзных образований в кровеносных сосудах или в сосудистой сети млекопитающего (человека) при лечении хронического прогрессирующего заболевания, характеризующегося рубцеванием сосуда или фиброзом сосудистой сети, путем введения больному фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество пентозанполисульфата или его соли. Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения. 12 з.п. ф-лы, 20 ил.

1. Способ индукции рассасывания образовавшихся рубцов или фиброзных образований в кровеносных сосудах или в сосудистой сети млекопитающего, включая человека, при лечении хронического прогрессирующего заболевания, характеризующегося рубцеванием сосуда или фиброзом сосудистой сети, отличающийся тем, что больному вводят фармацевтическую композицию, содержащую эффективное для лечения сосудистого заболевания количество пентозанполисульфата или его фармацевтически приемлемой соли. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что хроническим прогрессирующим заболеванием является: хроническое прогрессирующее заболевание почечных клубочков; прогрессирующая почечная недостаточность после трансплантации почек; окклюзия шунтов, применяемых для обеспечения доступа к сосудам больных с конечной стадией почечного заболевания, которые лечат посредством диализа; хронические заболевания малых кровеносных сосудов; рецидив стеноза у больных, которые были подвергнуты коронарному шунтированию; диабетическая ретинопатия. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что больному человеку вводят достаточное количество фармацевтической композиции для обеспечения общей суточной дозы пентозанполисульфата от 50 до 1200 мг. 4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанная суточная доза находится в пределах от 100 до 600 мг. 5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанную суточную дозу вводят в виде одной-четырех поровну разделенных доз. 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная фармацевтическая композиция вводится перорально в дозированной форме. 7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанная дозированная форма выбирается из группы, состоящей из общепринятых таблеток или таблеток с отсроченным освобождением, таблеток с оболочкой, капсул, каплет, лепешек, жидкостей и эликсиров. 8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанная дозированная форма включает, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый инертный ингредиент. 9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанный инертный ингредиент представляет собой наполнитель, связующий агент, растворитель, заполнитель или носитель. 10. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанная дозированная форма содержит от 50 до 300 мг пентозанполисульфата или его приемлемой соли. 11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная фармацевтически приемлемая соль является солью натрия. 12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанная композиция вводится в форме желатиновой капсулы, содержащей натриевую соль пентозанполисульфата, микрокристаллическую целлюлозу и стеарат магния. 13. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанное хроническое прогрессирующее заболевание почечных клубочков представляет собой индуцированный диабетом гломерулосклероз.